TUGAS

KIMIA ANALISIS
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Dosen : Prof.DR. Amlius Thalib

Disusun oleh :
Nurwanda Hafsari 13330038
Sri Wulandari 13330039
Farha Elein Kukihi 13330705
Lady Oktora 13330706
Eka Fitriyani 13330707
Chrisna Widhiani 13330712

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA dan ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT SAINS DAN TEKNOLOGI NASIONAL
JAKARTA - 2014
 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC
(Hight Performance Liquid Chromatograhy ) merupakan salah satu teknik kromatografi
untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. HPLC digunakan untuk
memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu.
Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam
(stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus
karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa
gerak tertentu. Dengan bantuan detector serta integrator kita akan mendapatkan
kromatogram. Kromatogram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.
HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis
dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain :
farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan.

1. Sejarah KCKT

Kromatografi pada hakekatnya merupakan metode pemisahan dimana komponen

yang akan dipisahkan terdistribusi diantara dua fase yang saling tidak bercampur yaitu

fasa diam dan fasa gerak. Kromatografi juga didefinisikan sebagai proses pemisahan zat

terlarut oleh suatu proses migrasi diffferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua

fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah

tertentu dan didalamnya zat-zat itu menunjukkan adanya perbedaan dalam adsorpsi,

partisi, kelarutan tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan tekanan uapnya (Bahti,

1998).

Istilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang

berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day

juga menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun

Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses
kromatografi. Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai

digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC).

Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi

mulai berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938

oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil

karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka

memenangkan Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat kromatografi cair tetapi

seperangkat umum langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi

kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai

kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an kromatografi gas

dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih (Sudjadi, 1986).

Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar,

pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur

biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha

dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi

kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi

Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High

Speed= Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari

usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi

dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian

membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat

ini dengan teknik yangsudah matang dan dengan cepat HPLC mencapai suatu keadaan

yang sederajat dengan kromatografi gas (Putra, 2004).

Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion adalah

contoh-contoh dari kromatografi kolom. Pada metode kromatografi cair ini digunakan
 kolom tabung gelas dengan bermacam diameter. Partikel dengan dimensi yang bervariasi

digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya

sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara

aliran fase gerak yang seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama.

Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi

piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu

menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid

chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan

kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50

nm; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar, 2003).

HPLC telah digunakan di Indonesia sejak tahun 1997 oleh Wiadnyana dalam
penelitiannya yang bertema menguji dan menentukan kadar toksisitas berbagai macam
fitoplankton di perairan laut. Selain digunakan untuk uji toksisitas, dalam bidang
Biokimia HPLC kerap digunakan untuk menghitung kadar vitamin dan protein dari
suatu makanan atau sampel. Singkatnya, HPLC merupakan sebuah metode analisa
modern yang multifungsi dan sudah ada di Negara kita Indonesia.

2. Kelebihan KCKT

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure Liquid

Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. KCKT

termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak

cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika

dibandingkan dengan metode lainnya (Done dkk, 1974; Snyder dan Kirkland, 1979;

Hamilton dan Sewell, 1982; Johnson dan Stevenson, 1978). Kelebihan itu antara

lain :

Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

Mudah melaksanakannya
 Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi

Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis

Resolusi yang baik

Dapat digunakan bermacam-macam detector

Kolom dapat digunakan kembali

Mudah melakukan "sample recovery"

3. Keuntungan KCKT

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam

banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan

yang sama membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada KG, namun pada KCKT

zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada

pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan

berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan yang lebih besar

bagi para analis laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer pada KCKT karena

teknik ini dapat digunakan untuk menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang

umumnya digunakan. KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan

kromatografi cair klasik, antara lain:

Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat

diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated),

waktu analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai

Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana

interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi

dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.

Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak
 pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang

diinginkan.

Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT

dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam

zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi

jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer

Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT

Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi

klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa

dilakukan dengan kolom yang sma sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi,

kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan

Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat zat yang tidak bisa

dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk

menganalisis psesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali

untuk mengalissis zat zat tersebut.

Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak

menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh

karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah sikumpulkan setelah

melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk

kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.

4. Fase Diam KCKT

HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan dengan memakai fase
diam yang terikat secara kimia pada penyangga halus yang distribusi ukurannya sempit
(kolom) dan fase gerak yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang terkendali dengan
memakai tekanan tinggi sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan
waktu yang relative singkat.
Fasa stasioner/diam dapat berupa zat padat. Fase diam akan menahan komponen
campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen
yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang
mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat.
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi,
silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.
Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol
(Si-OH). Fasa diam adalah cairan film yang dilapiskan pada material kemasan yang
terdiri dari partikel silica berpori 3-10 .
Fasa diam mungkin sebagian akan larut dalam fasa gerak. Untuk mencegah hilangnya
fasa diam ini, maka fasa diam diikat secara kovalen pada partikel silica. Ikatan fasa
diam diperoleh dengan mereaksikan partikel silica dengan organochlorosilane dengan
bentuk Si (CH3)2RCl dimana R adalah alkil atau alkil yang tersubstitusi.
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti
klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya
dengan gugus-gugus fungsional yang lain. Hasil reaksi yang diperoleh disebut dengan
silika fase terikat yang stabil terhadap hidrolisis karena terbentuk ikatan-ikatan
siloksan (Si-O-O-Si). Silika yang dimodifikasi ini mempu karekateristik kromatografi
dan selektifitas yang berbeda jika dibandingkan dengan silika yang tidak dimodifikasi.
Oktadesil silika (ODS atau C 18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan
karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang,
maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut
yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai
pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan
memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air
yang digunakan.
Solut-solut yang polar, terutama yang bersofat basa akan mengekor (tailing peak)
pada penggunaan fase diam silika fase terikat. Hal ini disebabkan oleh adanya interaksi
adsorbsi antara solut-solut ini dengan residu silanol dan pengotor logam pada
silika.Masalah ini dapat diatasi dengan end-chapping yakni proses menutupi residu
silanol ini dengan gugus-gugus trimetilsilil dan menggunakan silika dengan
menggunakan silika dengan kemurnian yang tinggi (kandungan logam <1ppm).
 Kolom konvensional Kolom mikrobor
Porous, silika ukuran Porous, silika ukuran kecil,
kecil, silika yang silika yang dimodofikasi secara
dimodofikasi secara kimiawi (bonded phase), atau
kimiawi (bonded phase), polimer-polimer stiren/divinil
Fase diam atau polimer-polimer benzen.Rata-rata diameter
stiren/divinil benzen.Rata- partikel 3,5 atau 10m dengan
rata diameter partikel 3,5 kisaran sempit.
atau 10m dengan kisaran
sempit.

Tabel Berbagai fase diam silika dan alumina yang beredar di pasaran (Munson, 1981)

Diameter
Luas
ukuran Bentuk
Jenis Nama permukaan
partikel partikel
(m2/g)00
(m)

Silika -Porasil 10 Tak 300

teratur

Lichrosorb-Si- 5,10 Tak 500

60 teratur

Partisil 5,10,20 Tak 400

teratur

Micro Pak Si 5,10 Tak 400

teratur

Sil-X-1 13 5 Tak 400

 teratur

Porasil C 37-75 Bundar 50-100

Vydac HS 5,10,15,20 Bundar 300

Hypersil 5-7 Bundar 200

Nucleosil 50 5,10 Bundar 500

Sorbax Sil 6-8 Bundar 300

Spherisorb 5,10 Bundar 220

Alumina Lichrosorb 5,10 Tak 70

ALOX teratur

Micro Pal AL 5,10,20 Tak 70

teratur

Spherisorb AY 5,10,20 Bundar 95

5. Fase Gerak KCKT

Fase Gerak Pada HPLC

Fase gerak atau dikenal juga dengan istilah eluen umumnya merupakan campuran pelarut
yang berperan dalam daya elusi dan resolusi analisis. Daya elusi dan resolusi KCKT
ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat-sifat
komponen dalam sampel.

Fungsi Fase gerak

 Selain Untuk membawa komponen-komponen campuran menuju detektor ternyata Dapat
berinteraksi dengan solut-solut, oleh karena itu fase gerak merupakan salah satu faktor
penentu keberhasilan proses pemisahan.

Secara umum ada 2 tipe fase gerak:

1. Fase gerak/eluen isokratik, yaitu eluen dengan komposisi pelarut yang tidak berubah
selama percobaan kromatografi
2. Fase gerak/eluen gradien, yaitu fase gerak dengan komposisi pelarut yang berubah
selama masa kromatografi
Seringkali campuran pelarut merupakan fase gerak yang lebih baik daripada cairan murni,
namun pekerjaan optimasi berbagai komposisi pelarut untuk fase gerak secara coba-coba
tentu tidak mudah dilakukan.

