Plant Cell Tiss Organ Cult (2017)

ESTABLECIMIENTO In vivo DEL MATERIAL In vitro ACLIMATACION

lvarez Manuel 1 Crdenas Camilo 1 Hernndez Mara 1 Hernndez Yhara 1 Fuentes Karen1

Manuel David Alvarez

Manuelalvares1208@hotmail.com

1
Universidad de Sucre, Facultad de Educacin y Ciencias, Programa de Biologa, Lnea de profundizacin en
Biotecnologa, Ingeniera Gentica, Sincelejo Colombia.
Resumen
Para evaluar la actividad de aclimatacin de explantes de condiciones in vitro a in vivo. Se debe de tener
factores importantes como son las condiciones climticas y el tipo de sustrato a los cuales las plntulas estn
sometidas. El riego de agua fue por aspersin, las plantas no lograron una aclimatacin y viendo que todas al
final murieron teniendo que la propagacin de especies vegetales cada tipo de planta requiere su tipo de
propagacin ms adecuado desde el ms natural y conocido como es por medio de las semillas o por divisin
de races.
Palabras clave: Medio de cultivo, in vitro, in vivo, evaluacin de aclimatacin, porcentaje de
aclimatacin
Introduccin
La aclimatacin, esta fase consiste en el paso de las debido a que una limitante del cultivo es la
plantas del cultivo al medio natural. Este es un paso obtencin de material vegetativo con
extremadamente importante, ya que si no se realiza caractersticas de alta productividad, libres de
cuidadosamente se pueden perder gran nmero de microorganismos patgenos y plagas; aun as, se
plantas. Las plantas en condiciones de cultivo estn buscan nuevas tecnologas que permitan la
en una atmsfera con alta humedad y baja automatizacin y mejoren los protocolos para la
intensidad luminosa, por tanto el tejido epitelial se climatizacin de las plantas (Gonzlez, 2003). Una
caracterizar por tener menos ceras que protejan a vez seleccionado el material vegetal, y previamente
las plantas contra la deshidratacin. El a la introduccin in vitro, es conveniente someterle
acondicionamiento de nuevo al medio exterior se a una serie de tratamientos para reducir al mximo
efectuar por tanto cuidadosamente, utilizando los microorganismos superficiales. Por ejemplo se
para ello invernaderos. Para la prctica de pueden realizar aplicaciones peridicas
laboratorio se utiliza el invernadero de la de fungicidas y bactericidas sistmicos. Algunos
universidad de sucre, estas plntulas son cubiertas microorganismos pueden tener una alta capacidad
por un recipiente plstico impidiendo que la luz saproftica que les permite colonizar rpidamente
llegue completamente a los explantes sembrados. el medio de cultico e imposibilitar el desarrollo del
material vegetal. El paso previo a la instalacin in
En los ltimos aos el cultivo in vitro ha
vitro de un material vegetal es la asepsia
constituido una alternativa para la produccin de
superficial. El protocolo de este proceso depender
plantas a travs de la micropropagacin, lo que ha
de las caractersticas del tejido empleado.
beneficiado a los productores de este cultivo,
Para trabajar en condiciones aspticas, es
1
recomendable realizar este proceso en una cmara
de flujo laminar y emplear material estril. El
ambiente debe mantenerse limpio con la superficie
de trabajo desinfectada con etanol al 70% antes y
despus de usarla. Se debe usar bata de laboratorio
y lavarse bien las manos. (Navarro, l. 1979.)
En la fase de climatizacin, las plantas cultivadas
in vitro con un sistema radicular desarrollado bajo
estas mismas condiciones presentan algunas
ventajas sobre otros procedimientos. Para el
desarrollo de races en plantas cultivadas in vitro,
las condiciones cambian de acuerdo con la especie Fig. 1. Luxmetro utilizado para medir la
de la planta y en ocasiones segn las variedades de intensidad luminosa marca Quantum Meter.
una misma especie, por lo cual las variaciones en
las concentraciones de auxinas son 6 diferentes Trasplante de las plntulas.
(Gonzlez, 2003). El objetivo de esta investigacin Para la realizacin de la prctica, lo primero que
fue determinar las concentraciones de auxinas y se realiz fue la seleccin de plantas de ame
medio Murashige & Skoog (1962) adecuadas para cultivadas in vitro en el laboratorio de Cultivos de
obtener plntulas de vainilla con races para Tejidos de la Universidad de Sucre (Discoria), la
posteriormente someterlas a aclimatacin, y de tal cual fue realizada por los auxiliares del
manera su adaptacin a cultivo. laboratorio.
Con el fin de que las plantas se fueran adaptando a
Los objetivo general de la prctica es establecer una la luz directa. Luego de esto se extrajo el explante
multiplicacin del cultivo in vitro, a travs de del frasco con el medio, este se lav con agua del
aclimatacin de plntulas de ame (Dioscrea) grifo, removiendo el exceso de agar, tambin se
para la obtencin de plntulas. Especficos: Evaluar les retiro los hojas que estaban marchitas
diferentes sustratos para la aclimatacin de las (amarillas) los explantes despus de sumergieron
plntulas in vivo. Obtener plntulas de ame en agua hasta su transplante en cajas
aclimatadas procedentes de cultivo de tejidos. germinadoras, para evitar su deshidratacin y/o
muerte. Los explantes sumergidos en agua se
Materiales y mtodos llevaron a la casa malla que se encuentra de la
Universidad de Sucre, detrs del laboratorio de
Primero que todo las plantas in vitro deben pre- Cultivo de tejidos.
aclimatarse en el laboratorio antes de trasladarse a
condiciones in vivo. Se expuso la plntulas in vitro
a condiciones lumnicas mayores a 60moles m-2s-
1
Y de temperatura (28 a 38 C) de dos a tres
semanas antes de su trasplante en suelo, la
evaluacin se realiz durante cuatro semanas.

