Manual de Laboratorio de Biología para Ingenieros

MANUAL DE LABORATORIO DE BIOLOGA PARA INGENIEROS
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA
BIOLOGA PARA INGENIEROS
MEDELLN
2017
Facultad de Ingeniera
Departamento de Ingeniera Qumica
LABORATORIO DE BIOLOGA PARA INGENIEROS
NDICE
1. Normas generales y de bioseguridad en el laboratorio.
2. Identificacin de matrices con presencia de macromolculas.
3. Manejo de materiales y equipos de laboratorio.
4. Determinacin de aminocidos y protenas.
5. Actividad cataltica de la -amilasa y variables que la afectan.
6. Determinacin de algunas propiedades y aplicaciones industriales del almidn.
7. Transesterificacin para produccin de biodiesel.
8. Aislamiento de microorganismos con aplicaciones en la ingeniera qumica
9. Caracterizacin macro y microscpica de los microorganismos
10. Preparacin de medios de cultivo especficos
11. Determinacin de cintica de crecimiento y capacidad metablica de

microorganismos
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1. INTRODUCCIN AL LABORATORIO E IDENTIFICACIN DE

MATRICES CON PRESENCIA DE MACROMOLCULAS.
NORMAS GENERALES EN EL LABORATORIO
a. Llegar puntualmente. Todas las prcticas estn programadas para ser realizadas en el
tiempo previsto.
b. Llevar las gua de la prctica a realizar, esta debe ser leda con anticipacin.
c. Tenga en cuenta las instrucciones dadas en cada sesin. El profesor puede preguntar
cualquier informacin que est contenida en ellas.
d. No es permitido el uso de radios, walkman, celulares o equipos puedan interrumpir el
desarrollo de la prctica.
e. Es prudente usar pantaln largo y evitar las faldas y pantalonetas.
f. Usar zapatos cerrados adelante, evitar sandalias o calzado similar.
g. No es permitido el ingreso al laboratorio de personas diferentes a los matriculados en el
curso.
h. Desarrollar las actividades con calma, tome el tiempo necesario para hacer los distintos
procedimientos para que los resultados sean buenos.
i. Analice los resultados obtenidos durante la prctica. Confe en sus propias
observaciones.
j. Est prohibido fumar dentro del laboratorio.
k. Utilcelos reactivos adecuados en cantidades y concentraciones indicadas. No
desperdicie el material.
l. El material de trabajo es propiedad dela universidad y debe ser devuelto en buenas
condiciones y limpios. Usted es responsable y debe reponer y pagar todo el material que
sea daado o extraviado.
m. La limpieza, el cuidado al trabajar, el empleo correcto de las tcnicas enseadas y el
inters son factores que contribuyen al xito de la prctica.
n. No emplee material sucio o contaminado para extraer reactivos de los recipientes.
o. No se retire del laboratorio sin justificacin.
p. Dejar los puestos de trabajo limpios despus de terminar la prctica.
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NORMAS DE BIOSEGURIDAD
La bioseguridad, se define como el conjunto de medidas preventivas, destinadas a

mantener el control de factores de riesgo en el laboratorio procedentes de agentes
biolgicos, fsicos o qumicos, logrando la prevencin de impactos nocivos, asegurando
que el desarrollo o producto final de dichos procedimientos no atenten contra la salud y
seguridad de estudiantes, docentes, monitores y el medio ambiente (Forero de Saade,
1997).
a. Evitar contacto de piel o mucosas con lquidos.

b. Lavado de manos al inicio de la sesin y al finalizar la misma para remover todo tipo de
contaminante qumico y/o biolgico.
c. Usar guantes si es necesario o se sugiere por el instructor
d. Usar la mascarilla si se recomienda.
e. Usar la bata cerrada durante toda la prctica para evitar contacto de la ropa con los
reactivos y microorganismos usados durante la sesin.
f. No es permitido el consumo de alimentos (chicles, bebidas, frutas, entre otros) durante el
desarrollo de la prctica.
g. El cabello debe estar recogido.
h. No usar gorros que no sean apropiados para la prctica.
i. Si hay derrame de alguna sustancia qumica, el sitio debe ser limpiado inmediatamente,
para evitar que de forma accidental otra persona pueda tocarla.
j. Si alguna sustancia qumica entra en contacto con la piel, ojos, lavar Con agua durante
unos minutos. Nota: En caso de accidentes consulte con el instructor o docente
encargado.
k. Tenga un uso adecuado de los residuos generados durante la prctica. Si tiene dudas
pregunte al docente o al monitor encargado.
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2. IDENTIFICACIN DE MATRICES CON PRESENCIA DE

MACROMOLCULAS
OBJETIVO
Identificar cual(es) macromolcula(s) se encuentran en cada una de las matrices mostradas.
PREGUNTAS
I. Qu es una macromolcula?
II. Cules son los tipos de macromolculas?
III. Dnde se pueden encontrar las macromolculas?
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3. MANEJO DE MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO
OBJETIVOS
Conocer y/o familiarizarse con los diferentes equipos de laboratorio, a travs del
desarrollo de actividades que involucren manejo de material de vidriera (probetas,
erlenmeyers, pipetas, etc.) y equipos de laboratorio (balanzas analticas, pH metro,
espectrofotmetro, micropipetas, filtros).
Realizar la medicin de biomasa por medio de las tcnicas de peso seco y turbidimetra
(absorbancia).
Realizar la determinacin de azcares reductores por el mtodo espectrofotomtrico del
DNS.
MARCO TERICO
Para lograr resultados confiables en el laboratorio, es indispensable conocer tanto el

funcionamiento de los instrumentos y los equipos de laboratorio, como los principios
tericos que los rigen. Durante el desarrollo de esta prctica se construirn dos curvas de
calibracin para las cuales se utilizarn micro pipetas, balones volumtricos, balanzas
analticas, espectrofotmetro, bao mara, entre otros.
A continuacin se describen algunos aspectos generales relacionados con la prctica:
Micropipeta: Es un instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir

pequeos volmenes de lquidos y permitir su manejo en las distintas tcnicas cientficas.
Los volmenes captables por estos instrumentos varan segn el modelo: los ms
habituales, denominados p20, p200 y p1000, admiten un mximo de 20, 200 y 1000 l,
respectivamente. Es de destacar que el uso de micropipetas permite emplear distintos
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lquidos sin tener que lavar el aparato: para ello, se emplean puntas desechables, de
plstico, que habitualmente son estriles. Existen varios tipos de puntas: por ejemplo, las
amarillas para pipetear volmenes pequeos (por ejemplo, 10 l), y las azules para pipetear
volmenes grandes (por ejemplo, 800 l).
Tipos: Existen micropipetas manuales, en las que el volumen a aspirar se fija girando un
botn en su parte superior que est conectado a un sistema analgico de confirmacin de
volumen, y automticas, en las cuales dicho sistema es digital. Hay micropipetas simples,
que slo acogen una punta cada vez, y multicanales, que permiten incorporar mltiples
puntas (por ejemplo, ocho), absorbiendo el mismo volumen en todas ellas.
Operacin del Equipo

a. Se presiona el botn superior suavemente hasta el primer tope.
b. Se sumerge la punta, en la solucin que se necesita pipetear estando seguros que la punta
este bien colocada y que no haya ningn tipo de residuos entre la punta y el cuerpo de la
pipeta.
c. Mantenga la pipeta verticalmente mientras toma la solucin, soltando el botn
suavemente.
d. Para descartar la solucin de la punta presione el botn hasta el segundo tope.
e. Descarte las puntas utilizando el eyector que traen las pipetas, ver figura 3
(Micropipetas).
Figura 6. Micropipeta uso y partes
Espectrofotometra: La espectrofotometra UV-visible es una tcnica analtica que permite

determinar la concentracin de un compuesto en solucin. Se basa en que las molculas
absorben las radiaciones electromagnticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida
depende de forma lineal de la concentracin. Para hacer este tipo de medidas se emplea un
espectrofotmetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por
una solucin y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. Para cuantificar la
absorbancia se puede usarla ley de Lambert-Beer, esta ley expresa la relacin entre
absorbancia de luz monocromtica (de longitud de onda fija) y concentracin de un
cromforo en solucin:

= ( ) =
0
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La absorbancia de una solucin es directamente proporcional a su concentracin, a mayor

nmero de molculas mayor interaccin de la luz con ellas; tambin depende de la distancia
que recorre la luz por la solucin, a igual concentracin, cuanto mayor distancia recorre la
luz por la muestra ms molculas se encontrar; y por ltimo, depende de , una constante
de proporcionalidad, denominada coeficiente de extincin, que es especfica de cada
cromforo. Como A es adimensional, las dimensiones de dependen de las de c y l. La
segunda magnitud (l) se expresa siempre en cm mientras que la primera (c) se hace,
siempre que sea posible, en M, con lo que las dimensiones de resultan ser M-1cm-1. Este
coeficiente as expresado, en trminos de unidades de concentracin molar (o un
submltiplo apropiado), se denomina coeficiente de extincin molar (M). Cuando, por
desconocerse el peso molecular del soluto, la concentracin de la disolucin se expresa en
otras unidades distintas de M, por ejemplo gL-1, las dimensiones de resultan ser
distintas, por ejemplo g-1Lcm-1, y al coeficiente as expresado se denomina coeficiente
de extincin especfico (s). La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas.
La medicin de absorbancia de la luz por las molculas se realiza en espectrofotmetros.
Aunque pueden variar en diseo, en especial con la incorporacin de ordenadores para el
anlisis de datos, todos los espectrofotmetros constan de:
1. Una fuente de energa radiante: lmpara de deuterio y tungsteno.