Jenis-jenis fase gerak

1. Berdasarkan jenis kromatografinya dibedakan atas :
a. fase gerak bersifat interaktif
b. fase gerak bersifat non interaktif
2. Berdasarkan fasenya dibedakan atas :
a. fase gerak bersifat lebih polar dari fase diam
b.fase gerak bersifat kurang polar dari fase diam

Berdasarkan kepolaran fase gerak dibandingkan fase diamnya, fase gerak dibedakan
menjadi:

1. Fase normal, yaitu fase diam lebih polar dari fase gerak. Kemampuan elusinya akan
meningkat seiring peningkatan polaritas fase gerak.
2. Fase terbalik, yaitu bila fase diam kurang polar dibanding fase geraknya. Kemampuan
elusi akan menurun seiring peningkatan kepolaran fase geraknya.
Deret eluotrofik yang merupakan deretan nama-nama pelarut yang disusun berdasarkan
kepolarannya, akan sangat membantu kita dalam pemilihan fase gerak.

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pemilihan fase gerak

1. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing
2. Pada saat membuat pelarut untuk fase gerak dianjurkan untuk menggunakan pelarut,
buffer,
atau reagen dengan tingkat kemurnian tinggi.
3. Pelarut sebaiknya memiliki HPLC grade
4. Penggunaan fase gerak harus memperhatikan sifat fase diam yang digunakan
berdasarkan
pengelompokan KCKT

Fase gerak yang akan digunakan mempunyai syarat-syarat antara lain

a. Murni, tanpa cemaran

b. Tidak bereaksi dengan cemaran
c. Sesuai dengan detektor
d. Dapat melarutkan cuplikan
e. Mempunyai viskositas rendah
f. Memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan mudah, jika diperlukan.

Beberapa deret eluotropik KCKT :

Pelarut Parameter Parameter kekuatan UV cut off

kekuatan pelarut pelarut (partisi) (nm)
(adsorbsi)
n-heksana 0,01 0,1 195
Sikloheksana 0,04 -0,2 200
Tetraklorometan 0,18 1,6 265

Nilai pemenggalan UV merpakan panjang gelombang yang mana pada kuvet 1 cm,
pelarut akan memberi absorbasi lebih dari 1,0 satuan absorbansi. Sangat dianjurkan untuk
menggunakan panjang gelombang deteksi yang tidak bertepatan atau di sekitar panjang
gelombang pemenggalan UV pelarut yang digunakan sebagai fase gerak.

Wadah Fase Gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan inert. Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium
dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase
gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran
pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan
resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas
fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih
polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas
pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak),
kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-
partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab
adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor
sehingga akan mengacaukan analisis.

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau
dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog
dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk
meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran
polaritas yang luas.

Contoh Fase Gerak

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah
campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk
pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran
pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-
pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan
fase terbalik.

Fase gerak pada Normal Phase HPLC

Fase gerak NP HPLC didasarkan pada pelarut nonpolar (seperti heksana, heptana, dll)
dengan sedikit penambahan senyawa polar. Senyawa polar yang biasa digunakan adalah
alkohol (metanol, etanol, atau isopropanol). Variasi konsentrasi senyawa polar pada fase
gerak dimaksudkan untuk mengontrol retensi analit dalam kolom. Karena kepolarannya
yang dominan, penambahan senyawa polar ke dalam fase gerak relatif sedikit, meskipun
hanya 1 %v/v variasi senyawa polar pada fase gerak biasanya menghasilkan perubahan
retensi analit yang signifikan.

Bahan yang digunakan pada fase diam dalam normal phase HPLC biasanya berpori oksida
seperti silika (SiO2) atau alumina (Al2O3). Permukaan fase diam ditutupi dengan gugus
OH, yang membuat permukaan menjadi sangat polar. Retensi analit pada permukaan
semacam ini sangat sensitif terhadap variasi komposisi fase gerak. Modifikasi kimiawi
fase diam juga dapat digunakan dalam HPLC fase normal. Trimethoxy glycidoxypropyl
silanes (nama umum: diol-fase) adalah bahan dengan polaritas permukaan lebih rendah
yang digunakan untuk memodifikasi silika. Kepadatan permukaan Kelompok OH pada
fase diol adalah pada tingkat 3-4mol/m2, sedangkan pada silika silanols kepadatan
permukaannya adalah pada tingkat 8mol/m2. Dengan menggunakan fase diam jenis diol
dan pengubah polaritas eluen [ester (etil asetat) bukan dari alkohol] memungkinkan untuk
meningkatkan pemisahan analit dan meningkatkan reproduktifitas dibandingkan dengan
menggunakan silika.

Pemilihan normal phase HPLC berhubungan dengan kelarutan sampel dalam fase gerak.
Dengan pelarut utama nonpolar, biasanya normal phase HPLC dipilih sebagai metode
untuk pemisahan senyawa yang sangat hidrofobik, yang tidak larut dengan senyawa polar
atau air (yang menunjukan interaksi yang sangat kuat dengan Reverse Phase HPLC).

6. Jenis-jenis KCKT

Hampir semua jenis campuran solute dapat dipisahkan dengan KCKT karena

banyaknya fase diam yang tersedia dan selektivitas yang dapat ditingkatkan dengan

mengatur fase gerak. Pemisahan dapat dilakukan dengan fase normal atau fase terbalik

tergantung pada polaritas relative fase diam dan fase gerak. Berdasarkan pada kedua

pemisahan ini, sering kali KCKT dikelompokkan menjadi KCKT fase normal dan

KCKT fase terbalik. Meskipun demikian, klasifikasi berdasarkan pada sifat fase diam
dan atau berdasarkan mekanisme sorpsi solute memberikan suatu jenis KCKT yang

lebih spesifik. Jenis-jenis KCKT berdasarkan hal ini diuraikan di bawah ini.

a. Kromatografi Adsorpsi

Pemisahan kromatografi adsorpsi biasanya menggunakan fase normal dengan

menggunakan fase diam silica gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90 %

kromatografi ini memakai silica sebagai fase diamnya. Pada silica dan alumina

terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solute. Gugus silanol pada

silica mempunyai reaktivitas yang berbeda, karenanya solute dapat terikat secara

kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor (tailing). Berbagai macam

fase diam silica dan alumina dapat dilihat pada tabel di bawah ini.

Jenis Nama Diameter Bentuk Luas

ukuran partiker partikel Permukaan
(m) (m2/g)
Silika -Porasil 10 Tak teratur 300
Lichrosorb-Si-60 5,10 Tak teratur 500
Partisil 5,10,20 Tak teratur 400
Micro Pak Si 5,10 Tak teratur 400
Sil-X-1 135 Tak teratur 400
Porasil C 37-75 Bundar 50-100
Vydac HS 5,10,15,20 Bundar 300
Hypersil 5-7 Bundar 200
Nucleosil 50 5,10 Bundar 500
Sorbax Sil 6-8 Bundar 300
Spherisorb 5,10 Bundar 220
Alumina Lichrosorb 5,10 Tak teratur 70
ALOX
Micro Pal AL 5,10,20 Tak teratur 70
Spherisorb AY 5,10,20 Bundar 95

Fase gerak yang digunakan untuk fase diam silica atau alumina berupa pelarut non-

polar yang ditambah dengan pelarut polar seperti air atau alkohol rantai pendek

untuk meningkatkan kemampuan elusinya sehingga tidak timbul pengekoran

puncak, misal n-heksana ditambah dengan methanol.

 Penambahan air atau pelarut polar lain harus dipertimbangkan secara matang. Jika

terlalu sedikit yang ditambahkan maka kemungkinan belum mampu mengelusi

solute, akan tetapi jika terlalu banyak akan menyebabkan kolom menjadi kurang

aktif.

Untuk memperoleh waktu retensi yang reprodusibel, air yang ada di fase gerak dan

yang ada di dalam penjerap harus dijaga konstan karena jika penjerap atau fase

gerak menyerap air dari udara menyebabkan waktu retensinya bergeser.

Pemilihan fase gerak pada kromatografi adsorpsi ini terbatas jika detector yang

digunakan adalah spektrofotometer UV. Hal ini terkait dengan adanya nilai

pemenggalan UV (UV cut off) pelarut-pelarut yang digunakan sebagai fase gerak.

Solut-solut akan tertahan karena adanya adsorpsi pada permukaan gugus aktif

silanol dan akan terelusi sesuai dengan urutan polaritasnya. Jenis KCKT ini kurang

luas penggunaan, meskipun demikian jenis KCKT ini sesuai untuk pemisahan-

pemisahan campuran isomer struktur dan untuk pemisahan solute dengan gugus

fungsional yang berbeda. Serangkaian senyawa yang homolog tidak dapat

dipisahkan dengan kromatografi adsorpsi ini karena pada bagian solute yang non-

polar tidak dapat berinteraksi dengan permukaan adsorben yang polar.

b. Kromatografi Partisi

Kromatografi jenis ini disebut juga dengan kromatografi fase terikat. Kebanyakan

fase diam kromatografi ini adalah silikayang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat.

Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silica adalah hidrokarbon-hidrokarbon non

polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil.

Tabel. Fase diam KCKT partisi yang beredar di pasaran

Jenis Nama Diameter ukuran Karakteristik:

 partikel (m) Kandungan
C*/bentuk/sifat
Oktadesil-silan (C18) Partisil ODS-1 10 C 5 %/ - / -
Partisil ODS-2 10 C 16 & / - / -
Zorbax-ODS 6 C 22 %/ bundar/-
Nucleosil C-18 5,10 -
Hypersil-ODS 5-7 C 8 %/ -/ -
- Bondapak 10 C 10 %/ -/ -
Lichrosorb RP-18 5,10 C 22 %/ - / -
Spherisorb ODS 5,10 - / bundar/ -
Oktasilan (C8) Lichrosorb RP-8 5,10 C 13-14 %/ - / -
Zorbax C-8 6 C 15 %/ bundar/ -
Nucleosil C-8 5,10 -
Fenil -Bondapak Fenil 10 C 16 %
Dimetilsilan Lichrosorb RP-2 5,10 -
Diol Lichrosorb DIOL 10 Polaritas lemah
Nitril -Bondapak CN 10 C 9 %/ polaritas
sedang
Partisil 10PAC 10 -
Spherisorb-CN 5 -
Zorbax-CN 6 -
Amino Lichrosorb NH2 10 Kepolaran tinggi
-Bondapak NH2 10 C9%
Zorbax NH2 6 Penukar anion lemah

Fase diam yang paling popular digunakan adalah oktadesilsilan dan kebanyakan

pemisahannya adalah fase terbalik. Berbagai macam fase diam KCKT partisi disajikan

pada tabel di atas.

Sebagai fase gerak adalah campuran methanol atau asetonitril dengan air atau dengan

larutan buffer. Untuk solute yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat

krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solute akan mengalami ionisasi atau

protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase

diam menjadi lebih lemah dibandingkan jika solute dalam bentuk spesies yang tidak

terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

c. Kromatografi Penukar Ion

KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan

suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian

yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Berbagai macam fase

kromatografi penukar ion yang beredar di pasaran ditunjukkan oleh tabel di bawah ini.

Jenis Nama Diameter Kekuatan Gugus fungsi

ukuran partikel
(m)
Penukar kation Lichrosorb 10 Kuat Asam sulfonat
(Pendukung KAT
silica) Nucleosil SA 5,10 Kuat Asam sulfonat
Partisil-10-SCK 10 Kuat Asam sulfonat
10 Lemah Asam karboksilat
(pendukung Seri Aminex A Beragam Kuat Asam sulfonat
resin) 5-12
Hamilton HC 7-10 Kuat Asam sulfonat
Penukar anion Chromega 10 Kuat Trimetilamonium
(pendukung bond-SAX
silica) Lichrosorb-AN 10 Kuat Trimetil
amonium
Partisil-SAX 10 Kuat Trimetil
amonium
Sorbax-SAX 6 Kuat Trimetil
amonium
Zorbax NH2 6 Lemah -Amino
Nucleosil NMe2 5,10 Lemah -N(CH3)2
(pendukung Chromex 11 Kuat Trimetil
resin) amonium
Hamilton HA 7-10 Kuat Trialkil amonium

Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air

karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-

alkohol dan juga pelarut organic. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi

puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionic serta oleh pH fase gerak.

Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solute. Hal ini disebabkan

oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus

penukar ion pada resin.

Jenis ion dalam fase gerak dapat berpengaruh secara nyata pada retensi solute sebagai

akibat dari perbedaan kemampuan ion fase gerak berinteraksi dengan resin penukar ion.

Urutan retensi dari berbagai anion untuk resin penukar anion polistirena berikatan silang

konvensional adalah sebagai berikut :

Sitrat > sulfat > oksalat> iodide> nitrat> kromat> bromide> sianida> klorida> format>

asetat> hidroksida > fluoride.

Urutan ini bervariasi jika resin yang digunakan berbeda, meskipun demikian urutan di atas

merupakan petunjuk kualitatif dari kemampuan berbagai anion untuk berinteraksi dengan

penukar anion kuat. Dalam urutan ini, sitrat akan terikat secara kuat dengan resin,

sementara ion fluuorida akan terikat paling lemah. Molekul sampel biasanya akan cepat

terelusi dengan ion sitrat daripada dengan ion fluoride. Urutan retensi serupa untuk resin

penukar kation adalah sebagai berikut :

Ba2+ > Pb 2+
> Sr2+ > Ca2+ > Ni 2+
> Cd2+ > Cu2+ > Co2+ > Zn 2+
> Mg2+ > UO22+> Te+ >

Ag+> Cs+> Rb+> K+> NH4+ > Na+> H+> Li+

d. Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permeasi gel dan dapat digunakan

untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan BM > 2000 Dalton. Fase diam yang

digunakan dapat berupa silica atau polimer yang bersifat porus sehingga solute dapat

melewati pori (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solute

yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian

molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini

disebabkan solute dengan BM yang besar tidak melewati pori, akan tetapi lewat diantara
partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak

terjadi interaksi kimia antara solute dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

Dua tipe bahan sebagai fase diam yang digunakan dalam kromatografi ini ialah gel dari

senyawa organic (polimer) dan silica gel yang mudah berinteraksi dengan polimer. Fase

diam yang lebih banyak digunakan adalah senyawa kopolimer dari stiren dan

difenilbenzena yang tidak disertau dengan gugus ionic sulfonat dan amina seperti pada

fase diam penukar ion.

Porositas yang terjadi tergantung pada terjadinya interaksi silang antara dua senyawa

tersebut. Berdasar atas struktur tersebut, maka fase diam bersifat hidrofobik, akan tetapi

dengan memasukkan gugus sulfonat, atau poliakrilik, maka fase diam akan menjadi

hidrofilik sehingga dapat juga digunakan untuk memisahkan molekul yang larut dalam air

seperti polisakarida. Berikut adalah beberapa fase diam yang dapat digunakan pada

kromatografi eksklusi ukuran.

- Sphadex, umumnya digunakan untuk pemisahan protein. Bahan disintesi dari

polisakarida seperti dekstran. Adanya residu gugus hidroksil menyebabkan dekstran

menjadi polar, sehingga dapat direaksikan dengan epiklorhidrin (CH2(O)CHCH2Cl).

Polimer yang terjadi dapat dikontrol dengan penambahan asam.

- Bio-Gel, golongan yang bersifat inert dinamakan Bio-Gel P, yang dibuat dengan

kopolimerisasi dari akrilamida dan N-N metil-bis-akrilamid. Senyawa ini tidak larut

dalam air maupun beberapa pelarut organic.

- Agarosa, digunakan untuk pemisahan senyawa berbobot molekul > 500.000,

dinamakan juga Bio-Gel A. Dibuat dari poligalaktopiranosa, sehingga agak lumak dan

tidak tahan tekanan tinggi.

- Stiragel, digunakan untuk pemisahan senyawa yang tidak larut sama sekali dalam air

dan menggelembung (swelling) dalam pelarut organic. Stiragel dibuat dari polistiren

yang tahan pada suhu di atas 150C. Berat molekul senyawa yang dapat dipisahkan

antara 16.000-40.000 Dalton.

7. Instrumentasi KCKT

Instrumentasi HPLC
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan
fasegerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.

Gambar 1. HPLC
 Gambar 2. Skema Instrumentasi HPLC

Gambar 3. Instrumen dasar HPLC

1. Wadah fase gerak pada KCKT

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah ini biasanya dapat
menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Sebelum menggunakan fase gerak
harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya
gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga
akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat pelarut pada fase gerak maka sangat
dianjurkan untuk menggunakan pelarut, bufer, dan reagen dengan kemurnian yang sangat
 tinggi dan lebih terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk KCKT
berderajat KCKT (HPLC grade).

