RT-PCR

Dado que el ARN usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor, es necesario hacer
una transcripcin reversa (RT) antes de iniciar la amplificacin por PCR. La transcripcin
reversa genera una copia de la hebra de ARN, pero esta copia es ADN complementario
(CDNA o DNAc en ingls) el cual es estable al calor y puede resistir la metodologa PCR.

Los pasos de la RT-PCR son:

1. Transcripcin reversa: Unin del primer a la secuencia de ARN objetivo.

2. Transcripcin reversa: La polimerasa rTth cataliza la extensin del primer mediante la
incorporacin de nucletidos complementarios.
3. Fin de transcripcin reversa, se obtiene la hebra del cDNA complementario al ARN.
4. PCR.

El ARNm es copiado a cDNA (ADN complementario) por la transcriptasa reversa usando un

primer dT (los primers al azar se pueden tambin utilizar). En PCR en tiempo real, se utiliza
generalmente una transcriptasa reversa que tenga una actividad endo H. Esto elimina el
mRNA permitiendo que la segunda hebra de ADN sea formada. Se adiciona una mezcla de
PCR que incluya una polimerasa termoestable (tal como la Taq polimerasa), los primers
especficos para el gen de inters, los deoxinucletidos y un buffer conveniente.

Conversin de ARNm a cDNA por la enzima transcriptasa inversa.

El cDNA se desnaturaliza a mas de 90C (~94C), las dos hebras se separan. A 50 o 60C los
primers especficos se alinean con el sitio complementario en cada cadena. Los sitios de
unin a los primers deben estar separados 400 bases, pero generalmente se encuentran a
100 bases de distancia especialmente cuando se usa el PCR en tiempo real

A 72C la polimerasa extiende el DNA desde los primers. Se obtienen 4 cadenas de cDNA.

Despus de 30 o 40 ciclos de sntesis de cDNA, los productos de reaccin son analizados

usualmente por electroforesis en gel de agarosa. El gel se tie con bromuro de etidio. Los
geles de agarosa para analizar los productos de cDNA de la RT-PCR no nos permiten la
cuantificacin ya que el bromuro de etidio es muy insensible y cuando una banda es
perceptible sobrepasa la etapa logartmica de amplificacin.
 El SYBR green fluorece brillantemente cuando solo cuando se une a ADN de doble cadena
El bromuro de etidio es un colorante que se une a la doble cadena de ADN intercalndose
entre los pares de bases. Emite luz fluorescente cuando se irradia en la parte UV del espectro.
Sin embargo, la fluorescencia no es muy brillante. Otros colorantes, como el SYBR green, que
son mucho ms fluorescentes que el bromuro de etidio, se utilizan en el PCR en tiempo real.
"RT-PCR" vuelve a dirigir aqu. Para la reaccin en cadena de polimerasa en tiempo real,
tambin llamada reaccin en cadena de polimerasa cuantitativo en tiempo real (qPCR) o
reaccin en cadena de polimerasa cintico, ver reaccin en cadena de polimerasa en tiempo
real.