2. Un monocromador para la seleccin de radiaciones de una determinada longitud de
onda: filtros, prismas, redes de difraccin.
3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos) que
contenga la muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o plstico transparente. Para medir en
UV se deben usar las de cuarzo o slice fundido, porque el vidrio no transmite la
radiacin UV.
4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las seales luminosas en seales
elctricas.
5. Un registrador o sistema de lectura de datos.
Desde el punto de vista operativo, el primer paso es seleccionar la fuente de luz y longitud
de onda a la que se va a realizar la medida. Se mide primero la absorbancia del disolvente
(conocido como blanco) y al que se le asigna el valor de cero mediante el ajuste del mando,
de forma que la intensidad incidente y transmitida sean iguales (Io = It), y por tanto la
absorbancia es cero. A continuacin se pone en la celdilla la cubeta con la muestra y se lee
la absorbancia de sta. (Ver figura 4) (Abril, Brcena, Fernndez, Galvn, Jorrn, Peinado,
Melndez &Tnez).
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Figura 7. Funcionamiento de espectrofotmetro
Turbidimetra: La turbidimetra es un campo analtico relacionado con la colorimetra,

tanto en el aspecto terico como experimental. La turbidimetra determina la cantidad de
luz no dispersada, el fundamento de esta tcnica es la dispersin de la luz por partculas no
transparentes suspendidas en un lquido, como por ejemplo, precipitado y suspensiones
coloidales. Cuando se utiliza esta tcnica con fines cualitativos se suelen construir curvas
de calibrado con muestras de concentraciones conocida. Estas muestras (precipitados o
suspensiones) deben prepararse bajo condiciones rigurosamente controladas ya que la
cantidad de luz dispersada depende no solo de la concentracin sino tambin del tamao y
nmero de partculas implicadas. Para que la luz dispersada pueda utilizarse
comparativamente es necesario que tanto el nmero de partculas como su tamao sean del
mismo orden. Adems, la longitud de onda de luz que es dispersada ms eficazmente
depende tambin del tamao de las partculas. Bajo condiciones controladas, se puede
lograr que el tamao de partcula en la suspensin sea reproducible y en consecuencia que
esta tcnica sea de aplicacin analtica. Las aplicaciones de la turbidimetra son muy
variadas, algunos sistemas son turbios al llegar al laboratorio analtico, como en el anlisis
de los materiales de suspensin en las aguas. En la industria se utiliza en la medicin de la
transparencia de bebidas y productos farmacuticos. (Merino, 1996)
MATERIALES
Micropipeta de 1000L
Micropipeta de 200L
Micropipeta de 100L
Bao termosttico
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Vrtex.
Espectrofotmetro
Bao de hielo
Tubos tapa rosca
Gradillas
Balones volumtricos de 100 ml
Glucosa
DNS
Solucin madre de levadura.
PROCEDIMIENTO
Elaboracin de la curva estndar de glucosa

Preparar una solucin madre de glucosa a 0.5g/L en un baln de 100 ml.
Hacer las siguientes diluciones en tubos de ensayo usando las micropipetas.
Volumen de solucin Volumen de agua

Solucin Concentracin (g/L)
madre (L) destilada (L)
Blanco 0 1000
1 125 875
2 250 750
3 500 500
4 750 250
5 1000 0
Tomar las diluciones preparadas y adicionar a cada una 1000 L de DNS, incluyendo al
blanco.
Tapar cada tubo para evitar prdidas de muestra por evaporacin.
En el caso de no poder trabajar inmediatamente con las soluciones, guardar todos los
tubos en un lugar oscuro para evitar que el DNS comience a reaccionar.
Llevar todas las soluciones al bao termosttico a una temperatura de 80-90C durante 5
minutos.
Pasados los 5 minutos exactos, llevar las soluciones a un bao de hielo durante 5
minutos o hasta el momento que se vaya a realizar las lecturas de las absorbancias.
Leer las absorbancias de las soluciones a 540 nm.
Realizar una curva de calibracin de concentracin de glucosa en g/L versus
absorbancia.
Hacer un ajuste lineal de los datos.
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Cuantificacin de biomasa por el mtodo del peso seco
A partir de la solucin madre de levadura, adicionar los siguientes volmenes en balones

volumtricos aforados de 25 ml
Solucin Volumen de solucin madre (mL)

1 20
2 16
3 12
4 8
5 4
Secar los filtros en estufa por 10 minutos a 90-100 C.

Dejar enfriar.
Pesar en balanza analtica (usar siempre la misma).
Filtrar 15 ml de la solucin preparada.
Llevar a estufa el filtro durante 30 minutos.
Enfriaren desecador.
Pesar nuevamente el filtro.
Determinar la concentracin en g/L.
Tomar una muestra de 1 ml de solucin y depositarla en una celda.
Leer absorbancia en el espectrofotmetro a 600 nm.
Hacer una curva de calibracin de absorbancia versus concentracin de levadura (g/L).
Nota:
Recuerde que las soluciones deben estar homogneas en los momentos de hacer
diluciones y hacer las lecturas de absorbancias.
Los filtros nunca deben ser tocados directamente, use siempre pinzas dispuestas en el
laboratorio.
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4. DETERMINACIN DE AMINOCIDOS Y PROTENAS
OBJETIVO
Reconocer la presencia de algunos aminocidos en las protenas, a travs de reacciones

especficas que permiten su identificacin.
MARCO TERICO
Protenas
Las protenas son los materiales que desempean un mayor nmero de funciones en las
clulas de todos los seres vivos. Por un lado, forman parte de la estructura bsica de los
tejidos (msculos, tendones, piel, uas, etc.) y, por otro, desempean funciones metablicas
y reguladoras (asimilacin de nutrientes, transporte de oxgeno y de grasas en la sangre,
inactivacin de materiales txicos o peligrosos, etc.). Tambin son los elementos que
definen la identidad de cada ser vivo, ya que son la base de la estructura del cdigo
gentico (ADN) y de los sistemas de reconocimiento de organismos extraos en el sistema
inmunitario.
Aminocidos
Son macromolculas orgnicas, constituidas bsicamente por carbono (C), hidrgeno (H),
oxgeno (O) y nitrgeno (N); aunque pueden contener tambin azufre (S) y fsforo (P) y, en
menor proporcin, hierro (Fe), cobre (Cu), magnesio (Mg), yodo (I), entre otros.
Se clasifican, de forma general, en holoprotenas y heteroprotenas segn estn formadas
respectivamente slo por aminocidos o bien por aminocidos ms otras molculas o
elementos adicionales no aminoacdicos (Protenas).
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Reacciones caractersticas de los aminocidos y protenas.
Prueba Biuret: Es una prueba general para protenas, no especifica. Cuando una protena
reacciona con sulfato de cobre (II) (color azul) se forma como respuesta positiva un
complejo color violeta. La prueba Biuret trabaja para cualquier tipo de compuesto que
posea uno o ms de los grupos siguientes:
Prueba de Ninhidrina: Es positiva para aminocidos y protenas que tengan un grupo -

NH2 libre. Cuando el grupo -NH2 reacciona con ninhidrina, se forma un complejo azul-
violeta.
Prueba Xantoprotica: Los anillos fenilo que contengan un grupo activante pueden ser
nitrados produciendo un compuesto amarillo. La produccin de un producto coloreado
amarillo al aadir cido ntrico es una prueba para la presencia de tirosina o triptfano
en una protena. La adicin de base fuerte hace que el color se torne ms oscuro hacia
anaranjado. Las manchas amarillas en la piel causadas por cido ntrico son el resultado
de la reaccin Xantoprotica.
Prueba para metales pesados: Los metales pesados tienen el efecto de precipitar
protenas de sus soluciones creando enlaces (cross-linkings) entre los grupos amino
libres y los grupos carboxilo libres. Los iones ms comnmente usados para detector la
presencia de protenas incluyen Zn 2+, Fe 3+ , Cu 2+ , Sb 3+ , Ag 1+ , Cd 2+ y Pb 2+
Entre los metales, Hg 2+, Cd 2+, y Pb 2+ tienen una alta toxicidad. Estos pueden causar
serios daos a las protenas (especialmente enzimas) desnaturalizndolas. Victimas que
han ingerido iones de mercurio o plomo se tratan con un antdoto de algn alimento rico
en protenas. La protena se combina con los iones de mercurio y plomo minimizando la
absorcin de tales iones. Los alimentos ms usados son leche y clara cruda de huevo. La
protena que se precipita es removida inmediatamente del estmago mediante un lavado
estomacal (Alices. 2009).
Prueba Hopkins Cole: Es especfica del grupo indol caracterstico del Triptfano. El
anillo del indol se hace reaccionar con cido Glioxlico en presencia de cido Sulfrico
concentrado para formar un compuesto violeta que se forma en la interfase entre la
solucin de protena y el cido sulfrico. La reaccin de Hopkins Cole es positiva slo
para las protenas que contienen Triptfano. Se supone que el cido concentrado
hidroliza las protenas en la interfase liberando el Triptfano para dar el producto
violeta. Sin embargo, el Triptfano puro en solucin no da positiva la reaccin, a menos
que se agreguen agentes oxidantes, por lo que es de suponer que el Triptfano de las
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protenas no se libera como tal, por lo cual la reaccin presentada es slo parcialmente
correcta.
Prueba para aminocidos azufrados: Esta reaccin detecta la cistena y metionina y
protenas que la contengan. En medio fuertemente alcalino el radical mercapto de la
cistena metionina se desprenden como cido sulfhdrico que se pone en evidencia
aadiendo sales de plomo para que se forme de un precipitado negro de sulfuro de
plomo (Ordorica & Velzquez. 2012).
Desnaturalizacin: Se llama desnaturalizacin de las protenas a la prdida de las
estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena
polipeptdica reducida a un polmero estadstico sin ninguna estructura tridimensional
fija. La desnaturalizacin provoca diversos efectos en la protena:
Cambios en las propiedades hidrodinmicas de la protena: aumenta la viscosidad y
disminuye el coeficiente de difusin.
Una drstica disminucin de su solubilidad, ya que los residuos hidrofbicos del
interior aparecen en la superficie.
Prdida de las propiedades biolgicas (Desnaturalizacin).
MATERIALES
Leche Hidrxido de sodio al 25%

Harina de trigo Hidrxido de sodio al 50%
Huevo Sulfato de cobre al 1%
Gelatina sin sabor Acetato de plomo al 2%
Tubos de ensayo cido clorhdrico concentrado
Bao termosttico. Etanol
cido ntrico concentrado
PROCEDIMIENTO
Preparar las siguientes soluciones:

Solucin de albmina 30% v/v.
Solucin de harina de trigo 1% v/v.
Solucin de gelatina sin sabor 3%p/v.
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Reaccin Xantoprotica
Tubo Solucin Cantidad (mL)

1 Albmina 2
2 Leche 2
3 Harina de trigo 2
4 Gelatina sin sabor 2
A cada uno de los tubos adicione 5 gotas de cido ntrico concentrado.