Fig. 2. explantes en frascos con el medio agar.

Preparacin del sustrato: El sustrato fue

preparado en recipiente, donde se agreg arena,
abono y tierra negra en porciones 1:1:1, este fue
autoclavado y posteriormente se llev al
invernadero para depositarlos en las cajas
germinadoras.
2

Siembra de los explantes: Los explantes fueron
sembrados en las cajas germinadoras con el
sustrato anteriormente preparado, pata esto se
realiz unos pequeos huecos de aproximadamente
2 cm y se introdujeron una planta por cada seccin
de la caja.
Fig. 3. Cajas germinadoras.
Finalizada la siembra los explantes fueron
cubiertos con un recipiente mientras se adaptaban a
las condiciones de luminosidad. Se midi la
intensidad de luz con un Luxmetro marca
Quantum Meter y humedad respectivamente. Las
plantas fueron evaluadas durante cuatro semanas
despus de haber realizado el trasplante.
Fig. 4. Extraccin de explantes, para posterior
adicin a las cajas germinadoras en el
invernadero.
Monitoreo del experimento
Los cultivos fueron observados durante todo el
tiempo de cultivo para control de contaminacin,
crecimiento en el proceso de proliferacin de
races, evaluacin de tratamientos de reguladores
y su adaptacin fuera del laboratorio.
RESULTADOS Y ANLISIS
Para la aclimatacin de las plntulas procedentes
del cultivo en su fase de multiplicacin in vitro, se
pueden utilizar varios procedimientos: uno de ellos
es el enraizamiento in vivo, presentando la ventaja
que cuando se est en un proceso de enraizamiento,
al mismo tiempo los brotes se adaptan a las
condiciones ambientales en las cuales crecern y se
desarrollaran las plantas, sin embargo, con este
mtodo existe una probabilidad muy alta de que el
nmero de plntulas sobrevivientes sea bajo, ya
que stas an no han desarrollado races para
realizar sus funciones de absorcin y transporte
nutrimental.
El enraizamiento in vitro, despus de inducir al
enraizamiento, los brotes son establecidos en las
condiciones de adaptacin, usando una humedad
relativa alta durante el perodo de aclimatacin, la
cual se va reduciendo gradualmente hasta alcanzar
el nivel normal en invernadero o campo (Olivera
et.al, 2000).
Para esta prctica se evaluaron los explantes trados
in vitro del laboratorio de tejido de cultivos se not
que estos no tuvieron un crecimiento, al final todas
las plantas murieron dando como resultado final un
porcentaje de 0% de vida.
02/10/2017 fue el da de inicio de toma de datos.
Plntulas sembradas 7
Humedad 64%
ndice de luz 0,37 moles m-2s-1
Temperatura 30 C
Este tratamiento permite obtener plantas
aclimatadas despus de realizar la plantacin. Una
vez obtenidos los resultados por semanas estos se
cuantifican y se registran en tablas y grficos.
3
Imagen 1. Plntulas, primer da de toma de datos Imagen 4. Visualizacin de explantes, ultimo da
todos estaban en condiciones normales. de toma de datos, todas las plntulas haban
06/10/2017 hora: 11:23:26 a.m. muerto. 21/10/2017 hora: 08:50:23 a.m.

