Artigo Polimorfismo

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE
SANTANA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM BIOTECNOLOGIA
JAQUELINE FAGUNDES PEREIRA
ANLISE DE POLIMORFISMOS DE INSERO ALU COMO

MARCADORES DE ANCESTRALIDADE EM ESTUDO CASO-
CONTROLE DE CORONARIOPATAS DO ESTADO DA
BAHIA
Feira de Santana, BA.

2010
JAQUELINE FAGUNDES PEREIRA
ANLISE DE POLIMORFISMOS DE INSERO ALU COMO

MARCADORES DE ANCESTRALIDADE EM ESTUDO CASO-
CONTROLE DE CORONARIOPATAS DO ESTADO DA
BAHIA
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-graduao em

Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana
como requisito parcial para obteno do ttulo de Mestre em
Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Domingos Lzaro Souza Rios

Co-orientadora: Prof.. Dra. Sandra Mara Bispo Sousa
Feira de Santana, BA.

2010
Aos meus pais,
Arnaldo e Elizabete
Pelo incentivo ao estudo, enfatizando

sempre que o conhecimento a maior
riqueza entre os seres humanos, pelo
carinho, dedicao, amor e apoio
incondicional.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela minha vida e por toda fora renovada nos momentos de
fraqueza.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Domingos Lzaro Souza Rios pela confiana
em mim depositada, pelos ensinamentos, pelo apoio, e pacincia.
A Prof. Dr. Sandra Mara Bispo Sousa, que sempre est disponvel em me
ajudar e por todos os ensinamentos compartilhados.
A Prof. Dr. Ana Anglica Leal Barbosa que tornou possvel a execuo
deste trabalho, por est sempre presente, muito obrigada!
A Prof. Dr. Kiyoko Ab Sandes por fazer parte da banca examinadora e
pela disponibilidade em avaliar esse trabalho.
Aos meus pais Arnaldo e Elizabete, as pessoas mais importantes da minha
vida, que mesmo sem entender muito bem o que eu fao (rsrs...), me apiam de
forma incondicional.
Luciana Arajo, pela amizade, por dividir comigo a rotina no laboratrio, as
disciplinas, as viagens (que foram muitas... rsrs!), as angstias, incertezas e as
alegrias desses dois anos.
Ao meu amigo Getlio Bomfim por ser to prestativo e companheiro,
obrigada por tudo!
Ao meu amigo Ricardo Brito, pela amizade sincera, e mesmo estando
distante torce por mim.
Aos colegas do Laboratrio de Gentica Molecular da UESB, Elder, Bruno,
Dani, Caio, Jamile Oliveira, pelas horas de descontrao.
A UEFS que atravs do programa de Ps-graduao em Biotecnologia,
permitiu a realizao deste trabalho.
A Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia pela oportunidade de
realizao dos trabalhos prticos.
Ao CNPq pela concesso da bolsa de estudos.
Estou convencido de que o mundo no um mero pntano para onde
homens e mulheres se atiram... e morrem. Alguma coisa magnfica
est ocorrendo aqui no meio de crueldades e tragdias, e o desafio
supremo inteligncia fazer prevalecer o que h de mais nobre e
melhor na nossa curiosa herana.
(C.A.Beard).
RESUMO
Os polimorfismos de seqncia Alu podem ser usados para estimar

ancestralidade, pois apresentam alelos com freqncias muito diferentes entre
grupos populacionais etnicamente distintos. A anlise destes polimorfismos foi
realizada com intuito de quantificar a mistura tnica em amostras casos-controles
visando verificar a presena de estruturao populacional. 30 marcadores foram
analisados em 539 pacientes coronariopatas (364 euro-brasileiros e 175 afro-
brasileiros) e em 302 controles (164 euro-brasileiros e 138 afro-brasileiros). O DNA
genmico foi amplificado utilizando-se o mtodo de PCR-multiplex. Os fragmentos
amplificados foram separados em PAGE 8% no desnaturante/colorao por Nitrato
de Prata. As anlises estatsticas foram realizadas com o uso dos programas
GENEPOP, ADMIX2, FSTAT 2.8, DISPAN. Dos 30 loci analisados, sete
apresentaram freqncia allica similar s encontradas em populaes africanas em
todas as amostras deste estudo. Foram observados desvios significativos para o
equilbrio de Hardy-Weinberg em todas as amostras analisadas sendo que a maioria
pode ser explicada por dficit de heterozigotos. Nas associaes allicas par-a-par,
a amostra casos euro-brasileiros apresentou associaes significativas. A
diversidade gnica intrapopulacional variou de 0,415 nos casos afro-brasileiros no
locus Ya5_541F a 0,503 em casos afro-brasileiros no locus Ya5ACA866. A
estimativa de mistura foi consistente para o modelo di-hibrdo (Afro-americanos e
Europeus). Em todas as amostras a contribuio afro-americana foi maior, o que
era esperado devido histria de formao da populao baiana. Porm essa
contribuio foi similar em todas as amostras, no diferenciando afro-brasileiros de
euro-brasileiros.
Palavras-chaves: Polimorfismos, sequncia Alu, ancestralidade, estruturao

populacional.
ABSTRACT
The polymorphisms of Alu sequence can be used estimate ancestry,

