INMUNOLOGIA GENERAL E INMUNOQUIMICA

Trabajo Prctico N2: Inmunodifusin

Eva Acosta Rodriguez
eacosta@mail.fcq.unc.edu.ar

Objetivo general:
- Adquirir herramientas para evaluar, identificar y cuantificar Ags o Acs
mediante tcnicas de inmunoprecipitacin

Objetivos especficos:
- Determinar cuantitativamente la IgG purificada en el TP N 1
mediante IDRS (Mancini)
- Determinar mediante electroinmunodifusin la posible presencia de
protenas sricas contaminantes en la IgG purificada
 Interacciones Ag-Ac
Interaccin bimolecular reversible

Puente H
Determinante Enlace inico
Dominio
antignico variable
(epitope) I. hidrofbicas del Ac
I. van der Waals

interacciones dbiles

interaccin Ag-Ag fuerte requiere gran nmero de estas interacciones

alta complementariedad

ESPECIFICIDAD
 Gran Desarrollo de ensayos inmunolgicos
especifidad de para detectar o cuantificar Ags o Acs
la interaccin
Ag-Ac

UTILIDADES DE LOS INMUNOENSAYOS

Diagnstico de enfermedades
Monitoreo de la respuesta inmune humoral
Identificacin de molculas biolgicas o de inters
mdico
 Tipos de interacciones Ag-Ac

Primaria:

- primera etapa
- unin directa del Ac al Ag
- no visualizable, sin fenmenos asociados
- relativamente independiente de T y fuerza inica

ENZIMOINMUNOENSAYO
INMUNOFLUORESCENCIA
RADIOINMUNOANALISIS
 Secundaria:

- segunda etapa: agregacin de los complejos formados en

la interaccin 1ria
- fenmenos visibles a simple vista: precipitacin o
aglutinacin
- dependientes de T, pH, fuerza inica, etc

AGLUTINACION
INMUNODIFUSION
ELECTROINMUNODIFUSION
Terciaria:
- solo en interacciones in vivo
- efectos biolgicos colaterales a la interaccin (necrosis en
la reaccin de Arthus, efectos vasgenos y de miocontrac-
cin en anafilaxia)
 Reacciones de inmunoprecipitacin

Interaccin entre un Ac y un Ag soluble en solucin acuosa

Formacin de complejos multimoleculares

Desarrollo de precipitados visibles

Factores fsico- Proporcin relativa

qumicos Caractersticas de Ag y Ac
inmunoreactantes
 Factores fsico-qumicos
temperatura
fuerza inica afectan la difusin de
pH los inmunoreactantes
viscosidad

Difusin: movimiento de una sustancia disuelta desde el lugar

de mayor concentracin al de menor concentracin tendiente a
igualar las concentraciones en el seno del lquido

Q: cantidad de sustancia que difunde

Ley de Fick
t: tiempo
dQ = D.A. dC D: coeficiente de difusin
dt dx A: rea de difusin
(difusin libre C: concentracin inicial
unidimensional x: distancia recorrida
en medio fluido) D = cte.T T: temperatura
V V: volumen de la sustancia que difunde
 Caractersticas de los inmunoreactantes

Ac bivalente
no fragmentos F(ab)

complejos pequeos
solubles
complejos grandes
insolubles

bivalente (al menos dos copias del mismo epitope)

Ag
distintos epitopes (reaccionan con distintos Acs del As)

complejos grandes
insolubles

complejos pequeos
solubles
 Proporcin relativa de Ag y Ac
La composicin del enrejado (y su solubilidad) varan de
acuerdo a la concentracin relativa de los inmunoreactantes

+1 +3 +5 +7 +9

sin precipitado precipitado ppdo mximo precipitado sin precipitado

 Composicin
de los
complejos

Zona de Zona de Zona de exceso

exceso de Ac equivalencia de Ag

exceso Ac ++++ +- - - - - - -
-- -- - - - + + + +
Sobrenadante
exceso Ag

Precipitado

Prozona

Ag agregado
 Mtodos de inmunodifusin
Sirven para determinar la concentracin de Ags o Acs (cuantitativos),
o para comparar Ags y evaluar su pureza (cualitativos)

Utilizan medios gelificados (agar o gelatina) para evitar disturbios

ocasionados por las corrientes en el fluido

Tamao de poros que permiten la libre difusin de

inmunoreactantes Ley de Fick
Ausencia de reaccin fsica qumica entre los
inmunoreactantes y el gel

El tamao de los poros debe retener los inmunocomplejos facilitando

la precipitacin

Agar 0.3-1.5%
 Principales sistemas de inmunodifusin

Difusin Simple Difusin Doble

Ag Ac Ag Ac
Una
dimensin

Gel neutro

Ac Ag
Ag Ac
Dos
dimensiones
(radial)
Gel neutro
 Inmunodifusin radial simple
(IDRS, o tcnica de Mancini)
tcnica de ID bidimensional simple: difunde slo uno de los
inmunoreactantes (Ag) mientras que el otro (Ac) est disuelto
en el gel a concentracin constante.