RT-PCR

Reaccin en cadena de polimerasa de transcripcin inversa (RT-PCR) es una de las

muchas variantes de reaccin en cadena de polimerasa (PCR). Esta tcnica se utiliza
habitualmente en biologa molecular para detectar RNA expresin.[1] RT-PCR se confunde a
menudo con reaccin en cadena de polimerasa en tiempo real (qPCR) por los estudiantes y
cientficos por igual.[2] Sin embargo, son separadas y distintas tcnicas. Mientras que RT-PCR
se utiliza para detectar cualitativamente la expresin de genes a travs de la creacin de ADN
complementario (cDNA) transcripciones del RNA, qPCR se utiliza para medir
cuantitativamente la amplificacin de ADN mediante sondas fluorescentes. tambin se conoce
como PCR cuantitativa, qPCR[2] PCR cuantitativa a tiempo real,[3] y PCR cuantitativa en tiempo
real.[4]
Aunque RT-PCR y PCR tradicional ambos producen copias mltiples de aislamientos de DNA
particulares a travs de la amplificacin, las aplicaciones de las dos tcnicas son
fundamentalmente diferentes. PCR tradicional es utilizado para amplificar exponencialmente
secuencias de ADN diana. RT-PCR se utiliza para clonar genes expresados por reverso
transcripcin el RNA de inters en su complemento de ADN mediante el uso de de la
transcriptasa reversa. Posteriormente, el cDNA recin sintetizado se amplifica mediante PCR
tradicional.
Adems el estudio cualitativo de la expresin gnica, PCR cuantitativa puede ser utilizado
para la cuantificacin de ARN, en trminos relativos y absolutos,[5] por incorporar la tcnica de
la qPCR. La tcnica combinada, descrita como RT-PCR cuantitativa[6] o RT-PCR en tiempo
real[7] (a veces incluso en tiempo real RT-PCR cuantitativa[8]), a menudo se abrevia como qRT-
PCR,[9] RT-qPCR,[10] o RRT-PCR.[11]En comparacin con otros mtodos de cuantificacin de
RNA, como la mancha blanca /negra nortea, qRT-PCR se considera el ensayo ms
poderoso, sensible y cuantitativo para la deteccin de niveles de ARN. Con frecuencia se
utiliza en el anlisis de la expresin de genes simples o mltiples y los patrones de expresin
para identificar infecciones y enfermedades.[5]
Para evitar confusin, las abreviaturas siguientes se utilizarn constantemente a lo largo de
este artculo:
 Tcnica Abreviatura

POLIMERIZACIN EN
Reaccin en cadena de polimerasa
CADENA

Reaccin en cadena de polimerasa de transcripcin

RT-PCR
inversa

Reaccin en cadena de polimerasa en tiempo real qPCR

RT-PCR qPCR combinado tcnica qRT-PCR

Contenido

1Historia

2Principios

o 2.1Un solo paso RT-PCR y RT-PCR de dos pasos

o 2.2Punto final RT-PCR y RT-PCR en tiempo real

2.2.1RT-PCR punto final

2.2.2RT-PCR en tiempo real

3Aplicacin

o 3.1Mtodos de investigacin

o 3.2Insercin gnica

o 3.3Diagnstico de enfermedades genticas

o 3.4Deteccin de cncer

4Retos

5Protocolo

o 5.1RT-PCR de un solo paso

o 5.2RT-PCR de dos pasos

 5.2.1Paso uno

5.2.2Paso dos

6Pautas de publicacin

7Referencias

8Enlaces externos

Historia
Desde su introduccin en 1977, Mancha blanca /negra nortea haba sido utilizado
extensivamente para la cuantificacin de RNA a pesar de sus deficiencias: tcnica (a) tiempo,
(b) requiere una gran cantidad de RNA para la deteccin y (c) cuantitativamente imprecisa en
la baja abundancia de contenido de RNA.[12][13] Sin embargo, el descubrimiento de de la
transcriptasa reversa durante el estudio de la replicacin viral del material gentico dirigido al
desarrollo de la RT-PCR, que desde entonces ha desplazado Mancha blanca /negra nortea
como el mtodo de eleccin para la deteccin de RNA y cuantificacin. [14]
RT-PCR ha crecido para convertirse en la tecnologa de referencia para la deteccin o los
niveles de comparacin del ARN por varias razones: (a) no requiere procesamiento posterior
PCR, (b) una amplia gama (> 107-doblar) de ARN abundancia se puede medir, y (c)
proporciona informacin sobre datos cuantitativos y cualitativos.[8] Debido a su simplicidad,
especificidad y sensibilidad, RT-PCR se utiliza en una amplia gama de aplicaciones de
experimentos tan simples como la cuantificacin de las clulas de levadura en vinos para usos
ms complejos como herramientas de diagnstico para la deteccin de agentes infecciosos
como el virus de la gripe aviar.[15][16]