No se produjo enraizamiento y tampoco ninguna

sobrevivi.
En la fase de aclimatacin se evalu el porcentaje
de sobrevivencia de las plantas para cada cierto
periodo de tiempo, se analiz con una estadstica
completamente al azar.

distribucion de explantes por

Imagen 2. Plntulas, presencia de marchitamiento semana
de las plntulas debido a malas condiciones.
N de explantes

12/10/2017 hora: 09:01:42 a.m. 8

6
4
2
0

Dias

Grafica 1. Evaluacin de los explantes con

respecto a los das de riego, se not que estos no
Imagen 3. Visualizacin de explantes a la tercera
tuvieron un crecimiento adecuado, las plantas in
semana solo se apreciaban dos plntulas vivas.
vitro crecen a bajos niveles de luz, desarrollan
17/10/2017 hora: 03:20:30 p.m.
hojas muy delgadas, semejantes a aquellas que
crecen bajo sombra se puede observar un
decrecimiento de los nmeros de explantes.
En la fase de aclimatacin se pretende que las
plantas que han crecido in vitro y por lo tanto slo
han estado expuestas a un microambiente escogido
por ofrecer unas condiciones mnimas de estrs y
cuasi ptimas condiciones para la multiplicacin de

4
las plantas, se adapten a condiciones ex vitro donde ambiente natural. La Biotecnologa es, sin duda,
las condiciones no son aspticas, ni la luz, una de las reas del conocimiento con mayor
temperatura y humedad estn controladas, y donde impacto sobre la sociedad del siglo XXI. Es as que
el crecimiento ha ser autotrfico y no heterotrfico la propagacin por cultivo de tejidos vegetales o
como in vitro. Es pues necesario reconstruir y tambin llamada cultivo in vitro, es una
desarrollar los sistemas que por adaptacin a la herramienta biotecnolgica para lograr el rescate
de especies amenazadas de extincin, utilizando el
condiciones in vitro, es el caso de la lignificacin,
principio de la totipotencialidad celular para
cubiertas cuticulares, estomas y estructuras obtener grandes cantidades de individuos en un
fotosintticas. [1] tiempo menor que el que se requerira naturalmente
sin perder las caractersticas genticas y
morfolgicas de la planta donante (Ordoez, 2003).
En estudios previos realizados, se ha utilizado el
% de AIB y el ANA para el enraizamiento de las
da plntulas
sobrevivencia plntulas presentando un 100% de enraizamiento
06/10/2017 7 con las concentraciones ms altas utilizadas en el
0,39
experimento (2.0 mg/L.). No obstante, el AIB
12/10/2017 7 present mejores resultados que el ANA en cuanto
0,39
a nmero y longitud de races (Giridhar, P, Obul
17/10/2017 4
0,22 B, Ravishankar GA, 2001). En nuestro caso no se
21/10/2017 0 utilizaron estos, influye en el crecimiento de las
-
plntulas dispuestas en el vivero.
total 18 25%
CONCLUSIN
Tabla 1. Resultado de los das de riego, toma de Se logr 25 % de enraizamiento y aclimatacin
datos y visualizacin de los explantes porcentaje durante el periodo de evaluacin, con sustrato de
de sobrevivencia. tierra agrcola comn, sin la adicin de enraizantes
y plstico como envoltura.
% de sobrevivencia
0,50 El uso de plstico atrofia a las plntulas, se necesita
adicionar agua peridicamente, debido a los lapsos
0,40
PORCENTAJES

0,30
0,20
0,10
-
02/10/2017 07/10/2017 12/10/2017 17/10/2017 22/10/2017
DIAS
Grafica 2. Representacin grfica de la
distribucin de datos para la variable % de
sobrevivencia por planta que presenta cada uno de
los das.
Dentro de la Biotecnologa Vegetal existen
diferentes tcnicas que estn a disposicin del
hombre; avances tecnolgicos que est obligado a
utilizar no solo en un beneficio directo sino tambin
indirecto, a forma de preservar y mejorar su medio
de tiempo.
Se puede observar que los tratamientos corresponden
positivamente para el anlisis propuesto. Debido a que
por factores climticos como aumento de temperatura y
humedad relativa los explantes no sobreviviran.
CUESTIONARIO
Cul es una de las principales razones por las
cuales el establecimiento in vivo sea tan
importante?
A diferencia de las tcnicas tradicionales de
cultivo, esta poderosa herramienta permite la
propagacin de grandes volmenes de plantas en
menor tiempo; as como el manejo de las mismas
en espacios reducidos. Por otro lado, la tcnica es
de gran utilidad en la obtencin de plantas libres de
patgenos; plantas homocigotas, en la produccin