Calintelos al bao mara hasta cambio de coloracin.
Alcalinice la mezcla adicionando gota a gota de hidrxido de sodio al 25%.
Observe y anote los resultados.
Prueba de los aminocidos azufrados

1 Albmina 2
2 Leche 2
3 Harina de trigo 2
A cada tubo adicione 3 gotas de hidrxido de sodio al 25%.

Agregue 5 gotas de acetato de plomo al 2%.
Calintelos al bao mara por 10 min.
Prueba de Biuret

1 Albmina 2
2 Leche 2
3 Harina de trigo 2
A cada tubo adicione 5 gotas de hidrxido de sodio al 25%

Adicione 5 gotas de sulfato cprico al 1%.
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Desnaturalizacin
Tubo Solucin Cantidad Procedimiento

Calentar gradualmente y observe
1 Albmina 10 gotas
temperatura de coagulacin
2 Albmina 10 gotas 20 gotas de etanol
3 Albmina 10 gotas 5 gotas de HCl concentrado
4 Albmina 10 gotas 5 gotas de hidrxido de sodio al 50%
Agite los tubos y observe si se produce coagulacin.

Para todas las reacciones anteriores, reporte los datos y observaciones en la siguiente tabla:
Reaccin Leche Albmina Harina
Xantoprotica
Aminocido azufrados
Biuret
Desnaturalizacin
Conclusiones
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PREGUNTAS
I. Qu es un pptido?
II. Qu es un enlace peptdico?
III. Cul es la estructura de una protena?
IV. Cules son las reacciones de cada una de las pruebas realizadas en el laboratorio?
V. Existen otras pruebas cualitativas y/o cuantitativas diferentes para la identificacin
de aminocidos en protenas? Cules?
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5. ACTIVIDAD CATALTICA DE LA -AMILASA Y VARIABLES QUE LA

AFECTAN
Las enzimas son molculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones qumicas,
siempre que sean termodinmicamente posibles: Una enzima hace que una reaccin
qumica que es energticamente posible pero que transcurre a una velocidad muy baja
transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. En estas reacciones, las
enzimas actan sobre unas molculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en
molculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las clulas
necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas
por enzimas se las denomina reacciones enzimticas. Las enzimas son un ejemplo de que
no slo es importante lo que comemos sino que adems es indispensable una buena
capacidad de absorber esos nutrientes.
OBJETIVOS
Experimentar sobre diferentes aspectos de la actividad enzimtica.

Comprender la forma como diversos factores influyen sobre la actividad cataltica de las
enzimas.
Evaluar la dependencia que puede presentar una reaccin enzimtica con respecto a la
acidez del medio y a la temperatura.
MARCO TERICO
Constituye la forma ms generalizada, aunque no la nica, de reserva energtica en

vegetales. Se almacena en forma de grnulos, y puede llegar a constituir hasta el 70% del
peso de granos (maz y trigo) o de tubrculos (patata). El anlisis minucioso de la estructura
del almidn demuestra que es una mezcla de otros dos polisacridos: la amilosa y la
amilopectina. La proporcin de ambos polisacridos vara segn la procedencia del
almidn, pero por lo general, la amilopectina es la ms abundante.
Los almidones constituyen la principal fuente de nutricin glicdica para la humanidad. El
almidn puede ser degradado por muchas enzimas. En los mamferos, estas enzimas se
llaman amilasas, y se producen sobre todo en las glndulas salivares y en el pncreas.
La amilosa es un polmero lineal formado por unidades de -D-glucopiranosa, unidas
exclusivamente por enlaces (1-4). El nmero de monmeros de la molcula depende de la
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procedencia del almidn: alrededor de 1000 en el caso de la papa y 4000 en el caso del
trigo. La amilosa se disuelve fcilmente en agua, adquiriendo una estructura secundaria
caracterstica, de forma helicoidal, en la que cada vuelta de la hlice comprende 6 unidades
de glucosa.
La amilopectina tiene un peso molecular mucho mayor que la amilosa y puede contener
cientos de miles o millones de monmeros de -D-glucopiranosa. Es un polmero
ramificado, en el que las cadenas principales estn formadas por mosacridos unidos
mediante enlaces glucosdicos (1-4) y donde cada rama se une a la cadena principal
mediante enlaces glucosdicos (1-6). Estas ramificaciones estn regularmente espaciadas
(cada 25-30 residuos de glucosa) y cada rama contiene nicamente uniones (1-4)
(Almidn).
Termamyl 120L es un producto enzimtico lquido que contiene -amilasa sobresaliente

termoestable expresada en y producida mediante una cepa genticamente modificada de
Bacilluslicheniformis. Se utiliza en las industrias de:
Almidn: Licuefaccin contina del almidn en cocedores a presin o en equipos que
operan a similar temperatura.
Alcohol: Adelgazamiento del almidn en los macerados de la destilacin.
Cervecera: Licuefaccin del almidn.
Azcar: Rompimiento del almidn presente en el jugo de caa. Por lo que el
contenido de almidn en el azcar crudo se reduce y la filtracin en la refinera se
facilita.
La enzima es una endoamilasa que hidroliza las uniones 1,4-glucosdicas de la amilosa y
amilopectina. Por lo que el almidn se rompe rpidamente en dextrinas solubles y
oligosacridos (Termamyl 120L).
Los pasos para transformar el almidn en jarabe glucosado son dos: licuefaccin, y
sacarificacin. Durante el proceso de licuefaccin se obtienen malto dextrinas empleando la
enzima alfa amilasa. Estas malto dextrinas contienen diferentes oligosacridos y dextrinas y
es ligeramente dulce. Luego se puede continuar la conversin a glucosa usando la enzima
amiloglucosidasa conocida tambin como glucoamilasa. Esta ltima etapa se conoce como
sacarificacin, donde la amiloglucosidasa puede transformar las malto dextrinas casi
completamente en glucosa; en la prctica se produce tambin un poco de maltosa (Cruz,
2012).
MATERIALES
Almidn soluble.
DNS
Lugol
Soluciones Buffer 0.1 M
Citrato con pH:3.5
Fosfato con pH:6.3
Fosfato con pH:9
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PROCEDIMIENTO
1. Preparar las siguientes soluciones:
25 ml de Almidn al 0.5% m/v en buffer citrato pH 3.5

25 ml de Almidn al 0.5% m/v en buffer fosfato pH 9
50 ml de Almidn al 0.5% m/v en buffer fosfato pH 6.3
50 ml de enzima diluida 1:150 (Preparada por el monitor)
2. Evaluacin del cambio del pH sobre la actividad de la enzima amilasa
Tomar 6 tubos de ensayo y adicionar 2,5 mL de la solucin de almidn, de acuerdo a la

siguiente tabla:
Nmero de tubo pH
1 3,5
2 6,3
3 9
4 3,5
5 6,3
6 9
Llevar los tubos de ensayo por 3 minutos a bao de 90oC para temperar.
Agregar 0.5 mL de la enzima diluida a los tubos a los 1,2 y 3.
Agregar 0.5 mL agua destilada a los tubos a los 4, 5 y 6.
Agitar y dejar los 6 tubos en el bao de 90 oC por 30 minutos.
Agregar 0.5ml de NaOH 2M a todos los tubos, para parar la reaccin.
Tomar 0,5 mL de cada uno de los tubos y agregar 30L de lugol.
Tomar 1 mL de cada uno de los tubos y agregarlos a un tubo seco y limpio.
Realizar protocolo de DNS a cada uno de los tubos anteriores.
Comparar la intensidad de los colores tanto para la prueba con lugol como para la del
DNS entre los tubos 1-4, 2-5 y 3-6.
3. Evaluacin del cambio de temperatura sobre la actividad de la enzima amilasa.
Tomar 6 tubos de ensayo y adicionar 2.5ml de la solucin de almidn de pH 6.3.

Temperar cada uno de los tubos por 3 minutos as:
Nmero de tubo C
1 25
2 60
3 90
4 25
Pgina 20
5 60
6 90
Agregar 0.5ml de la enzima diluida a los tubos 1, 2, y 3.