Ag Ag Ac Ag
Ac Ac

precipitado

Exceso Ag
Exceso Ac

Zona de
equivalencia
(anillo de
precipitacin)
 tcnica cuantitativa: el dimetro del anillo de precipitacin es
proporcional a la concentracin inicial del Ag

Ac Ag Ac Ag

Ag
Ac Ag
Ac
Dimetro
del anillo

D 2 = k [ Ag ] + Do 2 D: dimetro del anillo

Do: dimetro del orificio
Ecuacin derivada de k: constante
La Ley de Fick 2
Do 2
[Ag ]= D
k
PROCEDIMIENTO:

1. Preparar agar impregnado con

Ac

200 mg/ml 800 mg/ml Muestra A

2. Agregar estndares y muestras
400 mg/ml 1600 mg/ml Muestra B

3. Colocar en cmara hmeda y

permitir la difusin

4. Visualizar los anillos de

precipitacin. Medir dimetro

D2 k
5. Realizar curva de trabajo con Muestra A
Muestra B D 2 = k [ Ag ] + Do 2
el dimetro de los estndares.
Calcular concentracin
muestras problemas Do
[Ag]
x x
CONSIDERACIONES EXPERIMENTALES

los estndares y las muestras problemas se deben procesar

simultneamente en la misma placa de agar para igualar las
condiciones de reaccin (temperatura, fuerza inica).
la pendiente de la curva de trabajo (k) depende de la
concentracin del Ac en el agar

ms econmico
dimetros ms grande
Ac diluido
mayor pendiente = sensibilidad
bordes ms difusos = mayor error

bordes ntidos = menor error

Ac concentrado
menor pendiente = sensibilidad
 Aplicacin en Prctico

Determinacin cuantitativa de la IgG humana purificada en

el TP 1

PROCEDIMIENTO
 Inmunodifusin radial doble
(IDRD, o tcnica de Ouchterlony)
tcnica de ID bidimensional doble: ambos inmunoreactantes (Ag
y Ac) difunden radialmente uno hacia el otro. Cuando se forma
alcanza la zona de equivalencia se observa una banda de
precipitacin.
Ag Ac

Zona de exceso de Ag Zona de exceso de Ac

Zona de equivalencia
La distancia a la que una sustancia difunde est :

en relacin DIRECTA con su CONCENTRACION.

Ag Ac Ag Ac

[ ] de equivalencia Exceso de Ac

en relacin INVERSA a su PM.

Ag Ac Ag Ac

PM Ag = PM Ac PM Ac
 tcnica cualitativa: permite analizar sistemas de Ag-Ac sin poder
determinar la concentracin de los inmunoreactantes

Usos principales: verificar la pureza de una muestra (Ag o Ac)

detectar Ags o Acs en una muestra

CONSIDERACIONES EXPERIMENTALES

se debe cumplir la LEY DE FICK

se forman tantas bandas de precipitacin como sistemas Ag-Ac
tengamos en la muestra
los Ag o Ac no atraviesan la banda en la que ellos mismos
precipitan
los Ag o Ac pueden atravesar una banda en la que ellos no
precipitan
PATRONES DE PRECIPITACION POR IDRD

Sistemas con tres reservorios pueden generar bandas de

precipitacin que han recibido nombres especficos.

IDENTIDAD: los dos sistemas antignicos son iguales, por lo

lo tanto se funden en una banda de precipitacin.

Y
NO IDENTIDAD: los dos sistemas antignicos son distintos,
cada uno origina bandas de precipitacin independientes que
se cruzan.

YY
IDENTIDAD PARCIAL: los dos sistemas antignicos comparten
algn componente (banda que se funde), pero no son iguales
(espoln o prolongacin).

YY
 Inmunoelectroforesis
(IEF)
tcnica semicuantitativa que combina dos metodologas:
1) separacin de protenas por electroforesis
2) inmunodifusin radial doble
Paso 1: Electroforesis

Las protenas cargadas negativamente (en buffer alcalino) son

sometidas a un campo elctrico se separan en un gel de agar de
acuerdo a su carga elctrica.

- +

Consideraciones:

Fenmeno de ELECTROENDSMOSIS: las protenas poco cargadas

son desplazadas en sentido contrario a su migracin electrofortica
real.
Paso 2: Inmunodifusin
Las protenas cargadas negativamente (en buffer alcalino) son
sometidas a un campo elctrico se separan en un gel de agar de
acuerdo a su carga elctrica.

Antisuero

- +

Aplicaciones
En laboratorios clnicos se utiliza para detectar presencia o
ausencia de protenas sricas, en el diagnstico de Gammapatas.
Investigar e identificar los componentes de una muestra
antignica.
Anti IgG

Anti protenas sricas totales

Anti IgM

Anti protenas sricas totales

Anti IgA

Anti protenas sricas totales