2. Fase Gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri dari campuran pelarut yang dapat bercampur
yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi, yang ditentukan oleh
polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen
sampel.
Deret eluotrofik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan hal penting dalam
pemilihan fase gerak.
Adapun ciri-ciri yang harus dimiliki oleh fase gerak pada KCKT, yaitu :
1) Kemurnian tinggi (high purity), yaitu cairan eluen yang tidak terkontaminasi.
2) Kestabilan tinggi, yaitu eluen yang tidak bereaksi dengan sampel atau zat yang
berfungsi sebagai fase diam.
3) Kekentalan rendah, yaitu kerapatan eluen sekecil mungkin.
4) Dapat melarutkan sampel, tidak mengubah kolom dan sifat kolom serta cocok dengan
detektor.
Beberapa deret eluotropik KCKT :
Parameter Parameter
UV cut
kekuatan kekuatan
Pelarut off
pelarut pelarut
(nm)
(adsorbsi) (partisi)
n-heksana 0,01 0,1 195
Sikloheksana 0,04 -0,2 200
Tetraklorometan 0,18 1,6 265

Nilai pemenggalan UV merpakan panjang gelombang yang mana pada kuvet 1 cm,
pelarut akan memberi absorbasi lebih dari 1,0 satuan absorbansi. Sangat dianjurkan
untuk menggunakan panjang gelombang deteksi yang tidak bertepatan atau di sekitar
panjang gelombang pemenggalan UV pelarut yang digunakan sebagai fase gerak.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah
campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril.Untuk
pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah
 campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau
menggunakan pelarut jenis alkohol. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring
terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas
dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebabadanya gas akan berkumpul dengan
komponen lain terutama di pompa dan detektorsehingga akan mengacaukan analisis.

3. Pompa
Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu pompa kinerja konstan (constant pressure)
dan pompa pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat
dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating
menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh karena itu
membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar
(base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan
utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang
tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.
Tujuannya adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung
secara tepat.Ada 2 jenis pompa KCKT yaitu : pompa dengan tekanan konstan dan pompa
aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tekanan
konstan.
Syarat syarat pompa yang ideal:
a. Mampu membangkitkan tekanan tinggi
b. Pulse free out put
c. Control laju alir yang akurat
d. Tahan korosi
e. Terbuat dari bahan yang tahan terhadap fasa gerak
f. Bebas pulsa
g. Perlude gasser
h. Dapat menyalurkan fasa gerak pada rentang kecepatan dan tekanan lebar
i. Dapat digunakan untuk melakukan elusi gradien
j. Bekerja pada tekanan sampai 6000 psi (400 atm)
Tiga jenis pompa yang sering digunakan dalam sistem KCKT yaitu :
1) Pompa Bolak-balik (reciprocating pump)
Jenis pompa yang paling banyak digunakan. Kelebihan pompa jenis ini adalah
volume internalnya kecil sekitar 35 400 l, tekanan hingga 10.000 psi, kemampuan
 untuk adaptasi menggunakan elusi gradien, aliran yang konstan sehingga terbebas
dari tekanan balik kolom dan akibat dari kekentalan solven.
2) Pompa Sistem Penggantian (displacement pump)
Sistem penggantian menggunakan sebuah wadah besar seperti syringe dengan
sebuah penekan yang digerakan oleh motor. Menghasilkan aliran yang bebas
tekanan balik, tidak dipengaruhi kekentalan dan bebas denyut. Kekurangan pompa
jenis ini adalah kapasitas pompa terbatas hanya 250 ml dan cukup sulit saat solven
harus mengalami penggantian.
3) Pompa Tekanan Udara (pneumatic pump)
Bentuk paling sederhana sebuah pompa pneumatik merupakan wadah yang
ditekan oleh gas bertekanan tinggi. Harga relatif murah dan bebas denyut merupakan
kelebihan jenis pompa ini. Kekurangannya terletak pada kapasitas terbatas, tekanan
keluaran terbatas hanya sekitar 2000 psi, dipengaruhi oleh tekanan balik dan
kekentalan solven dan tidak dapat digunakan untuk sistem elusi gradien.

4. Injektor (penyuntikan sampel)

Sampel-sampel cair dan larutan

disuntikkan secara langsung kedalam fase
gerak yang mengalir dibawah tekanan
meuju kolom menggunakan alat
penyuntik yang terbuat dari tembaga
tahan karat dan katup teflon yang
dilengkapi dengan keluk sampel (sample
loop) internal atau eksternal.
Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana
mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak
sama halnya dengan kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya).
Pada saat pengisian, sampel digelontor melewati keluk sampel dan kelebihannya
dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan katup diputar sehingga fase gerak
mengalir melewati keluk sampel dan menggelontor sampel ke kolom. Presisi penyuntikkan
dengan keluk sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1 %. Penyuntikkan ini mudah
digunakan untuk otomatisasi dan sering digunakan untuk auto sampler pada KCKT.

Posisi pada saat memuat sampel Posisi pada saat menyuntik sampel

Injektor merupakan tempat untuk memasukkkan sempel ke kolom. Waktu yang

dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut
sebagaiwaktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan
sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda.
Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut) kondisi
dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel)
komposisi yang tepat dari pelarut temperatur pada kolom 1. Elusi Gradien Elusi Gradien
didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis kromatografi
berlangsung.
 Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang
tertahan kuat pada kolom. Dasar- dasar elusi gradien dijelaskan oleh Snyder. Elusi Gradien
menawarkan beberapa keuntungan :
a. Total waktu analisis dapat direduksi
b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah
c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)
d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak

5. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Perbandingan kedua kolom dapat dilihat di bawah ini :
Parameter Kolom konvensional Kolom mikrobor
Tabung Stainless steel Stainless steel
kolom Panjang 3,10,15,20 dan Panjang 25 dan 50 cm
25 cm Diameter luar 0,25 inci
Diameter luar 0,25 inci Diameter dalam 1 atau 2 mm
Diameter dalam 4,6 cm
Fase diam Porous, silika ukuran Porous, silika ukuran kecil,
kecil, silika yang silika yang dimodofikasi
dimodofikasi secara secara kimiawi (bonded
kimiawi (bonded phase), atau polimer-polimer
phase), atau polimer- stiren/divinil benzen.Rata-rata
polimer stiren/divinil diameter partikel 3,5 atau
benzen.Rata-rata 10m dengan kisaran sempit.
diameter partikel 3,5
atau 10m dengan
kisaran sempit.
 Tekanan 500-3000 psi 1000-5000 psi
operasional (35-215 bar (70-350 bar)

Fase gerak Hidrokarbon+pelarut Hidrokarbon+pelarut

terklorinasi atau alkohol terklorinasi atau alkohol untuk
untuk fase normal. fase normal. Untuk fase
Untuk fase terbalik terbalik (reversed phase)
(reversed phase) digunakan metanol atau
digunakan metanol atau asetonitril + air atau
asetonitril + air atau bufer.Kecepatan alir 10-100
bufer.Kecepatan alir : l/menit.Modifikasi instrumen
1-3 ml/menit Sistem penghantaran pelarut
yang mampu memberikan
kontrol aliran di bawah
10l/menit.Katup injeksi
sampekl bervolume kecil;sel
detektor bervolume kecil.
Kinerja Efisiensi meningkat Sangat efisiensi dan sensitif,
dengan bekurannya akan tetapi lambat,konsumsi
ukuran partikel fase fase gerak hanya dari kolom
diam, akan tetapi umur konvensional.
kolom dengan ukuran
partikel 3 m lebih
pendek.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibandingkan dengan kolom
konvensional, yakni :
Konsumsi fase gerak mikrobor hanya 80% atau lebhi kecil dibandingkan dengan kolom
konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-
100 l/menit)
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika
digabung dengan spektrometer massa.
 Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis
kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Kolom KCKT secara umum dibuat dari bahan tabung stainless steel, walaupun untuk
tekanan di bawah 600 psi kolom kaca dapat digunakan. Kolom untuk analisis KCKT
memiliki ukuran panjang kolom berkisar dari 10 30 cm berbentuk lurus dan jika
diperlukan dapat disambung dengan kolom yang lain. Diameter dalam kolom 4 10 mm
dengan ukuran partikel 5 10 m. Kolom dari jenis ini mempunyai 40.000 hingga 60.000
lempeng/meternya.
Saat ini, pabrik pembuat kolom telah merancang dan memproduksi kolom dengan
kecepatan dan kinerja tinggi. Beberapa kolom hanya memiliki panjang 1 hingga 4,6 cm
dengan ukuran partikel 3 5 m. Beberapa jenis kolom memiliki jumlah lempeng hingga
100.000 hanya dengan panjang 3 sampai 7,5 cm dengan kelebihan pada kecepatan dan
sedikitnya solven yang diperlukan dalam pemisahan. Jumlah solven minimum menjadi
pertimbangan penting karena mahalnya solven dengan tingkatan kromatografi
(chromatography grade).
Dua jenis kolom digunakan dalam kromatografi cair yaitu jenis pellicular dan partikel
berpori (porous particle). Jenis pellicular terdiri dari partikel dengan bentuk bola, tidak
berpori berbahan dasar gelas atau polimer dengan diameter 30 hingga 40 m. Lapisan tipis
berpori silika, alumina, divinil benzen sintetis polystirena atau resin penukar ion dilapiskan
pada permukaannya.
Jenis kolom dengan partikel berpori berisi partikel berpori dengan diameter partikel 3
10m terbuat dari silika, alumina, resin sintetis divinil benzen polystirena atau resin penukar
kation yang kemudian dilapisi lapisan tipis film berbahan organik sehingga berikatan secara
kimia atau fisika terhadap permukaannya. (Skoog et al., 1998)
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom
konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali
(reusable). Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis
sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan. Kolom diisi
dengan partikel padatan yang berukuran kecil dilapisi secara kimia oleh suatu cairan yang
 berfungsi sebagai fasa diam. Komponen-komponen sample dibawa oleh cairan fasa gerak
yang dialirkan dengan bantuan tekanan tinggi melewati kolom fasa diam.
Komponen- komponen dipisahkan berdasarkan partisi antara fasa diam dan fasa gerak
yang satu sama lain tidak bercampur. Efisiensi kolom salah satunya sangat tegantung dari
besarnya partikel fase stasioner. Oleh karena itu bila ukuran fase stasioner lebih kecil, maka
tinggi plat teoritik akan berkurang, sehingga jumlah plat teoritik akan bertambah, yang
meningkatkan efisiensi kolom. Dengan kolom yang pendek dan efisiensi, pemisahan akan
berjalan dengan cepat.
Terdapat banyak analisis yang dikerjakan pada suhu kamar, suhu kolom sering dapat
diatur dengan konstan dengan memakai cara pemanasan. Sering dibutuhkan suhu kolom
yang lebih tinggi dari suhu kamar untuk mengatasi masalah daya larut solute yang dianalisis
dan viskositas fase gerak yang agak tinggi.

