FIJACIN

Introduccin.- Antes de entrar en los detalles ms significativos sobre los

distintos mtodos que existen para la fijacin de tejidos vegetales, es necesario
resaltar que los mtodos ms sencillos y ms prcticos son los que no necesitan
fijacin, pero no siempre son posibles, ya que con frecuencia las muestras se
encuentran alejadas del laboratorio, la capacidad de trabajo tambin es limitada y
por tanto hay que recurrir a los mtodos de fijacin con mayor frecuencia de lo
que sera deseable.

Examen en freco.- Este mtodo tiene la ventaja de una gran simplicidad y por
otra parte no produce alteracin alguna en las muestras; en histologa animal se
presentan grandes inconvenientes para su uso, puesto que slo pueden utilizarse,
bien para organismos vivos de pequeo tamao o bien para piezas sumergidas
durante un tiempo limitado en lquidos fisiolgicos (solucin de Ringer, solucin
de Locke, solucin de Tyrode, etc.). Los vegetales presentan ventajas sobre los
animales, ya que se pueden fcilmente cultivar en el laboratorio o bien llevarlos
desde le campo al mismo sin que los procesos de lisis se presenten con la rapidez
que ocurren en los tejidos animales.

An teniendo estas ventajas sobre los tejidos animales, con mucha frecuencia
debe recurrirse en histologa vegetal al uso de fijadores, bine porque las muestras
se recojan lejos del laboratorio durante campaas botnicas ms o menos amplias
o porque los trabajos se prolonguen excesivamente debido a largos tratamientos,
por lo que es necesario recurrir a la fijacin de las muestras a estudiar.

Tambin queremos llamar la atencin sobre las tcnicas de fijacin que se van a
emplear y describir, ya que se refieren nicamente a tcnicas para microscopa
ptica, obviando las de microscopa electrnica, tanto de barrido como de
transmisin.

Concepto de fijacin.- Se entiende por fijacin toda manipulacin sobre un ser

vivo, o bien sobre parte de l, que tiene por objeto mantener toda su arquitectura
tanto estructural como qumica lo ms inalterada posible, de tal forma que sus
componentes celulares mantengan las mismas caractersticas que cuando dicho
ser o tejido estaban vivos. es claro que la mayora de la estructura celular se debe
a la presencia de protenas y por tanto todo proceso de fijacin debe tener en
cuenta la naturaleza qumica de stas, de forma que el fijador no reacciona con
las mismas. Es cierto que existen componentes muy distintos ms o menos
lbiles que tambin se encuentran formando parte de la estructura celular, pero
son las protenas las que nos van a reflejar fundamentalmente si un fijador es
bueno o no bueno. Por otra parte, un fijador prepara tambin de alguna forma el
tejido o la clula para la posterior manipulacin, bien en el proceso de inclusin,
actuando como mordiente o como fijador del colorante dependiendo de su
naturaleza, por eso es importante la eleccin del fijador.

Hay razones por las que los tejidos vegetales no deben fijarse como los animales.
Muchas veces las plantas estn cubiertas de sustancias creas en sus cutculas que
son hidrfobas e impiden la penetracin del fijador. Por otra parte el bajo
contenido proteico de las clulas vegetales, en comparacin con ls animales,
vuelve al glutaraldehido (un componente de un fijador que se tratar ms
adelante), menos efectivo en sus enlaces curzados con la protena. As mismo la
pared de las clulas vegetales supone una barrera parcial a la penetracin del
mismo.

Por otra parte hay que distinguir bien entre fijador y conservador, ya que con
frecuencia, y sobre todo en histologa vegetal, se tienen conceptos errneos al
respecto. Un conservador es aquella sustancia, o bien fenmeno fsico, que evita
la autolisis cadavrica, pero que una vez eliminada su accion, la muestra o la
clula, quedan a merced de sus propios enzimas lisgenos y son por tanto
susceptible de autodestruccin. son conservadores: fro, ciertos lquidos como los
de Petit, de Ripert, etc. As pues, una pieza que se ha mantenido durante un
tiempo en un conservador debe ser fijada rpidamente antes de cualquier
manipulacin, ya que de no hacerse corre el peligro de que sufra graves
alteraciones. un fijador por el contrario inmoviliza y estabiliza los elementos
celulares, bien sea por precipitacin de las protenas y dems sustancias celulares
activas, ya sea mediante un bloqueo qumico de su actividad, siendo estos
fenmenos permanentes.

En resumen, un fijador tiene como misin:

* Evitar la autolisis debida a los propios enzimas.

* Proteger el corte o la pieza del ataque bacteriano.

* Insolubilizar los componentes celulares que se desean estudiar.

* Preparar a las distintas estructuras para posteriores tratamientos.

* Evitar la disolucin de determinados compuestos en el fijador.

* Conservar o provocar determinadas reacciones qumicas.

* Mantener las propiedades fsicas.