Principios
En RT-PCR, el RNA plantilla primera se convierte en un ADN complementario (cDNA)
utilizando un de la transcriptasa reversa. El cDNA entonces se utiliza como plantilla para la
amplificacin exponencial usando PCR. RT-PCR es actualmente el mtodo ms sensible de
deteccin de RNA del mercado.[17] El uso de RT-PCR para la deteccin de RNA transcripcin
ha revolucionado el estudio de la expresin gnica en los siguientes aspectos importantes:

Hace tericamente posible detectar las transcripciones del gene de prcticamente

cualquier[18]

Permiti la amplificacin de la muestra y elimin la necesidad de abundante material

de partida que uno enfrenta al utilizar mancha blanca /negra nortea Anlisis[19][20]

Siempre tolerancia para la degradacin de RNA como el RNA que abarca la cartilla
est intacto[19]
Un solo paso RT-PCR y RT-PCR de dos pasos
Un paso vs RT-PCR de dos pasos

La cuantificacin de mRNA usando RT-PCR puede conseguirse como un paso o una reaccin
de dos etapas. La diferencia entre los dos enfoques se encuentra en el nmero de tubos
usados al realizar el procedimiento. En el enfoque de un solo paso, se produce la reaccin
completa de sntesis de cDNA para amplificacin por PCR en un solo tubo. Por otro lado, la
reaccin de dos etapas requiere que la reaccin de la transcriptasa inversa y amplificacin por
PCR se realiz en tubos separados. El enfoque de un solo paso se piensa para reducir al
mnimo la variacin experimental por que contiene todas las reacciones enzimticas en un
nico entorno. Sin embargo, las plantillas a partir de RNA son propensas a la degradacin en
el enfoque de un solo paso, y no se recomienda el uso de este enfoque cuando repiten los
ensayos de la misma muestra se requiere. Adems, enfoque de un solo paso se divulga para
ser menos preciso en comparacin con el enfoque de dos pasos. Tambin es el mtodo
preferido de anlisis cuando se utiliza ADN vinculante colorantes tales como SYBR Green
puesto que la eliminacin de la cartilla-dmeros puede lograrse a travs de un simple cambio
en la temperatura de fusin. La desventaja del enfoque de dos pasos es la susceptibilidad a la
contaminacin debido al manejo de muestras ms frecuente.[21]

