TECNICA DE MICROCULTIVO DE HONGOS.

LOS MICROCULTIVOS

FUNDAMENTO: Procedimiento que permite la observacin e identificacin de las estructuras

microscpicas de hongos filamentosos que se distinguen con facilidad sin distorsin, alteracin o
rompimiento de las mismas. Esto pasa cuando el hongo se desarrolla directamente bajo el
portaobjetos.

Forma parte de las pruebas para identificar el gnero y la especie de los hongos, permiten hacer el
seguimiento del desarrollo de los mismos. Los cultivos en placa se obtienen sembrando por
picadura el centro de las cajas que contienen diferentes medios.

TINCIN DE AZUL DE LACTOFENOL

Es una tincin simple (un slo colorante) y como tal est basada en la afinidad del colorante por
componentes de las clulas, en este caso por las estructuras fngicas. El azul de lacto fenol tiene
tres caractersticas que lo hacen especial para observar dichas estructuras en los hongos del tipo
moho obtenidos en los cultivos por aislamiento.

El fenol destruye la flora acompaante (en los cultivos, pueden crecer colonias de bacterias)
El cido lctico conserva las estructuras fngicas al crear, por decirlo de algn modo, una pelcula
que las protege provocado por un cambio de gradiente osmtico entre el interior y el exterior de
dicha estructura.
El azul de algodn tiene la capacidad de adherirse a las hifas y conidios de los hongos
microscpicos

TINCION CON ROJO CONGO.

Realice una preparacin temporal de hongos, usando lacto fenol en lugar de agua para colocar el
micelio. Coloque el cubreobjetos y por un extremo agregue una gota de rojo Congo*, permita que se
difunda y observe al microscopio. Esta tcnica se puede seguir, sustituyendo colorantes.

Sirve, sobretodo, como indicador del pH, es decir, de indicador de la acidez de un medio. En su
forma bsica el rojo Congo es rojo. Cuando el pH est comprendido entre 3.0 y 5.2 se vuelve rosa.
En presencia de una acidez superior este indicador se vuelve azul
 Bibliografa 1. Barne, H., and Hunter, B. B. 1987. Illustrated genera of imperfect fungi.
MacMillan Publishing Company. 218 pp. QK 625 D1 B3

METODO/TINCION. UTILIZACION. COMENTARIOS.

Rpido (1/2 min); detecta quitina de pared fngica por

deteccin de todos los hongos, fluorescencia brillante. Empleada en combinacin con
Blanco calcofluor entre ellos Pneumocystis jiroveci KOH. Precisa de un microscopio de fluorescencia con
(carinii) filtros adecuados. La fluorescencia de fondo puede
dificultar el estudio de algunas muestras.

Examen de medula sea, frotis de

detecta formas intracelulares de Histoplasma
sangre perifrica, preparaciones
Tincin de Gimsa capsulatum y formas tanto intraquistica como troficas
hiticas touch, y muestras
de P. jiroveci (carinii).
respiratorias.

Se realiza con frecuencia en las muestras clnicas. Tie la

mayor parte de las levaduras y las hifas presentes en las
mismas. Casi todos los hongos son Gram positivos,
Tincin de Gram Deteccin de bacterias y hongos
aunque algunos muestran un patrn moteado o
aparecen como Gram negativos, como Cryptoccus
neoformans.

tincin ms adecuada para mostrar la reaccin en el

tejido infectado. Tie casi todos los hongos, aunque
Hematoxilina. Tincin histolgica con fines puede resultar complicado diferenciar del fondo la
Eosina. generales. presencia de un numero bajo de microorganismos. Es
til para revelar el pigmento natural de los
dermatiaceos.

tincin ms adecuada para detectar hongos. Tie las

Metanamina deteccin de hongos en cortes
hifas y las levaduras adoptan una coloracin negra
argentica de histolgicos y quistes de P.jirovecci
frente a un trasfondo verde. Suele realizarse en el
Gomori (carinii) en muestras respiratorias
laboratorio de anatomopatologia.

resulta til para mostrar la presencia de material

tincin anatomopatologica de capsular de Cryptococcus neoformans. Tambin puede
Murcicarmina
mucina teir las paredes celulares de Blastomyces dermatitidis y
Rhinosporidium sieberi.

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 tie tanto levaduras como hifas en los tejidos. Los
cido peryodico de
tincin histolgica de hongos artefactos positivos para esta tincin pueden remedar
Schiff (PAS)
clulas de levadura.