5
de plantas en peligro de extincin, en estudios de
ingeniera gentica, etc. El enorme potencial que
posee esta metodologa ha propiciado que en los
ltimos 25 aos se haya incrementado el nmero de
laboratorios de cultivo de tejidos en el pas para la
produccin comercial de plantas ornamentales y
frutales a lo que ha motivado que algunos
floricultores la estn utilizando como una
alternativa viable en sus programas de produccin.
Diga cul sera para Ud. El sustrato y
condiciones ambientales que garanticen la
supervivencia de las plntulas.
Las plantas tienen una serie de necesidades que el
horticultor debe satisfacer con ayuda de modernos
medios y tcnicas de cultivo. El trmino sustrato,
que se aplica en la produccin en vivero, se refiere
a todo material slido diferente del suelo que puede
ser natural o sinttico, mineral u orgnico y que
colocado en contenedor, de forma pura o mezclado,
permite el fijado de las plantas a travs de su
sistema radicular; el sustrato puede intervenir o no
en el proceso de nutricin de la planta. Esto ltimo,
clasifica qumicamente a los sustratos en inertes
(perlita, lana de roca, roca volcnica, entre otras) y
activos (turbas, corteza de pino, principalmente)
(Francisco, 2008).
La luminosidad
Toda planta que est expuesta a la luz natural es
capaz de transformar los elementos nutritivos que
requiere para su crecimiento, los aprovecha mejor.
Todas las necesidades son variantes de una especie
a otra, lo ideal es alrededor de 500 lux por da, es
decir sera como tener una oficina bien iluminada
en este caso si la planta se encuentra a 2 metros de
la ventana recibe la luz unas cuatro veces menos en
comparacin con aquella que, est, directamente
expuesta por ms tiempo a los rayos solares.
Luz artificial
Cuando la iluminacin natural es insuficiente, la
opcin es recurrir al uso de la luz artificial. De
preferencia usar focos especiales que pueden dar
una luz mixta.
La distancia que la planta tenga de la luz es muy
importante para que las plantas estn bien
iluminadas y estas puedas continuar su crecimiento
Proponga un modelo de aclimatacin en
plntulas desde su estada in vitro hasta su
establecimiento in vivo.
Grout y Aston [Hort. Res., 17, 1 (1977)]
observaron cmo tras el enraizamiento in vitro de
sus plantas la zona de transicin entre la raz y el
tallo era anormal, con unas conexiones vasculares
dbiles y malformadas, lo que produca problemas
en la absorcin y circulacin de agua desde las
races al tallo. Esta disfuncin se corrige, al menos
parcialmente, tras una adecuada aclimatacin. En
otras ocasiones el problema estriba en que las races
que crecen en agar son defectuosas, carecen de
pelos radicales y suelen necrosarse al transplantar
las plntulas, lo que provoca una parada en el
crecimiento de la planta [(Deberg y Maene,
Scientia Hort., 14, 335 (1981)]. Tambin se ha
observado como las races formadas in vitro eran
gruesas y con pelos radicales engrosados y
anormales, siendo sus sistemas vasculares
anmalos, en comparacin con races formadas en
un sustrato arenoso. En las races que no mueren
durante el proceso de transplante se producen
nuevas races laterales y adventicias normales
durante el proceso de aclimatacin y estas ya
crecen activamente. Por ello la razn raz: tallo
siempre es ms alta en plantas enraizadas ex vitro
que in vitro.
Todos estos factores hacen que muchos de los
laboratorios que trabajan produciendo plantas in
vitro, no realicen el enraizamiento de la
microestaquillas in vitro, al resultar problemtico,
difcil y caro, ya que el proceso de enraizamiento
in vitro se estima que implica un costo de entre el
35-75% del coste total de la micropropagacin. Por
supuesto, no es posible generalizar, ya que la
eleccin del mtodo de enraizamiento va a
depender totalmente de la especie y de sus
caractersticas: porcentajes de enraizamiento y
supervivencia final, que varan enormemente de
unas especies a otras. As, cuando el enraizamiento
y aclimatacin se pueden realizar simultneamente,
sin que haya demasiada prdida de plantas, tanto
los costes como la eficiencia de la produccin se
ven muy favorecidos.
Entre los factores a considerar en el enraizamiento
de microestaquillas tanto in vitro como ex vitro
6
estn el tamao de la microestaquilla, su cobertura
foliar, los reguladores de crecimiento utilizados en
la induccin, y las condiciones medioambientales