6. Fase diam
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi,
silika yang tidak dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.Permukaan
silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).

Silika yang dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen yang akan
bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Hasil reaksi yang diperoleh disebut dengan silika fase terikat yang stabil terhadap hidrolisis
karena terbentuk ikatan-ikatan siloksan (Si-O-O-Si). Silika yang dimodifikasi ini mempu
karekateristik kromatografi dan selektifitas yang berbeda jika dibandingkan dengan silika
yang tidak dimodifikasi.
Oktadesil silika (ODS atau C18 )merupakan fase diam paling sering digunakan karena
mampu memisahkan senyawa-senyawa denngan kepolaran yang rendah, sedang maupun
tinggi.
Solut-solut yang polar, terutama yang bersifat basa akan mengekor (tailing peak) pada
penggunaan fase diam silika fase terikat. Hal ini disebabkan oleh adanya interaksi adsorbsi
antara solut-solut ini dengan residu silanol dan pengotor logam pada silika.Masalah ini dapat
diatasi dengan end-chapping yakni proses menutupi residu silanol ini dengan gugus-gugus
 trimetilsilil dan menggunakan silika dengan menggunakan silika dengan kemurnian yang
tinggi (kandungan logam <1ppm)

7. Detektor KCKT
Detektor pada KCKT dikelompokkan dalam 2 golongan yaitu : detektor universal (yang
mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik dan tidak bersifat selektif)
seperti detektor indeks bias dan detektro spektrometri massa; dan golongan detektor yang
spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif seperti detektor UV-
Vis, detektor Fluoresensi dan elektrokimia.
Detektor ideal pada sistem KCKT mempunyai persyaratan :
Memiliki sensitifitas yang memadai. Kisaran umum sensitifitas berkisar dari 10-
8 hingga 10-15gram zat terlarut per pembacaan
Stabil dan memiliki keterulangan yang baik
Respon yang linear terhadap kenaikan konsentrasi
Waktu respon yang singkat
Kemudahan pada penggunaan
Memiliki volume internal yang kecil untuk mengurangi pelebaran puncak
Suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut :
Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel
Mempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang
sangat kecil.
Stabil dalam pengoperasiannya
Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
Untuk kolom konvensional, selnya bervolume 8l atau lebih kecil, sementara kolom
mikrobor selnya bervolume 1 l atau lebih kecil lagi.
Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang
luas (kisaran dinamis linier).
Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Beberapa jenis detektor yang digunakan pada sistem KCKT :

1) Detektor Absorban (UV-Vis)
Pada detektor absorban, aliran akan mengalir melalui detektor dari kolom kromatografi.
Untuk meminimalkan pelebaran puncak, detektor dirancang dalam volume yang sekecil
mungkin. Ukuran volume dibatasi 1 10 l dengan panjang sel 2 10 mm. Umumnya sel
detektor mampu menahan tekanan hingga 600 psi sehingga peralatan pengurang tekanan
diperlukan sebelum aliran memasuki detektor.
2) Detektor Fluorescens
Detektor fluorescens yang digunakan sama halnya dengan detektor pada spektrofluoro-
fotometer. Detektor paling sederhana menggunakan lampu merkuri sebagai sumber cahaya
dan filter untuk mengisolasi panjang gelombang emisi radiasi. Lampu Xenon digunakan
pada instrumen yang lebih baik dengan gratting sebagai monokromatornya.
3) Detektor Refraktif Indeks
Detektor jenis ini bekerja dengan mengukur nilai indeks bias yang senyawa yang melalui
sel. Sel akan mengukur indeks bias solven fasa gerak sebagai blanko dan sampel secara
bersamaan untuk mendapatkan nilai indeks bias relatif.
4) Detektor Elektrokimia
Detektor dengan mendasarkan kerjanya pada pengukuran arus listrik. Perubahan arus akan
dideteksi terhadap waktu dan ditampakkan dalam bentuk kromatogram. Contoh penggunaan
detektor adalah pada penetapan senyawa tiol dan disulfida.
5) Detektor Spektra Massa
Sejumlah fraksi kecil cairan dari kolom dimasukkan ke dalam spektrometer massa pada
kecepatan alir 10 50 l per menit atau menggunakan termospray. Analit akan
diionisasikan, dipisahkan pada analisator, dibaca oleh detektor dan menghasilkan spektrum
massa.

Karakteristik beberapa detektor

Detektor Sensitifitas Kisaran Karakteristik
(g/ml) linier
Absorbansi Uv-
vis 5 x 10-10 104 Sensitivitas bagus,
Fotometer filter 5 x 10-10 105 paling sering
Spektrofotometer > 2 x 10-10 105 digunakan, selektif
spektrometer terhadap gugus-gugus
photo-diode dan struktur-struktur
array yang tidak jenuh.
 Fluoresensi 10-12 104 Sensitifitas sangat
bagus, selektif, Tidak
peka terhadap
perubahan suhu dan
kecepatan alir fase
gerak.
Indeks bias 5 x 10-7 104 Hampir bersifat
universal akan tetapi
sensitivitasnya sedang.
Sangat sensitif terhadap
suhu, dan tidak dapat
digunakan pada elusi
bergradien
Elektrokimia
Konduktimetri 10-8 104 Peka terhadap
Amperometri 10-12 105 perubahan suhu dan
kecepatan alir fase
gerak, tidak dapat
digunakan pada elusi
bergradien. Hanya
mendeteksi solut-solut
ionik. Sensitifitas
sangat bagus, selektif
tetapi timbul masalah
dengan adanya
kontaminasi elektroda.

8. Prosedur Kerja Umum

Mula-mula solven diambil melalui pompa. Solven ini dikemudian masuk ke dalam katup
injeksi berputar, yang dipasang tepat pada sampel loop. Dengan pertolongan mikrosiring,
sampel dimasukan ke dalam sampel loop yang kemudian bersama-sama dengan solven
masuk ke dalam kolom. Hasil pemisahan dideteksi oleh detector, yang penampakannya
ditunjukan oleh perekam (pencatat = recorder). Tekanan solven di atur dengan pengatur
dan pengukur tekanan. Pompa pemasuk solven pada tekanan konstan hingga tekanan
kurang lebih 4500 psi dengan laju alir rendah, yakni beberapa milliliter per menit.
Rekorder menghasilkan kromatogram zat-zat yang dipisahkan dari suatu sampel.
Tahap pemekatan dengan ekstraksi solven dan penguapan untuk memperkecil volum
sering kali diperlukan sebelum pengerjaan sampel dengan HPLC. Hal ini terutama sering
 dilakukan untuk analisis senyawa-senyawa hidrokarbon aromatic polisiklik (PAH) atau
residu pestisida dalam makanan.
Sebagai alternative lain, sampel air dapat di absorpsi oleh suatu adsorben padat (C8 atau
C18 yang terikat pada silica gel), diikuti dengan desorpsi dalam suatu solven yang
kemudian langsung dimasukan kedalam kolom. Suatu solven dengan polaritas rendah,
misalnya CH3 berair yang secara bertingkat mengalami perubahan menjadi CH3OH
murni, menjamin pemisahan yang baik pada C-18 yang terikat pada silica gel.