Agregar 0.5 mL agua destilada a los tubos a los 4, 5 y 6.
Agitar y llevar cada tuvo nuevamente a la temperatura correspondiente por 30 minutos.
Parar la reaccin agregando 0.5ml de NaOH 2M a todos los tubos.
Tomar 0,5 mL cada uno de los tubos y agregar 30L de lugol.
Tomar 1 mL de cada uno de los tubos y agregarlos a un tubo seco y limpio.
Realizar protocolo de DNS a cada uno de los tubos anteriores.
Comparar la intensidad de los colores tanto para la prueba con lugol como para la del
DNS entre los tubos 1-4, 2-5 y 3-6.
Nota: La actividad enzimtica ser reportada como mol de azucares formados por litro de
solucin por minuto por cantidad de enzima.
Procedimiento para determinar el porcentaje de azcares reductores utilizando DNS
a. Tomar 1 ml de solucin problema.

b. Adicionar 1 ml de reactivo DNS.
c. Tapar los tubos con papel para film y ponerlos en bao a ebullicin por 5 minutos.
d. Pasar los tubos a un bao de hielo, dejarlo por 5 minutos.
e. Leer absorbancia de todas las soluciones a 540 nm.
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6. DETERMINACIN DE ALGUNAS PROPIEDADES DEL ALMIDN Y

POSIBLES APLICACIONES INDUSTRIALES
OBJETIVOS
Determinar propiedades del almidn tales como el punto de gelatinizacin e ndice de

hinchamiento.
Evaluar la aplicabilidad del almidn en la elaboracin de pegantes y adhesivos.
MARCO TERICO
Los grnulos de almidn, que se producen en las plantas a partir de la fotosntesis de

dixido de carbono, estn formados por polmeros de glucosa y sirven como reservas de
energa. Hacia el final de la temporada de cultivo, el almidn se acumula en las ramas de
los rboles, cerca de las yemas. Tambin se encuentra en frutas, semillas, rizomas y
tubrculos. Los grnulos de almidn son muy adecuados para el almacenamiento a largo
plazo, debido a que es un material compacto, la sequedad relativa y alta estabilidad.
La transformacin del almidn crudo en agua caliente se llama gelatinizacin: los grnulos
se hinchan y estallan, formando una pasta. Durante el almacenamiento prolongado o
refrigeracin, la pasta de almidn a menudo se espesa debido a un fenmeno llamado
retrogradacin. Gelatinizacin y retrogradacin, que corresponden a modificaciones
estructurales en los grnulos, afectan el comportamiento del almidn que contienen los
sistemas.
En consecuencia, el almidn es excelente para modificar la textura de muchos procesados y
los alimentos cocinados en casa (por ejemplo, como harina de maz o harina para espesar
las salsas) y tambin ha sido utilizado durante siglos para otros fines, incluida la fabricacin
de papel, colas o refuerzos de la tela. Hoy en da, las nuevas aplicaciones del almidn son
emergentes, incluyendo las fibras de las dietas bajas en caloras, los materiales
biodegradables, envases, pelculas delgadas y materiales termoplsticos.
Los grnulos de almidn nativos varan enormemente de forma y de tamao (desde 0,1 a
200 nm), pero todos tienen una caracterstica comn: bajo el microscopio e iluminados con
luz polarizada, granos de almidn teidos con yodo presentan una "cruz de Malta"
distintiva lo que indica la existencia de algn orden interno comn. Cuando los grnulos se
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calientan en exceso de agua, la cruz comienza a desaparecer, lo que demuestra que este
orden molecular se est interrumpido (Almidn: un misterio estructural).
Figura 1. Almidn visto al microscopio. 400x
MATERIALES
Almidn
Agua.
Lugol
PROCEDIMIENTO
Preparar 100 ml de una solucin de almidn al 10% p/v, con la cual se realizaran cada uno
de los siguientes procedimientos:
a) Capacidad de retencin del agua.

Pesar un tubo de ensayo vaco
Tomar 10 mL de la solucin preparada y agregarlos al tubo.
Pesar nuevamente.
Centrifugar a 3500 rpm por 30 minutos.
Pesar otro tubo limpio y seco.
Pasar el sobrenadante al tubo anterior.
Pesar sistema con el sobrenadante.
Pesar el precipitado.
Calcular la capacidad de retencin del agua mediante:

% = 100

b) Determinacin y microscopia del punto de gelatinizacin

Llevar 90 mL de la solucin a un beaker.
Calentar con agitacin constante midiendo la temperatura peridicamente.
Tomar muestras de la suspensin a las temperaturas de 30, 60, 70 C en porta objetos.
Teir con lugol las muestras tomadas
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Observar cambios en microscopio para cada una de las muestras utilizando un

objetivo de 40x.
Determinar la temperatura de gelatinizacin.
c) Aplicacin: Evaluacin de pegantes.

Con el gel formado, realizar los siguientes procedimientos:
Rotulado de botellas.
Agregar gel sobre el papel kraft.
Dejar secar por 1 minuto.
Adherir el papel a una botella.
Dejar secar por 5 minutos (Hacer uso del secador).
Retirar papel.
Sellos de papel.
Esparcir gel sobre una tira de papel kraft.
Dejar secar por 10 minutos (utilizar secador).
Humedecer el papel.
Colocar la tira de papel sobre otro papel seco.
Dejar secar.
Retirar el papel.
d) ndice de hinchamiento.
Aadir 3 g de almidn en una probeta de 10 mL.
Medir el volumen ocupado por el almidn.
Agregar agua destilada hasta completar un volumen de 10 mL.
NO AGITAR.
Dejar reposar.
Medir el volumen de almidn cada 10 o 15 minutos hasta observar que no haya
variacin.
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7. TRANSESTERIFICACIN PARA PRODUCCIN DE BIODIESEL
OBJETIVO
Producir biodiesel a partir de aceite de palma, mediante una reaccin de

transesterificacin con metanol.
Determinar el ndice de acidez de algunos aceites mediante la norma NTC por el mtodo
con etanol caliente usando indicador.
MARCO TERICO
La transesterificacin es un trmino general que se utiliza para designar a las reacciones

orgnicas en las cuales se produce un intercambio o sustitucin del grupo acilo o alquilo de
un ster. Desde una perspectiva ms contextualizada, podramos definir la
transesterificacin como la reaccin mediante la cual, los triglicridos (TG) presentes en los
aceites vegetales y grasas animales se combinan con un alcohol de bajo peso molecular
usualmente metanol o etanol en presencia de un catalizador adecuado, para formar glicerina
y steres metlicos o etlicos. Los alquil steres grasos obtenidos a partir de la reaccin
anterior, poseen propiedades y tamao similares a los constituyentes del combustible diesel,
y es lo que se conoce como biodiesel.
Los catalizadores que se suelen utilizar a escala comercial son los catalizadores
homogneos bsicos. Se ha reportado que la sntesis de biodiesel catalizada por bases es
4000 veces ms rpida que al usar cidos, pero tiene la desventaja que necesita materias
primas refinadas con un contenido de agua menor al 0,5 % p/p y de cidos grasos menor al
1,0% p/p. Entre las ventajas de utilizar un catalizador heterogneo frente al homogneo y
enzimas, se puede mencionar: reutilizacin del catalizador, facilidad de procesos continuos,
uso de materias primas de diversa fuentes, no se forman jabones, purificacin ms sencilla,
no se necesita neutralizar, tiempo de reaccin menores. Entre los posibles inconvenientes,
podran presentarse: resistencia a la transferencia de masa, mayor temperatura de reaccin y
lixiviacin de las especies activas.
En la sntesis de biodiesel, el uso de catalizadores estructurados permitir eliminar algunos
pasos del proceso, como neutralizacin y lavado en el caso de los catalizadores
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homogneos, filtrados para los heterogneos. Este ahorro de etapas podra compensar el
mayor costo del catalizador si se superan los problemas operativos que imponen entre otros
aspectos la posibilidad de regeneracin y reuso del catalizador. El depsito de catalizador
en polvo sobre el monolito debe cumplir tres requisitos fundamentales: asegurar una
cantidad suficiente de catalizador, formar una capa homognea y tener una adherencia
suficiente para su manipulacin y uso (Damiani, Reinoso & Tonetto. 2011)
Los steres grasos obtenidos a partir de la reaccin dada, poseen propiedades y tamaos
similares a los constituyentes del combustible diesel, y es lo que se conoce como Biodiesel
(Torossi. 2006)
Figura 1. Reaccin para produccin del biodiesel
Principales variables que afectan la reaccin de transesterificacin
Figura 2. Principales variables que afectan la reaccin de transesterificacin.
Tanto la acidez del aceite como su contenido acuoso, son parmetros importantes para
tener en cuenta, por lo que una valoracin previa de la acidez del aceite, es importante
para determinar la cantidad de catalizador capaz de neutralizarla sin disminuir su accin
cataltica. Para el aceite de palma a usar, se supondr un ndice de acidez de 1.5 mg
NaOH/g aceite (Torossi. 2006)
La relacin molar entre el alcohol y el aceite es una de las variables ms influyentes en
el rendimiento de la reaccin y en la viscosidad final del biodiesel. El alcohol ms
utilizado es el metanol debido a su polaridad y a su estructura de cadena corta. Si bien la
estequiometria para la reaccin requiere tres moles de alcohol por mol de aceite, en la
prctica, se incrementar (9:1) para desplazar el equilibrio hacia una mayor formacin
de steres metlicos (Torossi. 2006).
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Los catalizadores a utilizar, son catalizadores bsicos, como el hidrxido de sodio o de

potasio. Es de suma importancia utilizar reactivos concentrados, para minimizar la
presencia de agua. La cantidad de catalizador a usar el 1% p/p con respecto a la cantidad
de aceite ms la cantidad de catalizador necesario para neutralizar el cido presente en el
aceite (ndice de acidez) (Torossi. 2006).
Definiciones
Acidez: contenido de cidos grasos libres determinados de acuerdo con el procedimiento
especificado en la norma NTC 218. La acidez se expresa como porcentaje en masa. Si el
resultado de la determinacin se reporta como acidez, sin explicacin adicional, sta es, por
convencin, la acidez expresada con base en cido oleico.2) Si la muestra contiene cidos
minerales, por convencin, se determinan cidos grasos.
ndice de acidez: nmero de miligramos de hidrxido de potasio requeridos para neutralizar
los cidos grasos libres presentes en 1 g de grasa, cuando se determina de acuerdo con el
procedimiento especificado en la norma NTC218. El ndice de acidez se expresa en
miligramos por gramo
Clculos previos a la prctica