Para la eleccin de un fijador, hay que tener en cuenta, adems de lo sealado

anteriormente, unas caractersticas que son intrnsecas al mismo, como son la
velocidad de penetracin, la velocidad de fijacin y el coeficiente de
endurecimiento, as como el efecto de la retraccin. Estos factores son de gran
importancia a la hora de elegir un fijador; sobre todo, en histologa vegetal. Es
muy importante el coeficiente de endurecimiento y el efecto de retraccin, ya que
de por s los tejidos vegetales son frecuentemente duros y estos dos fenmenos
contribuyen a una mayor elasticidad de los tejidos, con el consiguiente posible
perjuicio a la hora de manipularlos para obtener los cortes. Menor importancia
tiene quizs el poder de penetracin y la velocidad de fijacin, ya que como se ha
indicado anteriormente los procesos de lisis en los tejidos vegetales son ms
lentos en trminos generales que en los tejidos animales; en cuanto a la velocidad
de penetracin y de fijacin, son muy distintas, ya que un fijador puede tener una
gran velocidad de fijacin y un bajo poder o velocidad de penetracin o
viceversa. Por tanto la eleccin de un fijador es un problema de suma
importancia en histologa vegetal. un fijador ideal sera aquel que tuviera una
gran velocidad de penetracin y fijacin y unos coeficientes de retraccin y
endurecimiento lo ms bajos posibles.

Los fijadores que se usan para el tratamiento de los tejidos vegetales son
prcticamente los mismos que se utilizan en histologa animal; las clulas
vegetales presenta, sobre todo en la pared celular, una estructura celulsica o bien
una impregnacin o sustitucin de estas por compuestos distintos como la
lignina, suberina, etc., que diferencia totalmente a los vegetales de los animales.
El comportamiento de los fijadores, al menos a niveles muy distintos; si a ello le
unimos que los estudios de los efectos sobre las estructuras celulares vegetales
son prcticamente nulos, nos encontramos con un problema serio a la hora de
elegir un fijador. En histologa animal se saben que la mayora de los efectos de
retraccin, endurecimiento, etc., que presentan cada uno de los fijadores
utilizados, cosa que no se conocen cuando de tejidos vegetales se trata.
Unicamente la experiencia y los ligeros conocimientos de qumica permiten al
histlogo vegetal poder elegir un fijador que le ofrezca ciertas garantas;
desgraciadamente, estos conocimientos no estn reflejados en los textos de
tcnicas histolgicas ni en los de histologa vegetal. Por ello trataremos de ir
incorporando a medida que avancen nuestros estudios y el acceso a la
informacin las tcnicas particulares de las que nos hagamos eco.
Vamos a dar un listado de los fijadores ms frecuentes y a discutir bervemente
sus distintas caractersticas. Los fijadores se pueden clasificar en dos grupos:
fijadores fsicos y fijadores qumicos.

Fijadores fsicos.- Son varios los fijadores fsicos que usualmente se utilizan en
histologa, sobre todo por su simplicidad, pero la mayora de ellos debemos
desecharlos, porque alteran gravemente la estrucutra de los vegetales.

El calor: Es el ms antiguo y ms utilizado de estos fijadores. Tanto en

microbiologa, como en el frotis de clulas animales, la fijacin se hace a la
llama, con lo que se obtiene una coagulacin rpida de las protenas y por tanto
su estabilizacin. Esta tcnica no es recomendable cuando se trata de tejidos
vegetales, puesto que produce alteraciones importantes y muy desiguales en las
paredes celulares.

El fro: Como anteriormente hemos mencionado, el fro (congelacin), se ha

tenido y se tiene como agente de fijacin, pero es realmente un agente
conservador y por tanto no debe utilizarse como tal.

La criodesecacin (liofilizacin): Se trata de congelar a una temperatura inferior

a -50C y eliminar el agua a una presin baja. este mtodo puede ser muy
efectivo, si despus la pieza se incluye en parafina o en plstico, pero es bastante
complejo y excesivamente caro; no produce deformaciones ni retracciones, ni
tampoco endurecimiento de las muestras. Su inconveniente es el precio y lo
engorroso que puede resultar el que, al manipular la muestra, no se rehidrate
posteriormente.

Fijadores qumicos.- Existen numerosos fijadores qumicos, unos simples, y

otros que son mezcla de varias sustancias. los ms reseados en la bibliografa
son:

Acetato mercrico

La fijacin se hace en recipientes con la muestra y el fijador poniendo cantidades

muy superiores de fijador frente al volumen de la muestra y se deja un tiempo de
infiltracin. Este proceso debe realizarse lo ms pronto que se pueda despus de
la recoleccin de material.
Ciertos tejidos requiren infiltracin a vaco para facilitar la penetracin del
fijador. Si el tejido flota, se requiere infirltracin a vaco. Tejidos con espacios
areos son los ms difciles de fijar, ya que el aire impedir la entrada del fijador.
Las hojas (especialmente el aernquima), Meristemos del tallo, y rganos
hirsutos son notablemente difciles y necesitarn ciertamente infiltracin a vaco.

Una bomba de vaco de aceite conectada a una campana o desecador permite un

vaco ms fuerte que el tpico vaciador. Tener cuidado de no generar un vaco
demasiado fuerte, puede hacer que el fijador llege a hervir y daar el tejido.
Poner el vial destapado en el desecador y haz ciclos que crezcan poco a poco en
vaco. Como el aire residual es empujado del tejido, llegar a la superfiice. Una
vez completado el proceso las muestras debern hundirse. contina los ciclos de
vaco slo hasta que las muestras de tejido se hundan. Es mejor usar vacos
dbiles y prolongado en el tiempo que al revs, para no daar los tejidos.