de temperatura, luz y humedad.
Algunos autores [(Welander, Physiol. Plant.
58:231, (1983); Zimmerman y Fordham, J. Amer.
Soc. Hort. Sci. 110: 34 (1985)] han propuesto una
tcnica hbrida, que combina las ventajas del
enraizamiento in vitro y ex vitro. Para ello las
microestaquillas son incubadas inicialmente en un
medio estril que incluye hormonas para la
induccin de races y azcares, durante un periodo
de 3 a 7 das, para la induccin-inicio de las races.
Esto se puede hacer en un medio slido o lquido
normalmente en oscuridad. Luego el material es
repicado en un medio no estril, o incluso
transplantado a tierra, para la fase de elongacin y
desarrollo de las races, mejorndose de esta forma
en muchos casos el resultado final de aclimatacin
y supervivencia.
Otros autores [(Driver y Shutle, Eds., Cell and
Tissue Culture in Forestry Vol. II (1987)] proponen
realizar el enraizamiento y la aclimatacin
simultneamente, transplantando las
microestaquillas directamente en el campo,
despues de una etapa previa de endurecimiento in
vitro: tras la induccin del enraizamiento, las
plantas an en condiciones in vitro eran sometidas
a una elevada intensidad luminosa, un fotoperiodo
ms corto y una temperatura inferior a la normal,
durante un par de semanas. Esto favoreca la
lignificacin y el desarrollo cuticular y estomtico
del material y permita su transplante directo al
campo en condiciones controladas de humedad, luz
y nutrientes (Minitnel). [2]
Explique cmo acelerara el proceso de
multiplicacin de las plntulas in vivo. Tenga en
cuenta las diferentes tcnicas de propagacin
vegetativa.
Teniendo en cuenta la importancia que ha cobrado
el conocimiento de las respuestas de las plantas en
ambientes enriquecidos con CO2, se han
desarrollado sistemas para el crecimiento y el
estudio de ellas en estas condiciones. Actualmente
se cuenta con sistemas enriquecedores de aire con
CO2, FACEs (Free Air CO2 Enrichment), bolsas
para ramas (branch bags), cmaras de cultivo y
cmaras de techo abierto (CTA). Todos estos
sistemas tecnolgicos son vlidos, eficientes y se
usan en dependencia del objetivo trazado en la
investigacin.
SISTEMAS FACE
Son torres de metal, que pueden alcanzar 30 m de
altura, dispuestas en forma de anillo y mantienen
en su interior una zona circular con un dimetro de
10 a 20 m. De las torres parten tubos que las unen,
los que fumigan constantemente CO2 dentro del
rea de estudio (Miglietta et al. 2001). La ventaja
de este sistema es que los estudios pueden ser
desarrollados in situ en bosques naturales, en
plantaciones con vegetacin madura o en zonas de
cultivos agrcolas, pudindose estudiar as el efecto
del CO2 en cualquier etapa de crecimiento de los
rboles y cultivos. Entre las limitaciones de esta
tcnica, se encuentra que las concentraciones de
CO2 mximas que se alcanzan estn
aproximadamente en 550 ppm y las inversiones en
infraestructura y mantenimiento de estos sistemas
son muy elevadas.
BOLSAS PARA RAMAS
Se componen de envoltorios plsticos,
transparentes, usados para inyectar
concentraciones conocidas de CO2 en ramas
especficas de las plantas estudiadas (Barton et
al.1993), dejando as el resto de la planta en una
atmsfera con concentracin de CO2 diferente.
CMARAS DE CULTIVO
Son salones que constituyen recintos de
crecimiento y se construyen especialmente para
controlar las condiciones ambientales como
luminosidad, humedad, temperatura y
concentracin de CO2.
CMARAS DE TECHO ABIERTO (CTA)
Comprenden pequeos cilindros de metal, cerrados
en los laterales por capas de plstico o
policarbonato transparente, con proteccin UV y
abertura en la parte superior. El CO2 es inyectado
por una vlvula solenoide en un compartimento
donde es mezclado con aire, usando un ventilador.
Posteriormente, este aire enriquecido es distribuido
por toda la cmara hasta alcanzar la concentracin
7
deseada y uniforme. Dentro de las CTA son
colocadas las plantas de estudio. La ventaja de este
sistema es que en ellas se consigue alcanzar
concentraciones de CO2 de hasta a 1000 ppm,
adems de ser un mtodo ms econmico.
REFERENCIAS
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(Tesis de Licenciatura). Facultad de Ciencias
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de Guatemala
[1]https://www.ecoagricultor.com/sustrato-
plantas-macetas/
[2].http://www.encuentros.uma.es/encuentros31/e
nraizamiento.html