Realizar los clculos correspondientes para procesar 50 gramos de aceite de palma
(100% de pureza, densidad 856 g/mol) con la relacin anteriormente indicada.
Calcular el peso de catalizador necesario en la reaccin y para neutralizar la acidez del
aceite.
PROCEDIMIENTO
Transesterificacin
1. Pesar el catalizador y disolverlo en el metanol.
2. Pesar 50 gramos de aceite y calentarlo para climatizar (60 grados centgrados).
3. Agregar la solucin de catalizador-Metanol al aceite de palma.
4. Pasar mezcla a un baln volumtrico con un magneto y poner en el montaje
esquematizado en la figura 3.
Figura 3. Montaje transesterificacin
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5. Asegrese de que la mezcla se mantenga aproximadamente a 60 grados centgrados

mediante un calentamiento en bao Mara con agua caliente.
6. Encender el sistema de agitacin y de reflujo.
7. Dejar reaccionar por 45 minutos.
8. Desmontar y pasar la mezcla a un embudo de decantacin para separar las fases.
9. Recuperar el biodiesel (fraccin liviana).
10. Purificar el biodiesel mediante lavado con agua a 100 grados centgrados.
Determinacin del ndice de acidez por Mtodo con etanol caliente usando indicador.
Materiales
Etanol 95% v/v neutralizado segn la norma NTC.
2,5g de aceite.
Solucin de NaOH al 0,25M normalizada.
Bureta.
Procedimiento
1. Pesar 2,5g de aceite en un Erlenmeyer de 100 ml.
2. Agregar 50 ml de etanol neutralizado (segn la norma NTC.) a 75C
3. Mezclar y llevar a ebullicin.
4. Titular con NaOH a 0,25 M, agitando vigorosamente.
5. Determine el ndice de acidez (ecuacin 1).
6. Calcular la acidez (ecuacin 2).
56,1
= (1)

= (2)
10
Donde
V: volumen usado de NaOH 0,25M en la titulacin (mililitros).
c: concentracin exacta de NaOH (moles/Litro).
m: masa de aceite (gramos).
M: masa molar del aceite (gramos/mol) (Tabla 1).
Tabla 1. Masa molar de aceites

Tipo de grasa Expresada como Masa molar (g/mol)
Aceite de coco, de palmiste y similares cido lurico 200
Aceite de palma cido palmtico 256
Aceites de algunas crucferas cido ercico 338
Todas las otras grasas cido oleico 282
En el caso de semillas de colza con un contenido mximo de cido Eurico de 5%(m/m), la
acidez se debe expresar como cido oleico.
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PREGUNTAS
I. Que son las normas NTC y que utilidad tienen?

II. Cmo se neutraliza el etanol segn la norma NTC 218 (Numeral 4.7.2)?
III. Cmo determinara si los productos de la transesterificacin si son los productos
esperados?
IV. Qu se esperara si se le mide el ndice de acidez y la acidez a la glicerina obtenida
en la transesterificacin? Tiene algn sentido medirlas?
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8. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS CON APLICACIONES EN LA

INGENIERA QUMICA
En el laboratorio es de vital importancia conocer los requerimientos mnimos para el

manejo de microorganismos. Todo microorganismo en el laboratorio se debe manipular
como si fuera potencialmente perjudicial para la salud. En la prctica cuando se
manipulan microorganismos provenientes de muestras ambientales se debe tener especial
cuidado en no perder microorganismos en las diferentes etapas de aislamiento, como
tampoco permitir la contaminacin.
OBJETIVOS
Demostrar la presencia de diversos tipos de microorganismos en la naturaleza.

Aislar microorganismo de diferentes microambientes.
MARCO TERICO
Cualquier ser vivo necesita tomar del ambiente una serie de compuestos que se emplean
como fuente de energa, y para sintetizar los constituyentes celulares. Estos compuestos se
denominan nutrientes. Los nutrientes deben contener agua, C, N, S, P, Ca, K, Na, Mg, Mo,
Cu y Zn.
En funcin de la fuente de energa, los microorganismos se clasifican en:
Fottrofos: utilizan la luz como fuente de energa
Quimitrofos: Oxidan compuestos qumicos inorgnicos para obtener energa.
En funcin de la fuente de carbono, los microorganismos se clasifican en:
Auttrofos: CO2
Hetertrofos: Compuestos orgnicos carbonados.
Los microorganismos en estado natural crecen de forma heterognea o mixta. Cuando

queremos estudiar un microorganismo dado, debemos aislarlo. Un cultivo puro es aquel que
contiene un solo tipo de microorganismo. El modo de obtener estos cultivos consiste en
obtener colonias aisladas, que provienen de una sola clula (son clones). Hay diferentes
mtodos para obtenerlas.
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METODOLOGAS EMPLEADAS PARA EL AISLAMIENTO DE

MICROORGANISMOS:
1. mtodo de siembra por agotamiento o en estra
Figura 1. Siembra por estra o agotamiento
Encienda el mechero y realice el procedimiento cerca de este. Con el asa estril tomamos la
muestra y hacemos extensiones en la placa. Volvemos a esterilizar el asa de siembra y
extendemos parte de la extensin anterior en otra direccin. Volvemos a esterilizar el asa de
siembra y volvemos a extender parte de la segunda extensin en otra direccin.
Esterilizamos y repetimos la operacin.
Incubamos a 37 durante 24 horas y, en la primera zona, habr un amasijo de clulas. En la
segunda, parte de la primera zona estar mejor extendida, y en la tercera y en la 4 mejor
an. Si tomamos una colonia y la ponemos sobre una placa Petri, tendremos un cultivo
puro.
2. Siembra por el mtodo de las diluciones sucesivas
Figura 2. Siembra por el mtodo de las diluciones sucesivas
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Consiste en diluir una muestra hasta conseguir muy pocas clulas que, tras inocularse en un
medio de cultivo, generen colonias aisladas. Metodologa:
Tomamos 0.1 ml de cada tubo y lo depositamos en una placa Petri con medio de cultivo.
Con un asa se extiende esa cantidad sobre la placa, e incubamos a 37 C durante 24 horas.
En la primera dilucin habr un amasijo de colonias. En la siguiente habr diez veces
menos nmero de colonias, y as sucesivamente hasta conseguir colonias aisladas.
PROCEDIMIENTO
Muestreo.
1. Tomar una muestra de suelo de 10-15cm de profundidad. Preferiblemente donde se

encuentren cultivos de plantas leguminosas (ej. Man forrajero), para el aislamiento de
bacterias solubilizadoras de fosforo.
2. Tomar una muestra de agua (lago, laguna, rio, fuente), para el aislamiento de microalgas
(ej. lago del parque norte). Tomar la muestra en un frasco coprolgico estril.
3. Tomar una muestra de bagazo de caa, para realizar el aislamiento de levaduras.
Guardar el bagazo de caa en una bolsa.
4. Tomar una muestra de madera colonizada por hongos Macromicetos o Micelio. Guardar
el madero con el hongo en una bolsa.
5. Todas las muestras deben estar frescas, es decir debe ser tomada un da antes de la
prctica, en su defecto se debe guardar en nevera.
Metodologa de Cultivo:
Bacterias:
1. Tomar 5g de tierra y diluir en 45ml de agua destilada estril (solucin madre)
2. A partir de la solucin madre realizar diluciones sucesivas, Tomando 1ml de solucin
madre y diluyndola en 9ml de agua destilada estril y as sucesivamente hasta
obtener una dilucin 10-3.
3. Tomar de cada uno de los tubos con el aza de aro una gota y proceder a sembrar por
agotamiento en la caja de Petri con medio de cultivo NBPRI.
4. Incubar a 37 C durante 24 horas.
Hongos:
1. Tomar un trozo pequeo de madera invadida por el hongo, o cortar un pedazo de
hongo (por las lamelas).
2. Realizar el lavado del hongo para disminuir posibles contaminantes as:
Llevarlo a una solucin de etanol, dejar 1 minuto, sacar y secar en papel
absorbente.
Introducirlo en una solucin de hipoclorito, por 1 minuto, sacar y secar en papel.
Lavar finalmente en una solucin de agua destilada estril por 1 min, sacar y secar
en papel.
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3. Llevar el trozo de hongo lavado a la caja de Petri con medio de cultivo KIMURA, y
sembrarlo en el centro de la caja realizando un poco de presin para hundir un poco el
hongo en el agar.
Levaduras:
1. Tomar un trozo de bagazo de caa y sumergirlo en 25 ml de agua destilada estril y
homogenizar (solucin madre)
2. A partir de la solucin madre realizar diluciones sucesivas, Tomando 1ml de solucin
madre y diluyndola en 9 ml de agua destilada estril y as sucesivamente hasta
3. Tomar de cada uno de los tubos con el aza de aro una gota y proceder a sembrar por
agotamiento en la caja de Petri con medio de cultivo PDA.
Microalgas:
1. La muestra de agua con microalgas ser la solucin madre.
2. A partir de la solucin madre realizar diluciones sucesivas, Tomar 1ml de solucin
madre y diluirla en 9 ml de medio de cultivo CHU13 y as sucesivamente hasta
3. Incubar a temperatura ambiente e iluminacin por 7 das.
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9. CARACTERIZACIN MACRO Y MICROSCPICA DE LOS

MICROORGANISMOS.
OBJETIVOS
Aprender a manejar adecuadamente el microscopio compuesto binocular.