Adaptado de Pfaller MA, McGinnis MR: The laboratory and clinical mycology. In Anaissie EJ, McGinnis MR,
Pfaller MA: Clinical Mycology, New York, 2003, Churchill Livingstone.

TECNICA Y FUNDAMENTO.

De las pruebas fisiolgicas y bioqumicas se han derivado los ensayos de asimilacin (auxonograma
- degradacin aerobia) y fermentacin (zimograma - degradacin anaerobia) de carbohidratos para la
identificacin de levaduras.

AUXONOGRAMA CONVENCIONAL

Se fundamenta en la aplicacin por separado de diferentes nutrientes, hidrocarbonados o

nitrogenados, sobre un medio sinttico base para apreciar el crecimiento selectivo de una levadura
en la cercana de los nutrientes necesarios para su desarrollo.

Para su realizacin pueden emplearse soluciones acuosas esterilizadas por filtracin, cilindros de
Oxford en pocillos hechos en el agar o bien discos de papel absorbente empapados con el nutriente.
Sin embargo, las pruebas de asimilacin en medios lquidos no ofrecen ninguna ventaja adicional
sobre los medios slidos, resultando mucho ms laboriosas y costosas.

Medios de cultivo base.

Se prepararan segn la tcnica habitual y no necesitan ajustar el pH. Se expenden deshidratados

como medios base de levaduras. Los ms utilizados son los siguientes:

1. Medio sin carbono. Sulfato amnico (5 g/l), Fosfato mono potsico (1 g/l), Sulfato de magnesio
(0,5 g/l), Agar (20 g/l).

2. Medio sin nitrgeno. Glucosa (20 g/l), Fosfato mono potsico (1 g/l), Sulfato de magnesio (0,5 g/l),
Agar (20 g/l). Como fuente de carbono se puede ensayar todos los azcares y alcoholes conocidos.
Como substrato de nitrgeno se suele emplear peptona, asparagina, urea, sulfato amnico, nitrato
de potasio y aminocidos diversos.

Como fuente de carbono se pueden emplear todos los azcares y alcoholes. Como sustrato
nitrogenado se puede usar peptona, asparagina, rea, sulfato de amonio, nitrato de potasio y
aminocidos diversos.

Procedimiento

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1. La levadura en estudio se siembra previamente en caldo glucosado de Sabouraud ms
cloranfenicol a 28 C durante 48 h.

2. Agitar para mezclar el cultivo y tomar 1 ml como inculo del medio sinttico fundido. Enfriar a 50
C, mezclar y verter en placa.

3. Preparar las soluciones estriles de los nutrientes, los azcares al 10% y las sustancias
nitrogenadas al 1%. 4. Una vez solidificado el agar, y con la ayuda de un tubo de cristal, agujerear 5-
6 pocillos por placa. Sobre cada pocillo se vierten dos gotas de los distintos nutrientes en estudio.

4. bisSi se utilizan discos de papel absorbente,

deben confeccionarse de distintos colores o
rotularse previamente. Una vez esterilizados, y
antes de su empleo, se empapan con dos
gotas de las soluciones acuosas de los
nutrientes (al 20% para los azcares y al 2%
para los substratos nitrogenados). Se secan en
estufa y se aplican sobre el medio con pinzas
estriles.

5. Incubar a 28 C. (2-4 das).

Interpretacin

En la zona circulante a los pocillos o los

discos, crecen abundantes colonias de
levaduras si utilizan el nutriente
correspondiente; por el contrario, no aparecen
en los contornos de los no utilizados.

La intensidad del cultivo perifrico se expresa mediante cruces: 5 mm de radio (+), 5-10 mm (++),
>10 mm (+++).

ZIMOGRAMA

Es un mtodo que permite determinar en un gel de acrilamida nativo (sin desnaturalizar) cul de las
protenas presentes en la muestra es la que tiene una actividad enzimtica especifica; eso requiere
utilizar sustratos especficos para la enzima en cuestin.

Una vez efectuada la separacin de las protenas que componen una muestra compleja, sta se
pone en contacto con el sustrato, permitiendo que se lleve a cabo la reaccin. Para visualizar la
banda que est produciendo la reaccin se utiliza un colorante como indicador, el cual puede estar
basado en el cambio de pH producido por el metabolito de la reaccin que la enzima est realizado,
o bien puede llegar a producirse como metabolito una molcula que tenga color propio.

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Las lipasas son enzimas triacilglicerol acilhidrolasas (EC 3.1.1.3) que son capaces de hidrolizar los
triglicridos, generando como metabolitos los cidos grasos libres y la molcula del glicerol.
Utilizando el cambio de pH en la zona de reaccin, se pueden observar las zonas que corresponden
a la banda que tiene la actividad enzimtica.

