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LA PECULIARIDAD DE ILUMINAR LA VIDA

Protenas Fluorescentes

NICOLS CARRERO MUOZ


Universidad Nacional de Colombia
Noviembre 18 de 2016

Resumen
Las protenas fluorescentes son el fundamento de la
microscopia de fluorescencia y todas las aplicaciones que se
derivan de sta actualmente. Su descubrimiento y desarrollo,
es considerado como una de las innovaciones ms
emocionantes y tiles para las ciencias biolgicas y se
posiciona como el punto de partida para comprender una
cantidad impresionante de fenmenos naturales.

Palabras clave: Fluorescencia, ciencias biolgicas.

Uno de los primeros investigadores que inici la exploracin sistemtica


de las protenas fluorescentes fue el bioqumico japons Osamu
Shimomura. Shimomura obtuvo su PhD luego de purificar, cristalizar y
determinar la estructura qumica de la luciferina y sus productos
oxidados. Fue precisamente su trabajo con la luciferina lo que lo llev a
trabajar con en el profesor Frank Johnson en su laboratorio en
Princeton. Johnson le propuso trabajar en la bioluminiscencia de una
medusa, Aequorea aequorea, que habita en el ocano pacifico. El
laborioso trabajo desarrollado por Shimomura y Johnson consisti en
la recoleccin y tratamiento de alrededor de 10.000 medusas del puerto
de Friday en el estado de Washington, EEUU, para la obtencin de
muestras que fueron sometidas a los procedimientos de extraccin y
purificacin que resultaron en la obtencin de aquorina y GFP (Green
Fluorescent Protein) (Shimomura O, Johnson FH, 1962). Los trabajos
de Shimomura con la protena fluorescente continuaron hasta que
determin la estructura del cromforo de la GFP, el cual result ser una
interaccin entre las cadenas laterales de sus aminocidos. El hecho de
que el cromforo est contenido dentro del mismo pptido es vital
puesto a que da cabida a la posibilidad de que el gen de la protena
pueda ser clonada. Para los aos 90s hubo una disminucin drstica
en la poblacin de Aequorea aequorea en el puerto Friday siendo
imposible obtener la cantidad suficiente de muestra para extraccin de
aquorina y GFP naturalmente. Afortunadamente Inouye et al. (1985;
1986) y Prasher et al. (1985, 1992) haban clonado exitosamente los
genes de la aquorina y GFP.
Fueron precisamente los trabajos en clonacin adelantados por Prasher
et al. y el trabajo de Wang and Hazelrigg, (1994), en la expresin de
GFP y su fusin con una protena nativa que permita observar el
movimiento de dicha protena a travs de la clula, lo que le ayud
inmensamente a Martin Chalfie en su trabajo de investigacin con el
nematodo C. elegans.
Estas investigaciones demostraron la utilidad de la GFP como un
marcador biolgico en la expresin de genes y en la localizacin de
protenas. Las ventajas de la utilizacin de la GFP en lugar de otros
marcadores que estaban disponibles en la poca eran evidentes: La
GFP era hereditaria, dado que los organismos podran ser modificados
genticamente con la porcin del gen que codifica para la GFP, era
posible el cultivo de cepas modificadas con dicho gen para su estudio
posterior. La visualizacin de la GFP era esencialmente no invasiva; la
protena podra ser detectada simplemente exponiendo la muestra a luz
azul. La GFP era una molcula relativamente pequea e inerte que no
pareca interferir con los procesos biolgicos que se estaban
estudiando. Adems, la protena activa era un monmero, que le
permita difundir fcilmente a travs de clulas nerviosas. La
fluorescencia de GFP se pudo observar en los organismos vivos, lo que
permiti una visin dinmica de los eventos biolgicos. Adems, las
actividades biolgicas podran ser monitoreadas para las protenas
fuera, as como dentro de la clula puesto que la GFP acta como un
farol que ilumina el camino de aquellas molculas marcadas.
Las caractersticas mencionadas de la GFP le valieron el xito a Chalfie
cuando pudo visualizar clulas nerviosas en crecimiento en un
espcimen vivo de C. elegans.
Aunque la GFP nativa fue muy til para una variedad de experimentos,
para que se estableciera realmente como una herramienta til para los
estudios biolgicos, sus propiedades deban ser mejoradas. La persona
que comenz a mejorar la GFP y que sigui liderando su desarrollo fue
Roger Tsien. Tsien estaba interesado en las interacciones
macromoleculares dentro de las clulas vivas, precisamente la
interaccin del cAMP con PKA (protena quinasa dependiente de
cAMP). Trabajando en la Universidad de California, San Diego mejor
la eficiencia de la GFP aprovechando un principio muy comn en la
evolucin: Mutacin. En 1994, l y su grupo establecieron una protena
mutante en un solo aminocido (S65T) de GFP con una mejor
intensidad de color y estabilidad lumnica que la protena natural.
Mientras que la GFP natural tena dos mximos de excitacin a 395 nm
y 475 nm, la versin mutada tena slo una a 484 nm. Manteniendo su
longitud de onda de emisin a 509 nm, las caractersticas espectrales de
la "nueva" GFP se ajustaron casi a las propiedades de fluorescencia
(FITC) clsicas (FITCex: 496 nm, FITCem: 520-530 nm). (Tsien 1994,
1996)