9. Seleksi Tipe KCKT

Analisis (pengguna KCKT) sebelum mengoperasikan KCKT, harus membuat

keputusan tipe yang mana yan gharus dipilih yang dapat memberikan informasi yang

diinginkan.

Skema I : Seleksi tipe KCKT adalah suatu petunjuk umum untuk seleksi tipe KCKT .

Informasi ini akan memudahkan para analis untuk memutuskan pemelihan tipe KCKT

yang memberikan para analis untuk memutuskan pemilihan tipe KCKT yang

memberikan kemungkinan terbaik pada pemisahaan yang diinginkan. Namun,

sampel yang tidak dikenal (unknown) akan menyulitkan pemilihannya tipe KCKT.

Informasi seperti kelarutan, gugus fungsi yang ada, besarnya Berat Molekul

dapat diperoleh dari pembuat informasi, pemberi sampel, atau data spektroskopik

seperti nucleic magnetic resonance Spectrosphotometer, infra red

spectrophotometer, ultra violet spectrumeter, dan mass

Spectrophotometer. Semua data-data ini dapat digunakan sebagai petunjuk

bagi analis memilih tipe HPLC yang tepat untuk digunakan.

Dengan berpedoman pada Hukum Dasar "like dissolves like" maka sangat mudah

untuk memutuskan tipe KCKT yang akan dipilih.

Dari Skema 1 : Seleksi tipe KCKT,

dengan cepat kita dapat melihat bahwa Berat Molekul (BM) lebih besar dari 2000,

maka kita dapat menggunakan kromatografi eksklusi. Fasa geraknya adalah air jika

sampelnya larut dalam air; bila dapat larut dalam pelarut organik maka digunakan pelarut-

pelarut organik sebagai rasa gerak. Fasa diamnya adalah Sephadex atau

(Bondagel Seri E untuk rasa gerak air dan Styragel atau MicroPak TSK gel untuk rasa

gerak organik.
Bila BM lebih rendah dari 2000, pertama yang harus ditentukan

adalah apakah sampel dapat larut dalam air. Bila sampel dapat larut dalam air,

maka kromatografi partisi rasa terbalik atau kromatografi penukar ion dapat

digunakan. Bila kelarutan dipengaruhi oleh penambahan asam atau basa atau bila

pH larutan bervariasi lebih dari 2 (dua) satuan pH dari pH 7, maka kromatografi

penukar ion adalah pilihan utama.

Bila kelambatan tidak dipengaruhi oleh asam dan

basa dan larutan sampel adalah netral, maka kromatografi partisi rasa terbalik

adalah pilihan terbaik. Tipe Eksklusi menggunakan ukuran poros yang kecil dan rasa air dapat

juga dicoba. Bila sampel tidak larut dalam air, kromatografi partisi atau kromatografi

padat cair dianjurkan untuk digunakan. Untuk pekerjaan rutin disarankan

menggunakan kromatografi partisi fasa terikat normal karena kolom-kolom ini tidak

begitu rumit dalam perawatannya setelah digunakan. Untuk sampel-sampel isomer

kromatografi padat cair lebih baik digunakan. Bila sampel memiliki perbedaan ukuran

partikel yang besar, kromatografi eksklusi sterik dengan fasa gerak organik dapat

juga digunakan.

10. Derivatisasi pada KCKT

Detektor yang paling banyak digunakan dalam KCKT adalah detector UV-Vis sehingga

banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus kromofor

yang akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Di samping itu, juga

dikembangkan suatu metode untuk menghasilkan fluorofor (senyawa yang mampu

berfluoresensi) sehingga dapat dideteksi dengan fluorometri.

 Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yakni : produk

yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar UV atau sinar tampak atau dapat

membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri;

proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100%);

produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi serta sisa

pereaksi untuk derivatisasi harus tidak mengganggu pemisahan kromatografi.

Derivatisasi pada KCKT dapat dilakukan baik sebelum masuk ke kolom (pre column

derivatization) atau setelah kolom (post-column derivatization). Pada derivatisasi sebelum

kolom, analit diderivatisasi lebih dahulu sebelum diinjeksikan ke dalam kromatografi,

sementara itu pada derivatisasi setelah kolom, analit diinjeksikan dahulu ke dalam kolom

lalu diderivatisasi setelah keluar dari kolom (akan tetapi belum mencapai detector).

Meskipun derivatisasi ditujukan untuk meningkatkan sifat kromatografi, akan tetapi di sini

lebih ditujukan untuk deteksi analit.

11. Analisis Kuantitatif

a. Metoda Persentase Tinggi / Lebar Puncak

Metoda ini disebut juga Metoda Normalisasi Internal. Untuk analisis kuantitatif

diasumsikan bahwa lebar atau tinggi Puncak (Peak) sebanding (proportional) dengan

kadar / konsentrasi zat yang menghasil puncak. Dalam metoda yang paling

sederhana diukur lebar atau tinggi Puncak, yang kemudian dinormalisasi (ini berarti

bahwa setiap lebar atau tinggi Puncak diekspresikan sebagai suatu persentase dari

total). Hasil normalisasi dari lebar atau tinggi puncak memberikan komposisi dari

campuran yang dianalisis, seperti contoh pada Tabel 5.1. berikut:

 Ada dua masalah dengan pendekatan ini, yaitu:

Kita harus yakin bahwa kita telah menghitung semua komponen, yang tiap-tiap

komponen muncul sebagai suatu puncak yang terpisah pada kromatogram.

Komponen-komponen dapat berkoelusi, atau ditahan di dalam kolom, atau ,terelusi

tanpa terdeteksi.

Kita harus mengasumsi bahwa kita memperoleh respons detektor yang sama untuk

setiap komponen Untuk mengatasi kesulitan ini, maka kalibrasi detektor diperlukan.

b. Metoda Baku Luar (External Standard Method)

Pada metoda ini kita membuat suatu Baku/ Standard yang mengandung

senyawa /senyawa-senyawa yang akan ditetapkan kadarnya, idealnya jumlah baku

sama dengan jumlah bahan yang akan dianalisis, dan kita membandingkan

kromatogram baku dengan kromatogram sampel. Dan kromatogram baku dapat

dihitung suatu respons faktor untuk setiap Puncak yang diinginkan, respons faktor

memberi intormasi tentang konsentrasi komponen yang dihasilkan oleh satuan

respons detektor (unit detector respons)

 Kemudian untuk kromatogram sampel kita dapat menghitung konsentrasi dari

setiap komponen yang diinginkan dengan cara mengalikan (multiplikasi) tinggi atau

lebar puncak dengan respons faktor.

Bila bekerja dengan metoda ini, respons detektor harus tinier untuk setiap

senyawa pada kisaran (range) konsentrasi yang digunakan, dan juga kita harus

menginjeksikan (bila secara manual) jumlah yang sama untuk setiap komponen

pada kedua kromatografi, sehingga berhasilnya operasi dari metoda ini tergantung

pada kemampuan menginjeksi sampel dengan presisi yang bagus.

Contoh Penetapan Kadar Benzoat dalam Sirup dengan KCKT

Kolom : Zorbax 5 C 18,25 x 4,6 cm

Fasa Gerak : CH3CN/0,005 mol dm-3 pH 4,5 dapar asetat (15:85)

Kecepatan Alir : 1,5 cm3 min-1; suhu 40C

Detektor : UV absorpsi 254 nm

Gambar 5. 1. menunjukkan beberapa hasil yang diperoleh pada penetapan

kadar benzoat yang ditambahkan sebagai suatu preservatif di dalam sirup.

Kromatogram adalah standar Natrium Benzoat (konsentrasi 0,07308 g dm-3 di

dalam rasa gerak), Kromatogram A adalah sirup (konsentrasi 90,6726 g dm-3 dalam

rasa gerak). Kedua Kromatogram direkam dengan sensitivitas detektor yang sama.

Lebar Puncak diukur menggunakan suatu integrator, yang mencetak (memprint)

angka proporsional antara konsentrasi dengan lebar Puncak. Waktu retensi Benzoat pada

sirup sama dengan waktu retensi Benzoat standar. Lebar Puncak Benzoat yang diperoleh

untuk : standar 103 741 Sampel sirup 72859 pada sirup sama dengan waktu retensi Benzoat

standar.