Procedimiento

1. Elaborar dos geles no desnaturalizantes, para lo cual se preparan los geles de poliacrilamida al 12
% y se sustituye el SDS por agua destilada.

2. Se elaboran dos geles idnticos, uno se teir con azul de Coomassie (como se ha trabajado
previamente en las prcticas anteriores) y el otro se utilizar para realizar el zimograma.

3. Las muestras se preparan sin adicin de SDS ni agente reductor (DTT o -mercaptoetanol), es
decir, sin el buffer desnaturalizante.

4. La corrida electrofortica se hace con un buffer de migracin que no debe contener SDS.

5. La migracin se lleva a cabo a 80 V durante 3 horas o hasta el momento en que el frente de

corrida emerja del gel. Durante la migracin se recomienda mantener la cmara de electroforesis
fra, para lo cual puede colocarse dentro del refrigerador o bien dentro de un recipiente con hielo.
Esto, con el fin de evitar un aumento en la temperatura que pueda ocasionar una desnaturalizacin o
modificacin en la estructura de las enzimas.

6. Una vez finalizada la electroforesis, los geles debern desmontarse y colocarse de manera
individual en recipientes; en el gel que ser teido con azul de Coomassie se sigue la tcnica de la
prctica anterior y el otro gel se coloca con agua destilada, mantenindolo en agitacin por 1 hora a
temperatura ambiente y haciendo cambios de agua cada 20 minutos.

7. Para la bsqueda de actividad lipasa, se prepara una solucin de tributirina (TC4) 0.25 % p/v y
rojo de fenol 0.01 % p/v en MOPS 2.5 mM, pH 6.8 y 0.15 % de NLS (N-laurilsarcosina). El pH se
ajusta a 6.8 para tener una mejor definicin del color. Para una homogeneizacin total de la solucin,
utilizar el vrtex.

8. Despus de ser lavado con agua destilada, el gel para el zimograma se sumerge en la solucin
con el sustrato y el colorante hasta que se observen bandas de color amarillo, que sern indicativas
de actividad lipasa.

9. Colocar el gel en el transilumidor de luz blanca y tomar una fotografa con el foto documentador.

10.Hacer una comparacin de los 2 geles, en el gel teido con azul de Coomassie se observarn
todas las protenas que componen la muestra, mientras que en el gel del zimograma se observarn
slo las bandas que posean actividad lipasa.

5|Page
VILATA CORELL, J. (2006). Micosis cutneas. [online] Google Books. Available at:
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hMIgvXcrbiHyQIVUsBjCh1YtAgu#v=onepage&q&f=true [Accessed 11 Nov. 2015]. P.118

6|Page
 ESTRUCTURA MICROSCOPICA Y COLONIAL.

Morfologa colonial: Los mohos unicelulares, tienen colonias semejantes a las bacterias, el dimetro
oscila entre 2-4 mm, de color blanco, crema, amarillo, rojo, etc. cncavas de aspecto brillante o mate,
opacas, de bordes lisos.

Morfologa colonial: Los mohos filamentosos (mohos), tienen colonias de 2-3 cm de dimetro, de
color olivo, verde claro, grises, blancas, rojas, amarillas, etc. con aspecto polvoso, rugoso, terroso,
aterciopelado, algodonoso, generalmente mates, opacas de bordes irregulares.

Morfologa microscpica: La morfologa microscpica se observa con la ayuda del microscopio a

seco fuerte mediante la realizacin del micro cultiv, observndose las siguientes estructuras:

DERMATOFITOS.

Complejo de entidades causadas por algunos hongos filamentosos relacionados desde el punto de
vista taxonmicos que pertenecen a los gneros:

A. Trichosporon.
B. Epydermophyton.
C. Microsporum.

Patrn de crecimiento en cultivo:

IN VITRO CABELLO IN VIVO.

FLUORESCENCIA en lmpara de
GENERO MACROCONIDIAS. MICROCONIDIAS. INVASION Wood.
No
Epidermophyton Pared lisa, reunidas en Ausentes No aplicable.
grupos de dos o tres. aplicable
Abundantes, grafologa
macroscpica: en
Microsporum Infrecuentes Ectotrica (M.gypseum no emite fluorescencia)
tamao, pared gruesa y
rugosa.
Abundantes,
Trichophyton Infrecuentes, lisas, Endotrica (T. schoenlinii emite fluorescencia)
esfricas, piriformes.
pared delgada.