Observar y describir las caractersticas morfolgicas de las colonias.
Utilizar el mtodo de coloracin de Gram para caracterizar una colonia bacteriana.
Clasificar microorganismos de acuerdo con las caractersticas morfolgicas.
MARCO TERICO
Las clulas son las unidades bsicas de los seres vivos. La mayora de ellas son de tamao
muy pequeo por lo que es indispensable el uso de instrumentos como los microscopios
para su visualizacin. El microscopio ptico, utiliza la luz visible para crear una imagen
aumentada del objeto. Por lo general se utilizan microscopios compuestos, que disponen de
varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores. Actualmente existen diferentes
tipos de microscopios: Microscopio ptico, simple, compuesto, de luz ultravioleta, de
fluorescencia, petrogrfico, de campo oscuro, de contraste de fase, de luz polarizada,
confocal, electrnico, electrnico de transmisin, electrnico de barrido y otros an ms
complejos.
Nota: En el laboratorio es de vital importancia conocer los requerimientos mnimos para el

manejo de microorganismos. Sobra decir que todo microorganismo en el laboratorio se
debe manipular como si este fuera potencialmente perjudicial para la salud. En la prctica
cuando se manipulan microorganismos provenientes de muestras ambientales se debe tener
especial cuidado en no perder microorganismos en las diferentes etapas de aislamiento,
como tampoco permitir la contaminacin.
Caracterizacin de microorganismos
La observacin de los microorganismos se valora en dos aspectos:
El aspecto macroscpico, en el que se evala color, forma y tamao de las colonias.
El aspecto microscpico en el que se evala la forma, el tamao y propiedades de la
pared del microorganismo como tal.
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Estas apreciaciones le permitirn al microbilogo determinar aspectos como:

Pureza del cultivo, ya que las colonias observadas deben ser de un solo tipo
La morfologa microscpica debe presentar uniformidad en el tamao, absorcin de la
coloracin y forma de los microorganismos evaluados.
Composicin de la pared, ya que la coloracin de Gram utilizada para la observacin
microscpica, da cuenta de los componentes presentes en la pared celular; puesto que al
ser negativa el microorganismo en esta tendra mayor porcentaje de lipopolisacridos,
mientras que al ser positiva, indicara que el microorganismo en esta estructura presenta
mayor porcentaje de pptidoglicanos.
Viabilidad, dado que la observacin en fresco, permite ver el movimiento microbiano.
Morfologa bacteriana
La forma de la clula bacteriana es una caracterstica que est determinada genticamente,

por ello es constante para cada especie (a pesar que existen pequeas variaciones durante
los ciclos reproductivos) y es una caracterstica fundamental en taxonoma e identificacin
de especies a nivel de laboratorio. Su morfologa puede agruparse en tres formas bsicas
(ver tabla 1):
a. Cocos (esfricas): Presentan forma esfrica o casi esfrica ya que sus dimetros (largo
y ancho) son casi iguales. En algunos casos se observan formas ovoides, arrionadas, o
lanceoladas. La forma celular est directamente relacionada con las estructuras de
envoltura de la clula.
b. Bacilos o Bastones (cilndricas): clulas con una morfologa ms variable,
caracterizada porque uno de los ejes o dimetro es notablemente mayor que el otro, de
tal manera que se observan como bastoncitos de diferente ancho y longitud. Al
observar algunas especies bacterianas, stas presentan diferentes formas durante su
multiplicacin siendo posible observar clulas filamentosas, bacilos cortos, ovoides,
etc.; a esta propiedad se le denomina pleomorfismo o polimorfismo. En otros casos las
formas bacilares se acortan en forma notable llegando casi a adoptar la forma ovoide
(morfologa cocobacilar).
c. Helicoidales o curvas (espirales): Generalmente clulas aislada; muy largas en
relacin a su ancho y se observa una torsin alrededor de su eje (espiras) en un nmero
caracterstico para cada especie (ejemplo: Spirochaeta, Treponema, Leptospira). Las
bacterias cortas y de espiral incompleto se denominan bacterias en comma o vibriones.
d. Bacilos miceliares: Entre las bacterias, existen algunas capaces de desarrollar en un
comienzo un micelio rudimentario, el que luego se fragmenta, ejemplo: Streptomyces
sp., entre otras.
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Tabla 1. Formas de las bacterias de acuerdo al tipo celular.
Tipo Celular Forma Descripcin

Diplococos Clulas agrupadas en pares.
Tetracocos Clulas se agrupan de a cuatro en un solo plano.
Clulas agrupadas en cadenas cortas (2-6) y largas (10-
Estreptococos
20) debido a la divisin celular en plano vertical.
Clulas se dividen en plano horizontal y vertical en
Estafilococos
Cocos forma simultnea originando agrupacin de clulas.
La divisin celular ocurre en diversos planos
Sarcina
formndose verdaderos cubos de clulas.
En la agrupacin celular no existe un orden aparente o
regular. Al realizar preparaciones que deban ser
Micrococos
sometidas a tincin, se debe ser cuidadoso ya que esta
agrupacin suele desarticularse.
Clulas aisladas en parejas, ejemplo Klebsiella
Diplobacilos
pneumoniae.
Estreptobacilos Clulas bacilares en cadenas, ejemplo: Lactobacillus
Bacilos Disposicin celular, una al lado de la otra, ejemplo:
Empalizada
Corynebacterium sp.
En grupos de a
Semejando ramificaciones, ejemplo: Mycobacterium sp.
tres
Figura 1. Morfologa Bacteriana
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Morfologa de hongos y levaduras
Los hongos son los descomponedores primarios de la materia muerta de plantas y de

animales en muchos ecosistemas, y como tales poseen un papel ecolgico muy relevante en
los ciclos biogeoqumicos. Los hongos se presentan bajo dos formas principales: hongos
filamentosos (antiguamente llamados mohos) y hongos levaduriformes. El cuerpo de un
hongo filamentoso tiene dos porciones, una reproductiva y otra vegetativa. La parte
vegetativa, que es haploide y generalmente no presenta coloracin, est compuesta por
filamentos llamados hifas (usualmente microscpicas); un conjunto de hifas conforma el
micelio (usualmente visible). A menudo las hifas estn divididas por tabiques llamados
septos.
El ciclo de vida del hongo puede ser Anamorfo, fase del ciclo de vida con reproduccin
asexual, o Teleomorfo, fase del ciclo de vida con reproduccin sexual.
Segn lo anterior las Esporas, elementos de perpetuacin de la especie, pueden ser:
Mitosporas (asexuales): Artrosporas, Clamidiosporas, Blastosporas, Conidiosporas.
Meiosporas (sexuales): Oosporas, Zigosporas, Ascosporas, Basidiosporas.

Los hongos levaduriformes o simplemente levaduras son siempre unicelulares, de
forma casi esfrica. No existen en ellos una distincin entre cuerpo vegetativo y
reproductivo.
Para determinar el tipo de hongo se deben observar las caractersticas de la colonia:
Si la colonia es cremosa de color rosado o crema, se puede tratar de levadura.
Si la colonia es algodonosa se trata de un hongo filamentoso.
Si se observa setas u orejas se trata de Basidiomicetes.
Microscpicamente se pueden seguir algunas claves:

1a. Clulas gemantes sin micelio vegetativo......................................................... Levaduras
1b. Micelio vegetativo abundante, con conidios o esporas.................................................... 2
2a. Esporas en ascos............................................................................................ Ascomicetes
2b. Esporas o conidias no originadas en ascas....................................................................... 3
3a. Micelio con pocos septos. Esporas asexuales en esporangios y presencia de
zigosporas............................................................................................................ Zigomicetes.
3b. Micelio septado conidios no originados en esporangios.......................... Deuteromicetes.
Las principales caractersticas de los hongos representativos que se observaran en el

laboratorio son:
Rhizopus: micelio no tabicado y algodonoso, esporangios muy anchos y oscuros. La base
del esporangio en forma de copa. Presencia de rizoides y zigospora.
Mucor: micelio claro y no tabicado, columnillas redondas u ovoides, esporas oscuras y de
apariencia lisa. No poseen rizoide.
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Aspergillus: micelio ramificado y cenoctico conidiforos tabicados o no tabicados, fialides

implantadas sobre una vescula.
Penicillum: micelios vegetativos tabicados, fialides ramificadas.
Levaduras: clulas individuales en forma ovoide, con cicatrices por la gemacin.
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Figura 2. Morfologa de hongos y levaduras
Morfologa de microalgas y protozoos
Las algas son organismos fotosintetizadores que habitan principalmente cuerpos de aguas
dulces y saladas. Dependiendo de la especie, existen algas unicelulares, coloniales y
multicelulares. La gran mayora de algas presentan tamaos microscpicos que varan
desde 1 m hasta 300 m, sin embargo existen algunas especies microscpicas que incluso
pueden alcanzar dimensiones superiores a los 50 m.
Tradicionalmente se han divido en grupos basados en su coloracin as: algas verdes
(Clorofitas), algas oscuras (Feofitas), algas rojas (Rodofitas) y algas pardas (Crisofitas).
Las algas verdeazules - Cianofitas, son microalgas procariotas.
Ciertas algas se pueden encontrar asociadas en la naturaleza con diferentes tipos de hongos.
A dicha asociacin simbitica se le conoce como lquenes. El hongo proporciona el
soporte y absorbe minerales y nutrientes del suelo, mientras que el alga a travs de su
accin fotosinttica, aporta las molculas orgnicas.
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Figura 3. Morfologa de microalgas
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Figura 4. Morfologa de microalgas
Preparaciones
Preparaciones no coloreadas: Con este mtodo se observan los microorganismos vivos, lo
que permite detectar el tipo de movilidad y la viabilidad de los mismos.
Preparaciones coloreadas: Como los microorganismos son incoloros y tienen el mismo

ndice de refraccin del agua, es necesario utilizar colorantes para poderlos visualizar. Los
mtodos para observar los microorganismos proporcionan las siguientes ventajas:
Un contraste entre la bacteria y el medio que lo rodea, permitiendo diferenciar los tipos
morfolgicos microbianos.
Una visualizacin de las estructuras internas y externas tales como. Espora, equivalente
nuclear, grnulos citoplasmticos, pared celular, cpsula y flagelo.
Una de las coloraciones ms utilizadas en el laboratorio, para la identificacin de
microorganismos es la coloracin de Gram, por tal razn se ver en detalle.
Coloracin de Gram
La coloracin de Gram es un mtodo que ha permitido la divisin de las bacterias en dos
grupos: El de Gram positivas y el de las Gram negativas. La tcnica est basada en la
capacidad de las bacterias para retener el colorante cristal violeta durante la decoloracin
con el alcohol acetona.
Las bacterias Gram negativas son decoloradas por el alcohol acetona, perdiendo el color
prpura propio del cristal violeta (Figura 2).
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Figura 5. Esquema de bacterias Gram Negativas
Las bacterias Gram positivas no se decoloran y retiene el color violeta. Despus de la

decoloracin, se utiliza la safranina, que es un colorante de contraste de color rojo, dicho
colorante da un color rosado a las clulas decoloradas (Figura 3).
Figura 6. Esquema de bacterias Gram Positivas
Las bacterias Gram positivas presentan una gruesa capa de pptidoglicano como estructura
fundamental por sobre la membrana citoplasmtica, y las Gram negativas, encima de sta,
presentan una delgada capa de pptidoglicano, a la que se superpone una capa de
lipopolisacridos-lipoprotena, denominada membrana externa. La presencia de esta
membrana diferencia actualmente dos divisiones en sistemtica bacteriana: las que no lo
poseen, Gram (+) y las que s, Gram (-). La diferencia entre ambos grupos es pues de
enorme importancia taxonmica. En el comportamiento como patgenos y en la
sensibilidad antibacteriana difieren sustancialmente; de ah que la realizacin rpida de una
coloracin de Gram, reviste enorme importancia en los procesos biotecnolgicos y en la
bacteriologa clnica (Facultad de qumica farmacutica).
Pgina 42
MATERIALES
Cajas Petri con colonias microbianas.