Menghitung persentase (dalam berat) untuk benzoat preservatif di dalam sirup

adalah :

Maka Konsentrasi Benzoat dalam sirup = 72859 x 7,044 x 19-4 = 51,32 ppm

Sebelum dianalisis sirup telah diencerkan dengan rasa gerak sampai 1000 ml,maka

konsentrasi benzoat sebenarnya adalah :

c. Metoda Baku Dalam (Internal Standard Method)

Dalam metoda ini kita menambahkan ke dalam sampel sejumlah tertentu

(jumlah yang diketahui) Zat standar (Baku Dalam). Kromatogram yang diperoleh

dibandingkan dengan kromatogram sampel atau campuran senyawa dalam sampel.

Metoda ini mempunyai keuntungan dibanding dengan metoda baku luar karena, ia

mengkompensasi variasi volume injeksi dan juga untuk perubahan yang kecil dari

sensitivitas detektor atau perubahan krornatograti yang bisa terjadi. Karena kita

tidak perlu menginjeksi dalam jumlah yang sarna setiap waktu, maka metoda ini

biasanya mempunyai presisi yang lebih baik dari pada menggunakan baku luar. Dari

kromatogram standar dapat dihitung respons faktor relatif sebagai berikut :

Di dalam campuran sampel digunakan rumus berikut :

 Pendekatan lain adalah mengkoreksi setiap lebar puncak pada campuran

yang diketahui dengan mengalikannya dengan respons faktor relatif. Hal ini

menghasilkan lebar Puncak yang diperoleh dengan respons detektor yang sama. untuk

setiap komponen. Komposisi dari campuran kemudian diperoleh dengan

normalisasi lebar Puncak yang telah dikoreksi. Untuk bekerja dengan metoda ini

sekali lagi kita harus yakin bahwa kita telah melihat semua komponen di dalam

campuran sebagai sebagai Puncak-puncak yang terpisah pada kromatogram.

12. Aplikasi KCKT dalam Bidang Farmasi

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan suatu metoda pemisahan

canggih dalam analisis farrnasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji

kemumian dan penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawasenyawa

yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak

bisa dianalisis dengan Kromatografi Gas. Banyak senyawa yang dapat dianalisis,

dengan KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa organik

makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat /bahan obat campuran rasemis

optis aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral (chirale Trennphasen) yang

mampu menentukan rasemis dan isomer aktif.

Pada Farmakope Indonesia Edisi III Tahun 1979 KCKT belum digunakan

sebagai suatu metoda analisis baik kualitatif maupun kuantitatif. Padahal di

Farmakope negara-negara maju sudah lama digunakan, seperti Farmakope Amerika

Edisi 21 (United State of Pharmacopoeia XXI), Farmakope Jerrnan Edisi 10 (Deutches

Arzneibuch 10). Pada Farmakope Indonesia Edisi IV Tahun 1995 sudah digunakan KCKT
 dalam analisis kualitatif maupun kuantitatif dan uji kemumian sejumlah 277 (dua ratus

tujuh puluh tujuh) obat/bahan obat.

Perubahan yang sangat spektakuler dari

Farmakope Indonesia Edisi IV Tahun 1995 ini menunjukkan bahwa Pemerintah

Indonesia melalui Departemen Kesehatan Republik Indonesia dan Direktorat Jenderal

Pengawasan Obat dan Makanan benar-benar telah mengikuti perkembangan dan

kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi canggih dalam bidang analisis obat.

Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat

mahal, namun metoda ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277 jenis obat

/ bahan obat karena hasil analisis yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi,

waktu analisis cepat.

APPLICATION

Informasi yang bisa diperoleh menggunakan KCKT termasuk identifikasi, penetapan kadar
dan resolusi dari suatu senyawa atau komponen. KCKT preparatif merujuk pada proses isolasi
dan purifikasi senyawa. Hal ini berbeda dari KCKT analitik, dimana tujuan utamanya adalah
untuk mendapatkan informasi tentang senyawa sampel.

a. Pemisahan Kimiawi

Hal ini berdasarkan fakta bahwa komponen tertentu memiliki perbedaan kecepatan
migrasi pada kolom tertentu dan fase gerak, jumlah atau derajat pemisahan kebanyakan
ditentukan oleh pemilihan fase diam dan fase gerak.

b. Pemurnian

Pemurnian merupakan proses pemisahan atau ekstraksi senyawa target dari campuran
senyawa atau kontaminannya. Setiap senyawa menunjukkan puncak karakteristik dibawah
kondisi kromatografik tertentu. Migrasi senyawa dan kontaminan melalui kolom harus cukup
berbeda sehingga senyawa murni yang diinginkan bisa dikumpulkan atau diekstraksi tanpa
adanya senyawa lain yang tidak diinginkan.

c. Identifikasi

Umumnya pengujian senyawa menggunakan KCKT. Parameter dari pengujian ini harus
diperoleh puncak yang bersih dari sampel yang diketahui yang diambil dari kromatograf.
Puncak yang diiedntifikasi harus memiliki waktu retensi yang reasonable dan harus
dipisahkan dengan bak dari puncak tambahan pada tingkat detensi dimana pengujian
dilaksanakan.

d. Aplikasi lain dari KCKT

Aplikasi lain dari KCKT termasuk :

1. Aplikasi Farmasi
- Studi disolusi tablet dari bentuk sediaan farmasi
- Penentuan Shelf-life dari produk farmasi
- Identifikasi bahan aktif dari bentuk sediaan
- Pengawasan mutu farmasi
2. Aplikasi pada Lingkungan
- Deteksi senyawa fenolik pada air minum
- Identifikasi difenhidramin pada sampel endapan
- Bio-monitoring dari polutan
3. Forensik
- Kuantifikasi obat dalam sampel biologi
- Identifikasi steroid anabolic dalam serum, urin, keringat dan rambut
- Analisis forensic pada pewarna tekstil
- Determinasi kokain dan metabolitnya dalam darah
4. Klinis
- Kuantifikasi ion dalam urin manusia
 - Analisis antibiotic dalam plasma darah
- Estimasi bilirubin dan bilivirdin dalam plasma darah pada kasus gangguan hepatic
- Deteksi neuropeptida endogen dalam cairan ekstraselular di otak. brain.
5. Makanan dan Perisa
- Memastikan kualitas minuman ringan dan air minum
- Analisis bir
- Analisis gula dalam jus buah
- Analisis senyawa polisiklik dalam sayuran
- Analisis cemaran dalam bahan ledak militer dalam hasil pertanian.

Contoh Aplikasi Pemisahan Peptida dan Protein Dengan Rp-HPLC

Kondisi Awal Yang Bisa Digunakan:

VARIABEL PEPTIDA PROTEIN
Kolom
Bonded phase C18 atau C8 C4, C3, CN
Dimensi 0,46 X 15 atau 25 cm 0,46 x 5-15 cm
Partikel 3,5-10 m (diameter) 3,5-10 m (diameter)
80-300 A (Angstrom) (pori) 300 A (Angstrom) (pori)
Fase gerak
Solven A 0,12% TFA/air 0,12% TFA/air
Solven B 0,10%TFA/air 0,10%TFA/air
Gradien 0-60% B/60 menit 0-60% B/60 menit
Temperatur 40 80 C 40 80 C
Kecepatan alir 0,5 2 mL/menit 0,5 2 mL/menit
Ukuran sampel
Volume 10-50 L 10-50 L
Berat 1-100 g 1-100 g

Problem yang mungkin muncul:

Bentuk pita yang jelek : melebar, tailing
Recovery rendah
Timbul pita yang misterius
 Pita ganda untuk satu jenis analit
Performance kolom berubah, tr tidak reprodusibel
Faktor penyebab:
Kolom rusak, terlalu asam, terlalu hidrofob, terlalu kecil ukuran pori-porinya
Denaturasi sampel
Isomerisasi (cis ke trans)
Pengatasannya:
Pemisahan pada pH rendah (fase gerak 0,1 % Tetra fluoro Acid..apa yang dimaksud
Trifluoro acetic acid (TFA) )
Gunakan asetonitril sebagai solven organik. Untuk sampel yang hidrofob gunakan
propanol
Analisis dikerjakan pada temperatur kolom 50 80 C
Gunakan Zwitterionic detergent

Contoh aplikasi pemisahan peptida dan protein dengan ion exchange HPLC:

Kondisi yang bisa digunakan:

VARIABEL PROTEIN ASAM PROTEIN BASA
(ANION EXCHANGE) (CATION EXCHANGE)
Kolom
Bonded phase DEAE, SAX, PEI CM, SP
Ukuran 5-25 x 0,46cm 5-25 x 0,46 cm
Fase gerak
Solven A 10mm tris atau phosphat (pH 8) 10 mM bis-tris atau fosfat (pH
Solvent A + 0,5 mM NaCl atau 6)
Na-asetat Solvent A + 0,5 mM NaCl atau
Solven B 0-100% B dalam 30 menit Na-asetat
0-100% B dalam 30 menit
Gradien
Temperatur 35 C 35 C
Kecepatan alir 1,0 mL/menit 1,0 mL/menit
Ukuran sampel
Volume 10-50 L 10-50 L
Berat
1-100 g 1-100 g
Keuntungan:
Konformasi protein tetap terjaga,
Kemungkinan denaturasi kecil,
Dapat digunakan untuk isolasi dan purifikasi protein dengan tetap berbentuk bioaktif
Protein basa biasa memakai cation exchange, dengan pH 3
Problem yang sering muncul:
Recovery rendah dan dapat diatasi menggunakan gradien elusi dengan fase gerak
mengandung garam.