Punto final RT-PCR y RT-PCR en tiempo real

Cuantificacin de productos de RT-PCR se puede dividir ampliamente en dos categoras:
punto final y en tiempo real.[17] El uso de RT-PCR punto final es preferido para la medicin de
cambios de expresin gnica en el nmero pequeo de muestras, pero el RT-PCR a tiempo
real se ha convertido en el mtodo estndar de oro para validar los resultados obtenidos del
anlisis de la matriz o cambios de expresin gnica a escala mundial. [22]
RT-PCR punto final
Los mtodos de medicin de RT-PCR punto final requiere la deteccin de niveles de expresin
gnica mediante el uso de tintes fluorescentes como bromuro de etidio,[23][24] P32 etiquetado de
los productos PCR usando phosphorimager,[25] o por Conteo por Cintilacin.[20] RT-PCR punto
final se alcanza comnmente usando tres mtodos diferentes: relativa, competitivos y
comparativos.[26][27]
Relativa RT-PCR: Relativas cuantificaciones de RT-PCR implica la amplificacin conjunta de
un control interno simultneamente con el gen de inters. El control interno se utiliza para
normalizar las muestras. Una vez normalizado, se puede hacer una comparacin directa de
abundancia relativa de la transcripcin a travs de mltiples muestras de mRNA. Una
precaucin tener en cuenta es que el control interno debe ser elegido por lo que no es
afectado por el tratamiento experimental. La expresin a nivel debe ser constante a travs de
todas las muestras y con el ARNm de inters para los resultados precisos y significativos.
Porque la cuantificacin de los resultados se analizan comparando la gama linear de la
amplificacin del objetivo y el control, es crucial tomar en consideracin la concentracin de
las molculas objetivo inicial y su tasa de amplificacin antes de comenzar el anlisis. Los
resultados de los anlisis se expresan como cocientes de gen seal de seal de control
interno, que los valores pueden utilizarse para la comparacin entre las muestras en la
estimacin de destino relativa expresin de RNA.[24][27][28]
RT-PCR competitivo: Tcnica de RT-PCR competitiva se utiliza para la cuantificacin
absoluta. Implica el uso de un sinttico "competidor" RNA que puede ser distinguido del
destino RNA por una pequea diferencia en tamao o en secuencia. Es importante para el
diseo del ARN sinttico sea idntica en secuencia pero ligeramente ms corto que el objetivo
del RNA para resultados precisos. Una vez diseado y sintetizado, una cantidad conocida de
la ARN del competidor se aade a las muestras experimentales y co se amplifica con el blanco
usando RT-PCR. Entonces, se produce una curva de concentracin del competidor RNA y se
utiliza para comparar las seales de la RT-PCR producidas a partir de las transcripciones
endgenas para determinar la cantidad de blanco presente en la muestra. [27][29]
RT comparativa-PCR: RT comparativa-PCR es similar a la RT-PCR competitivo en que
compite el RNA de la blanco de los reactivos de amplificacin en una sola reaccin con un
patrn interno de secuencia sin relacin. Una vez completada la reaccin, los resultados son
comparados a una curva estndar externa para determinar la concentracin de RNA Diana.
En comparacin con los mtodos de cuantificacin relativa y competitiva, RT comparativa-
PCR se considera el mtodo ms conveniente de utilizar ya que requiere el investigador para
llevar a cabo un experimento piloto; en relativa RT-PCR, el intervalo de amplificacin
exponencial del mRNA debe ser predeterminado y en RT-PCR competitivo, un RNA sinttico
competidor debe ser sintetizado.[27][30][31][32][33]
RT-PCR en tiempo real
La aparicin de nuevas tcnicas de etiquetado de ADN fluorescentes en los ltimos aos han
permitido el anlisis y la deteccin de productos de la PCR en tiempo real y, en consecuencia,
ha conducido a la adopcin generalizada de RT-PCR en tiempo real para el anlisis de la
expresin gnica. No slo es RT-PCR en tiempo real ahora el mtodo de eleccin para la
cuantificacin de la expresin gnica, tambin es el mtodo preferido de obtener resultados
del anlisis de la matriz y las expresiones gnica a escala mundial. Actualmente, hay cuatro
diferentes sondas de ADN fluorescentes para la deteccin de RT-PCR en tiempo real de los
productos PCR: SYBR Green, TaqMan, Moleculares Beaconsy de escorpiones. Todas estas
puntas de prueba permiten la deteccin de productos de la PCR mediante la generacin de
una seal fluorescente. Mientras el colorante SYBR Green emite su seal fluorescente
simplemente por atar a la DNA double-stranded en solucin, sondas la TaqMan, Molecular
Beacons y generacin de escorpiones de fluorescencia dependen de Transferencia de energa
de Frster Resonancia (FRET) acoplamiento de la molcula del tinte y un moiety del extintor a
los sustratos oligonucletidos.[34]
SYBR Green: Cuando el SYBR Green se une al ADN de doble hebra de los productos PCR,
emitir la luz por excitacin. La intensidad de la fluorescencia aumenta a medida que se
acumulan los productos PCR. Esta tcnica es fcil de usar ya que el diseo de sondas no es
necesario dada la falta de especificidad de su unin. Sin embargo, puesto que el tinte no
discrimina el ADN de doble hebra de los productos PCR y las de los dmeros de primer,
sobreestimacin de la concentracin objetivo es un problema comn. Donde la cuantificacin
exacta es una necesidad absoluta, ms anlisis para la validacin de los resultados debe
realizarse. Sin embargo, entre los mtodos de deteccin de producto de RT-PCR en tiempo
real SYBR Green es el ms econmico y fcil de usar.[17][22]
Sondas TaqMan