Colorantes Gram.
Azul de metileno
Mecheros.
Microscopio.
Estereoscopio.
Porta objetos.
Cubre objetos.
Aceite de inmersin.
PROCEDIMIENTO
1. Observe la morfologa de las colonias a nivel macroscpico, descrbalas segn su forma,

borde, elevacin y superficie.
2. Observe la morfologa de las colonias a nivel microscpico y descrbalas segn tamao,

color y forma.
1. Observacin en fresco. Se realiza un frotis, el cual consiste en tomar con un asa una
muestra de la colonia y esparcirla en el porta objetos, previamente humedecido con
una gota de agua, realizando movimientos horizontales. Se adiciona una muestra de
colorante (azul de metilo) a la muestra fresca. La observacin en fresco se utiliza para
hongos y levaduras (cristal violeta o azul de metilo), micro algas (lugol), clulas
vegetales o bacterias coloreadas.
Pgina 43
2. Coloracin en seco. Es necesario fijar la muestra despus de haber realizado el

frotis, para fijar se flamea el portaobjetos, teniendo precaucin de no quemar la
muestra, hasta que se evapore todo el agua, posteriormente se adicionan los
colorantes, segn el mtodo de tincin a utilizar.
Coloracin de Gram: Tome colonias separadas de acuerdo a su morfologa y realice

coloracin de Gram:
a. Teir con cristal violeta durante 1 minuto.
b. Retirar el colorante con agua.
c. Cubrir con lugol durante 1 minuto.
d. Lavar con agua.
e. Decolorar con alcohol cetona 30 segundos.
f. Contrastar con safranina durante 1 minuto.
g. Lavar con agua.
h. Secar el exceso de agua.
Describa su forma (cocos, bacilos, espiral) tipo de agrupacin y clasifquelas segn la

absorcin de la coloracin en Gram (+ o -).
PREGUNTAS
I. Cmo actan cada uno de los reactivos utilizados en la tincin de Gram?

II. Qu relacin existe entre la morfologa macroscpica y la microscpica?
III. Cules son los tipos de tincin y para que se utilizan?
IV. Por qu es importante la observacin microscpica en un proceso biotecnolgico?
V. Identifique las partes del microscopio ptico compuesto.
Pgina 44
Manejo del equipo. Antes de hacer uso del microscopio reconozca sus componentes y sus
funciones. El microscopio es un instrumento delicadamente ajustado que se debe manejar
con mucho cuidado.
Conecte el microscopio a una fuente de energa
Gire el control de luz hasta alcanzar la intensidad deseada.
Ubique el especmen que desea observar en la platina
Enfoque con el objetivo de 10X
Ajuste la distancia interpupilar
Ajuste la apertura del diafragma
Direccione la placa que tiene el especmen con los mandos de movimiento del
portaobjetos
Seleccione el objetivo que necesita (Aplique aceite de inmersin cuando use el objetivo
de 100X). Cuando finalice la observacin, asegrese de limpiar el lente del objetivo y
cualquier parte del microscopio que est cubierta con aceite.
Al finalizar su uso: Cbralo para protegerlo del polvo, Los lentes no se deben tocar con los
dedos. El polvo en el lente ocular debe limpiarse con una brocha de cerdas finas o un pao.
Pgina 45
De manera similar si una superficie de cristal requiere limpieza. Tambin puede limpiarse
con un pao o tela de textura suave o con papel especial para lentes. Las partes metlicas
pueden limpiarse con un pao humedecido. El alcohol no es recomendable para la limpieza
de ninguna de las partes del microscopio.
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10. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO ESPECFICOS
OBJETIVOS
Preparar medios de cultivo slidos y lquidos.

Reconocer algunos ambientes que permiten evidenciar la existencia de
microorganismos.
MARCO TERICO
Los ambientes capaces de albergar vida microbiana reflejan el amplio espectro de la

evolucin de estos organismos. Se han encontrado especies que viven a temperaturas
comprendidas entre el punto de congelacin y el punto de ebullicin del agua, en agua
salada y en agua dulce, en presencia y en ausencia de aire. Los microorganismos se hallan
capacitados para acometer una extensa gama de reacciones metablicas y adaptarse a
muchos ambientes diferentes. Por su poco peso pueden ser transportados por las corrientes
de aire y estar en todas partes, pero las caractersticas del ambiente determinan cules
especies pueden multiplicarse. Existen varias clases de microorganismos: Hongos,
levaduras, bacterias, actinomicetos, protozoos, algas, virus.
El suelo es uno de los ambientes donde un conjunto ingobernable de microorganismos
compiten entre s para obtener lo que todos ellos necesitan: nutrientes y energa. Al mismo
tiempo, los productos de su metabolismo alteran la composicin qumica del suelo donde
habitan. Ms an, los propios microorganismos evolucionan en respuesta a la presin del
ambiente. Numerosas especies bacterianas y algunas veces incluso algas microscpicas o
protozoos, proliferan en las superficies expuestas a la humedad formando una biopelcula
de microorganismos contenidos en una matriz de polisacridos, cuyo espesor puede oscilar
entre algunos micrmetros y pocos milmetros, que se adhiere fuertemente a la base. Las
biopelculas se forman en todas las superficies sumergidas, tanto en agua dulce como de
mar, o bien sobre soportes constantemente hmedos tales como paredes de la caera de
agua, pisos o dientes. El 99% de toda la actividad microbiana en un ecosistema abierto
ocurre sobre las superficies (Carrillo, 2003).
Un medio de cultivo es un sustrato o una solucin de nutrientes que permite el desarrollo de
microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se debe
Pgina 47
sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras en las que los microorganismos van
a crecer y multiplicarse para dar colonias.
Los microorganismos son los seres ms abundantes de la tierra, pueden vivir en
condiciones extremas de pH, temperatura y tensin de oxgeno, colonizando una amplia
diversidad de nichos ecolgicos. Entre los requerimientos ms importantes para su
desarrollo estn el carbono, el oxgeno, nitrgeno, dixido de carbono e hidrgeno. Muchas
bacterias sin embargo necesitan del aporte extra de factores de crecimiento especficos en
forma de suero, sangre y extracto de levadura entre otros. Los medios de cultivo se pueden
clasificar segn la origen, consistencia y composicin (Lpez & Torres. 2006).
Los medios de cultivo pueden ser:

Lquidos: Se preparan todos los constituyentes en una disolucin acuosa (agua
destilada). Una vez disueltos, se reparten en matraces o tubos de ensayo que tapamos y
esterilizamos con calor.
Slidos: Hacemos lo mismo que para los medios lquidos, pero, al disolver en agua
destilada, aadimos de 15 a 20 g/l de agar. Lo esterilizamos y lo depositamos en placas
Petri cuando est a unos 60. Cuando alcance los 50, ya ser slido.
Semislidos: Su apariencia es de gel. Slo llevan 5 g/l de agar.
En funcin de su composicin, distinguimos dos grupos de medios de cultivo:
Medios sintticos o definidos: Son aquellos que contienen cantidades precisas de sustancias
orgnicas e inorgnicas puras disueltas en agua destilada.
Medios complejos o indefinidos: Contienen sustancias altamente nutritivas, pero de
composicin indefinida. Suelen llevar sustancias como extractos de carne, peptona,
extractos de levadura, bovril... La ventaja de este medio de cultivo es que contiene muchos
factores de crecimiento, por lo que podemos cultivar en l gran nmero de
microorganismos. El inconveniente es que no conocemos lo que el microorganismo est
consumiendo.
MATERIALES
Erlenmeyer Mechero
Cajas Petri Cmara de flujo laminar
Tubos de ensayo Autoclave
Incubadora
PROCEDIMIENTO
Preparacin de medios de cultivos slidos y lquidos:
Preparar los medios de cultivo (PDA, NBPRI, KIMURA) de acuerdo a las

composiciones de la siguiente tabla y seguir las indicaciones que se den para su
preparacin.
Pgina 48
Medio de NBPRI. Bacterias solubilizadoras (Composiciones de medios especficos)
Composicin del medio Concentracin (g/L)

Glucosa 10
Ca3(PO4)2 5
MgCl2*6H2O 5
NBPRI (medio con fosfato MgSO4*7H2O 0,25
insoluble) KCl 0,2
(NH4)2SO4 0,1
Agar 13
pH 7
Cloruro de sodio 5.0
Extracto de levadura 5.0
Caldo LB
Peptona de casena 10.0
pH 7.2 0.2
Medio de mantenimiento levaduras
Reactivo Cantidad (g/L)

Glucosa 60
MgSO4.7H2O 1
KH2PO4 2
(NH4)2 SO4 3
Extracto de levadura 4
Peptona universal 3,6
Medio Kimura Hongos
Reactivo Medio slido (g/L) Medio lquido (g/L)

Glucosa 20 20
Peptona universal 5 5
Extracto de levadura 2 2
KH2PO4 1 1
MgSO4.7H2O 0.5 0.5
Agar 15 No
pH 5.5 5.5
Pgina 49
Colorantes
Colorante Concentraciones (ppm)