Contoh analisis campuran aspartam, benzoat dan kafein dengan RP-HPLC:

Variabel Kondisi

Fase diam C18, panjang 15 cm, i.d dan ukuran partikel??

Fase gerak A : asam asetat 0,02 M dalam air pH 4,0; B :

asetonitril

Elusi 85 % A dan 15 % B, kecepatan alir 1 mL/menit

Temperatur Temperatur kamar

Detektor Spektrofotometer UV 254 nm

Volume injeksi 20 L

Perhitungan Teknik standar eksternal

Penggunaan metode KCKT untuk analisis dalam bidang farmasi :

Obat (sediaan) Fase diam Fase gerak Detektor
Adrenalin HCl C18 MeOH-buffer UV 280 nm
(injeksi) (380:620); buffer
disiapkan dari 7,8 g
KH2PO4 dan 0,4 g
natrium dosunat. pH
diatur 3,8 dengan
H3PO3
Adriamisin (serum) C18 Asetonitril-asam Fluoresen
fosfat 0,01 N pH 2,3 Ek : 465 nm
(50:50) Em : 580 nm
Aktinomisin (serbuk) C18 CH3CN-H2O (1:1) Elektrometer
Aldosteron (urin) Silika Metanol 1,5 % dalam UV 254 nm
kloroform (50 %
dijenuhi air)
Allopurinol (serbuk) Silika CH2Cl2-Metanol (1 % UV 254 nm
NH4OH) (99 :1)
Allopurinol (tablet) C18; 4 x 30 cm KH2PO4 0,05 M; 1,5 UV 254 nm
mL/menit
Amfetamin sulfat C18 Buffer methanol (3:2) UV 254 nm
; buffer-1,1 g 1-
heptansulfonat, 25 ml
asam asetat 14% lalu
ditambah dengan 575
ml H2O
Amikasin (serbuk) C18; 0,46 x 25 cm, 5 Buffer-metanol UV 340 nm
m, 30C (28:72); Buffer
KH2PO4 2,7 g/L pH
6,5
Amikasin (serum) C18 Asetonitril-air-asam UV 365 nm
asetat (470:530:1)
Amilorid (tablet) C18; 0,39 x 30 cm H2O-MeOH-buffer UV 350 nm
(71:25:4); buffer -
KH2PO4 136 mg/ml
pH 3,0
Aminofilin (serbuk) C18 ; 0,39 x 15 cm 200 ml MeOh, 960 UV 254 nm
mg 1-
pentasulfonat/L, pH
diatur 2,9 dengan
asam asetat
Amoksisilin (kapsul) C18 H2O-MeOH-asam Amperometri
asetat (75:24:1)
Antipirin (Plasma) C18 Metanol-air (50:50) UV 254 nm
Asam-asam amino C18 Gradien Fluoresen
(parenteral)
Asam benzoate dan C18 Metanol- KH2PO4 UV 254 nm
asam salisilat (salep) 0,02 M pH diatur 6,2
(10:90)
Asam aminobenzoat Fenil ; 0,39 x 30 cm MeOH-asam asetat- UV 280 nm
(gel) H2O (30:1:69);
kecepatan alir 1
mL/menit
Asam klavulanat C18 ; Nucleosil Metanol-fosfat pH 6- UV 235 nm
H2O (15:1:84);
kecepatan alir 1
ml/menit
Asetaminofen C18; 0,39 x 30 cm Akuades-metanol UV 243 nm
(kapsul) (3:1); kecepatan alir
1,5 ml/menit
Asetaminofen dengan C18; 0,46 x 10 cm Air-metanol-asam UV 275 nm
aspirin dan kafein asetat (69:28:3);
(kapsul) kecepatan alir 2,0
ml/menit; 45C
Asetosal (tablet) C18 H2O-CH3CN-1- UV 280 nm
heptasulfonat
(850:150:2 g); pH
diatur sampai 3,4
dengan asam asetat
Asetosal serbuk C18 CH3CN- H2O, UV 220 nm
gradien
Asiklovir (serbuk) C18; 4,2 x 30 cm Natrium asetat 0,005 UV 254 nm
M, natrium
heptansulfonat
0,0025 M
Benzalkonium Siano, Sorbax H2O-THF- UV 215 nm
(perawatan mata) trietanolamin
(2500:1500:2)
Betametason (tablet) Silika n-heksan-CH2Cl2- UV 240 nm
isopropil alkohol
(100:100:4)
Dekstrometorfan C18 CH2Cl2- UV 280 nm
(sirup) MeOH(amoniak 1 %)
(98:2)
Diazepam (kapsul) C18 Metanol-air (65:35) UV 254 nm
Diltiazem (serbuk) Silika Metilen klorida- UV 254 nm
etilasetat (100:9)
Etambutol D-fenil glisin n-heksan-isopropil UV 235 nm
alkohol (75:25);
kecepatan alir 1
ml/menit
Fenobarbital (tablet) C18 Metanol-buffer (2:5); UV 254 nm
buffer : 6,6 gram
 natrium asetat dan 3
ml asam asetat/L air;
pH 4,5
Fenitoin (injeksi) C18 Metanol-air (45:55) UV 254 nm
Haloperidol (serbuk) Silika Metilen klorida- UV 254 nm
metanol (amoniak 1
%) (95:5)
HCT (plasma) C18 Metanol-asam asetat UV 228 nm
0,01 M (15:85)
Ibuprofen Cyclobond I CH3CN UV 254 nm
trietanolamin 0,01%
(3:2); pH 4,0;
kecepatan alir 0,6
ml/menit
Kafein (serbuk) Silika 5 m Metilen klorida- UV 254 nm
MeOH (amoniak 1
%) (98:2)
Kodein (dalam sirup C18 Metanol-kalium UV 254 nm
batuk) dihidrogen fosfat 0,05
M (13:87)
Kinin (serbuk) Silika 5 m Isooktan-dietil eter- UV 279 nm
metanol-dietilamin-
air
(400:325:225:0,5:15)
; kecepatan alir 2,0
ml/menit
Metronidazol C18 Buffer-metanol UV 320 nm
(injeksi) (93:7); buffer -0,68 g
kalium dihidrogen
fosfat pH 4,0 dalam
930 ml air
Prednison (serbuk) C18 H2O-MeOH-THF UV 254 nm
(688:62:250)
Pseudoefedrin (sirup) Silika Amonium asetat 0,25 UV 254 nm
%-etanol
Reserprin (serbuk) Silika CH2Cl2-MeOH UV 254 nm
(NH4OH 1 %) (98:2)
Salbutamol (serbuk) Silika CH2Cl2-MeOH UV 254 nm
(NH4OH 1 %) (98:2)
Sefaklor C18 Buffer fosfat 50 mM UV 220 nm
pH 4,0-asetonitril
secara gradient 2,25-
45 %
Sefalosporin C Silika Larutan asam adipat UV 250 nm
(serbuk) 2% dalam asam
Simetidin (serbuk C18 Asetonitril-buffer UV 228 nm
dan tablet) (16:84); Buffer :
asam asetat-natrium
asetat 0,2 % (95:5)
Sianokobalamin C18; Bondapak Metanol 15-50% Visibel 550 nm
secar gradient dalam
asam fosfat 0,05 M
selama 15 menit;
kecepatan alir 1,5
ml/menit
Timerasol (larutan) C18 ; Bondapak Buffer fosfat- UV 254 nm
asetonitril (15:85)
Trimetoprim (tablet) C18 Asam asetat 1 %- UV 254 nm
asetonitril (84:16)
Triprolidin (sirup) Silika Amonium asetat 0,25 UV 254 nm
Triprolidin (tablet) n-etanol (3:17)
Triprolidin dengan
pseudoefedrin (sirup)
Warfarin (tablet)

DAFTAR PUSTAKA

HPLC diakses di http://ekaandrians.blogspot.com/2013/04/hplc.html#sthash.nQjkwWqt.dpuf

pada tanggal 03/01/15 pukul 16.30
HPLC Lengkap diakses di
https://www.academia.edu/5267709/HPLC_LENGKAP_HPLC_ADALAH_HPLC_High_Per
formance_Liquid_Chromatography pada tanggal 02/01/15 pukul 12.55