Tipo de Infeccin.
Zoonoticas: Tia del Tia Tia Tia de Onicomicosis
Principal anfitrin. pie corporal inguinal la barba
Epidermophyton flocosum x x x
Microsporum canis gato, perro y caballo. x x
Microsporum gypseum
Trichophyton tonsurans x x x
Trichophyton mentagrophytes roedores. x x x x

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Trichophyton mentagrophytes.

Morfologa macroscpica: La variedad granulosa desarrolla

colonias de crecimiento rpido en un plazo de 8 a 10 das, planas,
de color crema o amarillentas, de aspecto pulverulento y con
anillos concntricos. Se observa un color marrn claro en el
reverso, aunque algunas cepas presentan un color rojo y oscuro.
La variedad interdigitales desarrolla colonias planas y blancas,
que con el tiempo se tornan amarillentas, pudiendo ser el reverso
amarillento o marrn. Tienen un aspecto densamente velloso o
algodonoso.

Morfologa microscpica. Se observan hifas sentadas, con

formaciones en espiral, pequeos micro conidios esfricos de 2 a
3 mn.de uvas.los macroconidios tienen forma de lpiz de 3 a 6
septos. En la variedad granulosum los microconidios y las hifas en
espiral son abundantes y los macroconideos de 40 a 60 mn tienen de cuatro a seis septos y sus
escasos.

Trichophyton tonsurans.

Morfologa macroscpica: inicialmente y con mayor frecuencia se

desarrolla una colonia plana, poco purulenta, de color amarillo en
la superficie y con un color rojo caoba en el reverso.
Posteriormente se vuelve plegada, de superficie con un color
crema grisceo o marrn, y al reverso la colonia desarrolla un
pigmento ocrerojizo oscuro que difunde al medio. Algunas cepas
son menos purulentas y presentan una colonia de color blanco,
amarillo plido o intenso.

Morfologa microscpica: se observan microconidios,

generalmente abundantes y de tamao variable, en forma de
mazo, de lagrima o forma irregular, con paredes gruesas, que
nacen de hifas ramificadas o terminales y que se nacen de hifas ramificadas o terminales y que se
disponen en algn recto con respecto a estas. Tienen tendencia a
aumentar de tamao, dando lugar a estructuras en forma de clava
o de baln.

Microsporum canis.

Morfologa macroscpica: la colonia es de rpido crecimiento, con

tendencia a ser plana. Blanca o amarillenta, tosca vellosa o
algodonosa, disperso, con bordes radiales y con un color amarillo
intenso o anaranjado al reverso.

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Morfologa microscpica: se encuentran macro conidios en abundancia, largos, en forma de huso, de
paredes gruesas, con una prominencia asimtrica apical en donde es ms evidente la superficie
rugosa (espculas) de estas estructuras, y casi siempre con ms de seis compartimentos. Hay
escasos micro conidios piriformes o en forma de clava, no diagnsticos de la especie. Tambin
pueden obser varse hifas en raqueta, cuerpos pectrinados y clamidocondios.

Microsporum gypseum.

Morfologa macroscpica: la colonia es de rpido

crecimiento, plana, pulverulenta, con aspecto y textura de
piel de ante, de color canela y algunas veces con tonos de
color violeta. El reverso puede presentar o no pigmento de
color variable.

Morfologa microscpica: se observan macroconidios en

abundancia, simtricos, elipsoidales, de superficie rugosa
o equinulada, de paredes relativamente delgadas, de
cuatro a siete compompartimento y agrupados en racimos.
Pueden encontrarse microconidios en forma de mazo, pero
no son diagnstico.

Epidermophyton floccosum.

morfologia microscopica: Hongo filamentoso que forma abundantes macroconidios (de 20-40 mn x 6-12 mn) en
forma de maza dispuestos en racimos, con una pared gruesa y lisa, con extremos romos, que presentan de dos a
cuatro septos. los macroconidios se asientan sobre el conidioforo por un pequeo pediculo. microconidios
ausentes. hifas en raqueta y clamidosporas en cultivos viejos.

morfologia colonial: colonias visibles a los 7 - 9 dias, como un mechon de hifas amarillentas (colonias de 2-3 cm de
diametro a los 20 dias), con aspecto aterciopelado, finalmente pulvurulento, planas, con centro umbilicado del que
parten surcos radiales y color de verde amarillento a verde oliva. la zona marginal termina en una corona radial
blanca. el reverso es amarillento con un centro naranja o amarillo parduzco. las colonias se blanquean rapidamente
y se vuelven flocosas y esteriles.

9|Page
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