Sondas TaqMan: TaqMan las sondas son oligonucletidos que tienen una sonda fluorescente
que se une al extremo 5' y un extintor en el extremo 3'. Durante la amplificacin por PCR,
estas sondas se hibridan a las secuencias blanco situadas en el amplicones y como
polimerasa Replica la plantilla con TaqMan enlazado, tambin segmenta la sonda fluorescente
debido a la actividad de polimerasa 5' Nucleasa. Debido a la cercana entre la molcula del
Temple y la sonda fluorescente normalmente evita la fluorescencia de ser detectado a travs
de traste, la disociacin resulta en el aumento de la intensidad de fluorescencia proporcional al
nmero de los ciclos de escote de la sonda. Aunque bien diseadas sondas TaqMan producen
resultados precisos de RT-PCR en tiempo real, es costoso y desperdiciador de tiempo a
sintetizar cuando sondas separadas deben hacerse para cada destino de mRNA analizado. [17]
[18][35]

Marcador molecular sondas: Similares a las sondas TaqMan, Moleculares Beacons tambin
hacer uso del traste deteccin con sondas fluorescentes que se une al extremo 5' y un
quencher atado al extremo 3' de un sustrato de oligonucletidos. Sin embargo, mientras que
las puntas de prueba fluorescentes TaqMan son troceados durante la amplificacin, Molecular
Beacon sondas permanecen intactas y enlazar a un nuevo destino durante cada ciclo de
reaccin. Cuando libre en solucin, la proximidad de la sonda fluorescente y la molcula de
extintor previene la fluorescencia a travs de traste. Sin embargo, cuando marcador Molecular
sondas hibridan con un objetivo, el tinte fluorescente y el quencher se separan dando lugar a
la emitancia de la luz sobre la excitacin. Como con las sondas TaqMan, Molecular Beacons
son caros de sintetizar y requieren sondas separadas para cada destino de RNA. [21]
Sondas de escorpin: Las sondas de escorpin, como marcador Molecular, no ser
fluorescente activo en un estado de unhybridized, otra vez, debido a la sonda fluorescente en
el extremo 5' se apag por la molcula en el extremo 3' de un oligonucletido. Con
escorpiones, sin embargo, el extremo 3' tambin contiene secuencia complementaria al
producto de la extensin de la cartilla en el extremo 5'. Cuando la extensin de escorpin se
une a su complemento en el amplicn, la estructura de escorpin abre, evita el traste y
permite la seal fluorescente que se medir.[36]
Sondas de Multiplex: Las sondas TaqMan, Molecular Beacons y escorpiones permiten la
medicin simultnea de productos de la PCR en un solo tubo. Esto es posible porque cada
uno de los diferentes tintes fluorescentes se puede asociar con espectros de emisin de una
especficos. No slo el uso de sondas multiplex de ahorrar tiempo y esfuerzo sin comprometer
la utilidad de comprobacin, su aplicacin en grandes reas de investigacin como el anlisis
de la canceladura del gene, mutacin y polimorfismo, anlisis cuantitativo y deteccin de RNA,
que sea una tcnica invaluable para los laboratorios de disciplina muchos. [36][37][38]
Dos estrategias son comnmente empleados para cuantificar los resultados obtenidos por RT-
PCR en tiempo real; el mtodo de la curva estndar y el mtodo comparativo umbral. [39]

Aplicacin
La amplificacin exponencial mediante reaccin en cadena de polimerasa de transcripcin
inversa preve una tcnica altamente sensible que puede detectar un nmero de copia muy
bajo de molculas de ARN. RT-PCR es ampliamente utilizado en el diagnstico de
enfermedades genticas y, semiquantitatively, en la determinacin de la abundancia de
molculas especficas de RNA diferentes dentro de una clula o tejido como una medida de
expresin del gen.