100
Orange II
200
100
Azul ndigo
200
Medio CHU 13. Microalgas
Sln 1. 1ml/L Stock Sustancia Concentracin(g/L)

Sln 2. 1ml/L 1 FeSO4. 7H2O 7,5*10-3
Sln 3. 1ml/L Na2EDTA 9,16*10-3
Sln 4. 2 ml/L 2 H3BO3 2,859*10-3
Sln 5. 2 ml/L NaMoO4. 2H2O 0,05 *10-3,
CHU 13 Sln.6 2 ml/L CoCl2. 6H2O. 0,081*10-3
NaHCO3 0,4 g/L
Mn Cl2 1,146*10-3
(preparar
CuCl2. 2H2O 0,054*10-3
y
ZnSO4 0,1234*10-3
esterilizar
3 K2HPO4 0,04
aparte)
4 MgSO4. 7H2O 0,1
5 CaCl2.2H2O 0,08
6 KNO3 0,2
1. Preparacin del medio de cultivo solido (Agar):

Disolver todos los ingredientes de la tabla en 1 litro de agua destilada, agitar, ajustar
pH y calentar hasta su completa disolucin.
Esterilizar en autoclave a 121C por 15 min y 15psi.
Verter el medio en cajas de petri estriles
En la caja Petri con medio slido, correspondiente a cada estudiante, inocule las cajas
con microorganismos obtenidos y aislados.
Luego incube dejando la caja invertida a 37C de 24 a 48 horas.
2. Preparacin del medio de cultivo liquido:

Disolver todos los ingredientes de la tabla en 1 litro de agua destilada, agitar y ajustar
pH de acuerdo con el medio de cultivo.
Esterilizar en autoclave a 121C por 15 min y 15psi.
Pgina 50
11. DETERMINACIN DE CINTICA DE CRECIMIENTO Y CAPACIDAD

METABLICA DE MICROORGANISMOS
OBJETIVOS
Caracterizar microorganismos con capacidad solubilizadora de fosfatos, degradadores de

colorantes, productores de bioetanol y productores de biomasa y pigmentos.
NOTA: Los tems marcados con * deben ser consultados por cada equipo de trabajo.
MARCO TERICO
La Cintica de crecimiento celular para microorganismos est dada por la ecuacin:

/ =
Dnde:
dN/dt: cambio del nmero de microorganismos en el tiempo
: velocidad especifica de crecimiento celular (horas-1)
N: nmero de microorganismos (nmero de clulas)
Si integramos la ecuacin en los lmites de No (microorganismo inciales) y N

(microorganismos en un tiempo t).se obtiene Ln(N/No)=t
Es posible identificar fases de crecimiento y parmetros cinticos que son caractersticos de

cada microorganismo.
Produccin de etanol*
Produccin de biomasa y pigmentos*
Solubilizacin de fosfatos*
Remocin de colorantes*
Pgina 51
Microorganismo 1. Levadura 2. Microalgas 3. Bacterias 4. Hongos

objetivo
proceso de Produccin de Produccin de Solubilizacin Remocin de
inters etanol biomasa y de fosfato. colorantes
pigmentos Biofertilizante
Fuente de Puestos de Lago Jardn Suelo Madera en
bsqueda jugos de caa botnico o parque pudricin
norte
Medio de PDA CHU13 lquido NBRIP o PVK Kimura
seleccin
Mtodo de siembra en caja Diluciones Diluciones siembra en
aislamiento seriadas seriadas placa
siembra en
placa
Ensayo de fermentacin Cultivo de Cultivo en cultivo en
aplicaciones alcohlica, microalgas placa medicin placa
medicin de medicin de de halo de medicin de
biomasa biomasa y crecimiento y halo de
pigmentos por solubilizacin crecimiento y
espectrofotometra de fosfato. degradacin
Cultivo lquido de colorante
medicin de
biomasa
MATERIALES
Cajas Petri con medios de cultivo especficos incubadas.

Fermentmetros
Espectrofotmetro
Colorantes
PROCEDIMIENTO
Realizar seguimiento cintico del cultivo, observar variaciones en el medio de cultivo

especfico y crecimiento del microorganismo y de acuerdo con el sustrato empleado.
Luego de registrar los datos tanto de absorbancia como del conteo celular de los diferentes
tiempos, construir las siguientes graficas:
1. Abs vs t, Numero de clulas/ml vs t, cm/t (segn el caso)
2. Calcular max y tiempo de duplicacin
Pgina 52
Bacterias solubilizadoras de fosfato

Preparacin del inculo. Se toma una colonia aislada de una cepa pura de bacterias
solubulizadoras sembrada por estras por agotamiento en placa de agar a 30 C
Curvas de crecimiento se cultiva en matraces Erlenmeyer de 500mL (con 300 ml de
medio de cultivo), incubados en shaker por 24 horas. Para obtener la cintica toman
muestras cada 2 horas midiendo Se siembra 0,1 ml en caja de Petri para determinar
Unidades formadoras de colonias/ml, realizando diluciones en caso de ser necesario.
(Consultar el procedimiento)*, o realizar conteo en cmara de Neubauer.
Microalgas
Inocular con un 10% V/V de la microalga, con un cultivo que tenga una buena
densidad celular.
Tomar muestras de 1 mililitro de biomasa durante 10 das de crecimiento

(homogenizar el sistema antes de tomar la muestra) para Densidad ptica y conteo
celular.
Leer absorbancia a 438nm (Recuerden tomar un mililitro agua destilada como

blanco)
Realizar conteo en cmara de Neubauer:

Conteo en cmara de Neubauer
Se cuentan las clulas en los 4 cuadros L y se calcula el promedio, teniendo en cuenta que
Promedio Clulas x 10000=X cel/ml
Figura 1. Cmara de Neubauer
Pgina 53
Hongos degradadores de colorantes

Medio slido
Cada caja Petri contiene aproximadamente 20 ml de medio de cultivo Kimura estril
.ms el colorante a la concentracin correspondiente.
Sembrar el hongo que corresponde, transfiriendo un trozo circular de agar
colonizado.
Incubar por 15 das a 30C en esttico.
Medir la velocidad de crecimiento y de decoloracin, midiendo en cada caja Petri el
crecimiento radial y el halo de decoloracin
Levaduras
Preparacin del inculo. Activar la levadura a las siguientes condiciones: 30C y 150 rpm
durante 24 horas.
Curvas de crecimiento: Montaje en batch en erlenmeyers de 500ml, con un

volumen de fermentacin de 300 mL, se adicionan 270 mL de medio de cultivo y 30 mL
levadura, libre de glucosa. Se debe tomar muestra cada dos horas, en los cuales se realizar
el siguiente procedimiento:
1. Tomar el cultivo del agitador y llevarlo a la cmara de flujo laminar.
2. Tomar una muestra de 1 ml con micro pipeta en epperndorf de 2mL.
3. Para cuantificar la biomasa. Medir absorbancia a 600 nm para determinar
concentracin de biomasa.
Montaje para la determinacin de etanol.

La cantidad de etanol producido se cuantifica de manera indirecta a partir del CO 2 liberado
durante la fermentacin, apoyados en la relacin estequiomtrica:
6 12 06 + . 22 5 + 2
La determinacin de etanol se realizara en erlenmeyers de 100 mL con un volumen de
fermentacin de 60 mL, se adiciona 54 mL de medio de cultivo y 6 mL de biomasa, libre de
glucosa. Al igual que para la determinacin de biomasa y consumo de sustrato se realizan
tres montajes con diferentes concentraciones. La diferencia del montaje para la
determinacin con respecto al montaje para la determinacin de biomasa y consumo de
sustrato es que este montaje lleva un fermentmetro (ver figura 5 y 6)
Pgina 54
Figura 2. Fermentmetro
Figura 3. Montaje con fermentmetro

Mediante la relacin estequiomtrica de la reaccin de fermentacin se sabe que por cada
mol de dixido de carbono que se libera, se produce una mol de etanol; lo que permite
determinar la cantidad de etanol equivalente (g/L), conociendo el volumen de lquido en el
interior del reactor, as:
1,047 2
=

Donde
Es la concentracin de etanol equivalente en el reactor en g/L.
2 Cantidad de dixido de carbono liberado en gramos.
Volumen del lquido en el reactor en litros.

Al montaje del fermentmetro se le registra el peso, con el fin de determinar la cantidad de
CO2 producido.
Pgina 55

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MANUAL DE LABORATORIO DE BIOLOGA PARA INGENIEROS

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2. Identificacin de matrices con presencia de macromolculas.

3. Manejo de materiales y equipos de laboratorio.

4. Determinacin de aminocidos y protenas.

5. Actividad cataltica de la -amilasa y variables que la afectan.

6. Determinacin de algunas propiedades y aplicaciones industriales del almidn.

7. Transesterificacin para produccin de biodiesel.

8. Aislamiento de microorganismos con aplicaciones en la ingeniera qumica

9. Caracterizacin macro y microscpica de los microorganismos

10. Preparacin de medios de cultivo especficos

11. Determinacin de cintica de crecimiento y capacidad metablica de

LABORATORIO DE BIOLOGA PARA INGENIEROS

1. INTRODUCCIN AL LABORATORIO E IDENTIFICACIN DE

NORMAS GENERALES EN EL LABORATORIO

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A partir de la solucin madre de levadura, adicionar los siguientes volmenes en balones

Solucin Volumen de solucin madre (mL)

Secar los filtros en estufa por 10 minutos a 90-100 C.

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4. DETERMINACIN DE AMINOCIDOS Y PROTENAS

Reconocer la presencia de algunos aminocidos en las protenas, a travs de reacciones

LABORATORIO DE BIOLOGA PARA INGENIEROS

Reacciones caractersticas de los aminocidos y protenas.

Prueba de Ninhidrina: Es positiva para aminocidos y protenas que tengan un grupo -

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Leche Hidrxido de sodio al 25%

Preparar las siguientes soluciones:

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Tubo Solucin Cantidad (mL)

A cada uno de los tubos adicione 5 gotas de cido ntrico concentrado.

Prueba de los aminocidos azufrados

Tubo Solucin Cantidad (mL)

A cada tubo adicione 3 gotas de hidrxido de sodio al 25%.

Tubo Solucin Cantidad (mL)

A cada tubo adicione 5 gotas de hidrxido de sodio al 25%

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