Haciendo una investigacin estructural sobre GFP, Tsien y sus


colaboradores desarrollaron otros derivados fluorescentes. Con la
estructura de GFP en sus manos se estableci una variante (T203Y)
que brillaba en amarillo fluorescente y por lo tanto se le dio el nombre de
"protena amarilla fluorescente" o YFP. Las formas que daban los
colores cian (CFP) y azul (BFP) vinieron posteriormente.
El descubrimiento, desarrollo y utilizacin de la GFP y sus mutantes
cambiaron la visin de la vida y contribuyeron de tal manera a su
comprensin que en el 2008 Osamu Shimomura, Martin Chalfie y Roger
Y. Tsien fueron galardonados con el Premio Nobel de Qumica.
Los trabajos adelantados por los ganadores del Nobel y el aporte de
muchos de sus colegas cimentaron el camino de la GFP en el mundo de
las ciencias biolgicas. La GFP se convirti en pieza clave para
visualizar la expresin gnica, estructuras celulares y organismos
completos sin la necesidad de marcadores sintticos o anticuerpos
fluorescentes. Los mtodos clsicos de tincin se deba asegurar el
ingreso de dichas sustancias a la clula para que pudieran realizar el
respectivo marcaje a sus objetivos. El ingreso de los marcadores era
posible gracias a la permeabilizacin de la membrana con detergentes o
la micro inyeccin, asimismo, la mayora de los anticuerpos prefieren
antgenos desnaturalizados. Por lo tanto, las tcnicas de
inmunofluorescencia utilizan agentes qumicos para desnaturalizar las
estructuras celulares de protenas celulares. Estas metodologas
inducen, inevitablemente, al decaimiento dela actividad celular o
inclusive a la muerte.
Las aplicaciones biolgicas celulares de la GFP pueden dividirse en
usos como un marcador o como un indicador. En las aplicaciones de
marcado, que son la gran mayora hasta la fecha, la fluorescencia con
GFP simplemente refleja niveles de expresin gnica o localizaciones
intracelulares causadas al sealizar protenas a las que se fusiona.
Como indicador, la fluorescencia con GFP tambin puede ser modulada
postranslacionalmente por su ambiente qumico y las interacciones
protena-protena. La GFP y sus variantes permitieron que los cientficos
observaran la metstasis o la angiognesis en los organismos vivos.
Adems, el uso de neuronas fluorescentes multicolores (Arco iris
cerebral) es til para comprender las redes neuronales complejas en el
cerebro. Tambin abren la posibilidad de decorar virus, como HIV, con
protenas fluorescentes para comprender como se desenvuelven y ver
su destino en las clulas husped
En los ltimos 25 aos la GFP ha pasado de ser una protena
interesante pero relativamente desconocida a una de las herramientas
ms utilizadas en biologa molecular y celular. A pesar de su estructura
relativamente simple, muchas preguntas sobre su plegamiento,
formacin de cromforos y fotofsica siguen sin respuesta. Las
respuestas a estas preguntas no solo nos ayudarn a entender GFP y
sus propiedades, sino que tambin nos llevarn a aplicaciones nuevas y
mejoradas que todava hay muchas aplicaciones que estn a la espera
de beneficiarse de la fluorescencia GFP. (Tsien, 1998).

Bibliografa
Shimomura O, Johnson FH and Saiga Y: J Cell Comp Physiol 59
(1962) 223239.
Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW and Prasher DC:
Science 263 (1994) 802805.
Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW, Prendergast FG and
Cormier MJ: Gene 111 (1992) 229233.
Wang, S., Hazelrigg, T. (1994). Implications for bcd mRNA
localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila
oogenesis. Nature 369(6479): 400--403. (Export to RIS)
Heim R, Prasher DC, Tsien RY: Wavelength mutations and
posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc
Natl Acad Sci USA 91 (1994) 1250104.
Ormo M, Cubitt AB, Kallio K, Gross LA, Tsien RY, Remington SJ:
Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent
protein. Science 273 (1996) 139295.
Roger Y. Tsien. The green fluorescent protein. Annu. Rev.
Biochem. 1998. 67:50944