Mtodos de investigacin
RT-PCR se utiliza comnmente en los mtodos de investigacin para medir la expresin
gnica. Por ejemplo, Lin et al usaron qRT-PCR para medir la expresin de los genes Gal en
clulas de levadura. En primer lugar, Lin et al ingeniera una mutacin de una protena
sospechada de participar en la regulacin de los genes Gal. Esta mutacin fue presumida
suprimir selectivamente la expresin de Gal. Para confirmar esto, se analizaron niveles de
expresin gnica de las clulas de levadura que contiene esta mutacin mediante qRT-PCR.
Los investigadores fueron capaces de determinar concluyentemente que la mutacin de esta
protena reguladora reducida expresin Gal.[40] Mancha blanca /negra nortea anlisis se
utilizan para estudiar la expresin de genes de RNA ms.

Insercin gnica
RT-PCR tambin puede ser muy til en la insercin de genes eucariticos en procariotas.
Porque contienen genes eucariotas ms intrones, que estn presentes en el genoma pero no
en el mRNA maduro, el cDNA generado a partir de una reaccin de RT-PCR es la exacta (sin
tener en cuenta la naturaleza propenso de reverso transcriptasas) secuencia de ADN que
sera traducido directamente en protena despus de la transcripcin. Cuando estos genes se
expresan en las clulas procariotas para produccin de protenas o purificacin, el ARN
producido directamente de la transcripcin no necesita sufrir empalme como la transcripcin
contiene slo exones. (Carecen de procariotas, tales como e. coli, el ARNm splicing
mecanismo de eucariotas). RT-PCR es de uso general en el estudio de los genomas de los
virus cuyos genomas estn compuestos de ARN, como el Influenzavirus A y retrovirus como el
VIH.

Diagnstico de enfermedades genticas

RT-PCR puede utilizarse para diagnosticar enfermedades genticas tales como Sndrome de
Lesch-Nyhan. Esta enfermedad gentica es causada por un mal funcionamiento en el gene
HPRT1, que conduce clnicamente a la piedra urinaria de cido rico fatal y los sntomas
similares a la gota. [6] Anlisis de una madre embarazada y del feto para los niveles de
expresin de mRNA de HPRT1 revelar si la madre es un portador y si el feto ser probable
desarrollar el sndrome de Lesch-Nyhan.[41]
Tambin puede utilizarse como una prueba para la gripe del pjaro-H7N9.

Deteccin de cncer
Los cientficos estn trabajando en formas de usar RT-PCR en cncer para ayudar a mejorar
la deteccin pronsticoy vigilar la respuesta a la terapia. Las clulas tumorales circulantes
producen nica transcripciones del mRNA dependiendo del tipo de cncer. El objetivo es
determinar qu niveles de mRNA las transcripciones sirven como los mejores biomarcadores
para un tipo de clulas de cncer en particular y luego analizan su expresin con RT-PCR. [42]
RT-PCR es de uso general en el estudio de los genomas de virus cuyos genomas estn
compuestos de ARN, tales como Influenzavirus A y retrovirus como VIH.

Retos
A pesar de sus ventajas principales, RT-PCR no est sin desventajas. El crecimiento
exponencial del reverso transcripcin ADN complementario (cDNA) durante los mltiples ciclos
de PCR produce cuantificacin imprecisa punto final debido a la dificultad en mantener la
linealidad.[43] Con el fin de proporcionar una deteccin precisa y cuantificacin del contenido de
RNA de una muestra, qRT-PCR fue desarrollado con modificacin basada en fluorescencia
para supervisar los productos de amplificacin durante cada ciclo de PCR. La extrema
sensibilidad de la tcnica puede ser una espada de doble filo ya que incluso la ms mnima
contaminacin del ADN puede conducir a resultados indeseables.[44] Un mtodo simple para la
eliminacin de falsos positivos es incluir anclajes, o Etiquetas, a la regin 5' de una cartilla
especfica del gene.[45] Adems, planificacin y diseo de los estudios de cuantificacin
pueden ser tcnicamente difciles debido a la existencia de numerosas fuentes de variacin,
incluyendo eficiencia de concentracin y ampliacin de plantilla.[30]

Protocolo
RT-PCR puede ser llevado a cabo por el protocolo de RT-PCR de un paso o el protocolo de
RT-PCR de dos pasos.

RT-PCR de un solo paso

RT-PCR de un paso tomar mRNA dirige (hasta 6 kb) y somete para revertir la transcripcin y la
amplificacin por PCR en un solo tubo de ensayo. Utilice slo RNA de intacto, de alta calidad
para los mejores resultados. Asegrese de utilizar una cartilla especfica de secuencia.

1. Seleccione un kit de RT-PCR de un paso, que debe incluir una mezcla de la

transcriptasa reversa y el sistema PCR como una relectura de la polimerasa Taq ADN
polimerasa.

2. Obtener todos los materiales necesarios, equipos e instrumentos (kits deben incluir
una lista detallada de artculos necesarios).

3. Preparar una mezcla de reaccin, que incluir dNTPs, cebadores, plantilla de RNA,
enzimas necesarias y un tampn.

4. Aadir la mezcla a un tubo PCR para cada reaccin. A continuacin aadir la plantilla
de RNA.

5. Tubos de PCR de lugar en el termociclador para comenzar el ciclo. El primer ciclo es

transcripcin reversa para sintetizar el cDNA. El segundo ciclo es desnaturalizacin
inicial. Durante este ciclo de la transcriptasa reversa es inactivada. Los ciclos
siguientes de 40 a 50 son el programa de amplificacin, que consiste en tres pasos:
(1) desnaturalizacin, (2) recocido, (3) alargamiento.

6. Los productos de RT-PCR pueden analizarse entonces con electroforesis en gel. [46][47]
(PCR aplicaciones Manual y Biotools)

RT-PCR de dos pasos

RT-PCR de dos pasos, como su nombre lo indica, ocurre en dos pasos. Primero la
transcripcin inversa y PCR. Este mtodo es ms sensible que el mtodo de un solo paso. Los
kits son tambin tiles para RT-PCR de dos pasos. Slo en cuanto a un solo paso, use slo
intactos, de alta calidad RNA para los mejores resultados. La cartilla para dos etapas no tiene
que ser secuencia especfica.
Paso uno

1. Combinan la plantilla de RNA, cartilla, mezcla de dNTP y agua libre de nucleasas en

un tubo de PCR.

2. Agregar inhibidor de RNasa y transcriptasa reversa al tubo de PCR.

3. Tubo lugar PCR en termociclador para un ciclo que incluye recocido, extender y luego
hacer inactivo de la transcriptasa reversa.

4. Proceder directamente a la PCR o almacenar en hielo hasta que se puede realizar

PCR.
Paso dos

1. Aadir una mezcla maestra (que contiene tampn, mezcla de dNTP, MgCl 2Taq
polimerasa y agua libre de nucleasas) a cada tubo PCR.

2. Aadir el primer apropiado.

3. Tubos de lugar PCR en termociclador durante 30 ciclos del programa de amplificacin,

que incluye tres pasos: (1) desnaturalizacin, (2) recocido, (3) alargamiento.

4. Los productos de RT-PCR pueden analizarse entonces con electroforesis en gel. [48]

Pautas de publicacin
 Figura
4. PCR con transcripcin inversa (RT-PCR). Este ejemplo corresponde a la
amplificacin del transcrito quimrico EWS-WT1 de un tumor desmoplsico de
clulas pequeas y redondas. Se realiza en primer lugar una transcripcin
inversa del RNA (tercio superior) a DNA complementario (tercio medio).
Empleando cebadores (primers) que flanquean el punto de fusin (flechas
azules) se realiza la amplificacin mediante PCR del mismo (tercio inferior)
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