therefore they present alleles with very different frequencies between ethnicity
distinct population groups. The analysis of polymorphisms of Alu insertion was
carried through with intention to quantify the ethnic mixture in samples case-control
being aimed at to verify the presence of population stratification. 30 markers were
analyzed in 539 patients with coronary artery disease (364 Euro-Brazilians and 175
african-Brazilians) and 302 controls (164 Euro-Brazilians and 138 african-Brazilians).
Genomic DNA was amplified using the PCR-multiplex. The amplified fragments were
separated on 8% PAGE not denaturing / color by Silver Nitrate. Statistical analysis
was performed using the programs GENEPOP, ADMIX2, FSTAT 2.8, DISPAN. Of
the 30 loci examined, seven showed allele frequencies similar to those found in
African populations in all samples in this study. Significant deviations were observed
for the Hardy-Weinberg equilibrium in all samples analyzed and most can be
explained by a deficit of heterozygotes. Allelic associations in pair-the-pair, the
sample cases Euro-Brazilians showed significant associations. The intrapopulation
diversity ranged from 0.415 in cases african-Brazilians in Ya5_541F locus to 0.503 in
cases african-Brazilians in Ya5ACA866 locus. The estimated mixture was consistent
with the model di-hybrid (African-Americans and Europeans). In all samples the
african-American contribution was higher, which was expected due to the formation
history of the Bahian population. But this contribution was similar in all samples, not
differing african-Brazilian of the Euro-Brazilians.
Word-keys: Polymorphisms, Alu sequence, ancestry, population stratification.

SUMRIO
LISTA DE TABELAS..................................................................................................10
LISTA DE FIGURAS...................................................................................................11
1 INTRODUO.........................................................................................................12
2 REVISO DA LITERATURA...................................................................................13
2.1 POPULAO BRASILEIRA..............................................................................13
2.2 POLIMORFISMOS GENTICOS .....................................................................15
2.3 ORIGEM E EVOLUO DAS INSERES ALU.............................................18
2.4 DOENA ATEROSCLERTICA CORONARIANA...........................................19
2.5 ESTUDOS DE ASSOCIAO DO TIPO CASO-CONTROLE..........................21
2.6 ESTRUTURA POPULACIONAL .......................................................................22
3 OBJETIVO...............................................................................................................25
3.1 OBJETIVO GERAL............................................................................................25
3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS.............................................................................25
4 MATERIAL E MTODOS........................................................................................26
4.1 CARACTERIZAO DA AMOSTRA.................................................................26
4.2 POLIMORFISMOS ESTUDADOS.....................................................................26
4.3 ANLISE LABORATORIAL...............................................................................28
4.3.1 Extrao de DNA.......................................................................................28
4.3.2 Reao em Cadeia de Polimerase (PCR)................................................28
4.3.3 Anlise do Produto Amplificado.............................................................31
4.3.4 Colorao com Nitrato de Prata e Secagem do Gel..............................31
4.4 ANLISES ESTATSTICAS...............................................................................33

4.4.1 Frequncias Allicas e Equilbrio de Hardy-Weinberg.........................33
4.4.2 Associao Par-a-Par entre Loci.............................................................34
4.4.3 Diferenciao gentica das populaes................................................34
4.4.4 Diversidade gnica...................................................................................35
4.4.5 Mistura tnica............................................................................................35
5 RESULTADOS.........................................................................................................36
5.1 FREQNCIAS ALLICAS ..............................................................................36
5.2 EQUILBRIO DE HARDY-WEINBERG..............................................................44
5.3 ASSOCIAES ALLICAS PAR-A-PAR .........................................................46
5.4 DIFERENCIAO GENTICA ENTRE POPULAES..................................47
5.5 DIVERSIDADE INTRAPOPULACIONAL (HS)..................................................50
5.6 MISTURA TNICA............................................................................................51
6 DISCUSSO............................................................................................................53
6.1 FREQNCIAS ALLICAS ..............................................................................53
6.2 EQUILBRIO DE HARDY-WEINBERG..............................................................54
6.3 ASSOCIAES ALLICAS PAR-A-PAR .........................................................55
6.4 DIFERENCIAO GENTICA ENTRE POPULAES..................................57
6.5 DIVERSIDADE INTRAPOPULACIONAL (HS)..................................................57
6.6 MISTURA TNICA............................................................................................58
7 CONCLUSES........................................................................................................60
8 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.......................................................................62
ANEXO I......................................................................................................................69
ANEXO II.....................................................................................................................72
ANEXO III....................................................................................................................74
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Loci genticos, sequncia dos iniciadores, localizao cromossmica e

tamanho do fragmento dos polimorfismos que foram estudados...............................27
Tabela 2 - Componentes da mistura de reao de PCR............................................29
Tabela 3 - Programa utilizado para amplificao das sequncias Alu.......................30
Tabela 4 - Frequncias allicas dos 30 polimorfismos de insero Alu analisados em
casos e controles e nas populaes parentais...........................................................37
Tabela 5 - Probabilidades obtidas com o teste exato para a verificao da aderncia
ao Equilbrio de Hardy-Weinberg nas amostras analisadas.......................................45
Tabela 6 - Probabilidades obtidas com o teste do Equilbrio de Hardy-Weinberg para
verificar o dficit de heterozigotos...............................................................................46
Tabela 7- Diferenciao gnica baseada nos 30 loci entre as quatro populaes,
caso euro-brasileiros (CEB), caso afro-brasileiros (CAB), controle euro-brasileiros
(COEB) e controle afro-brasileiros (COAB)................................................................48
Tabela 8 - Diferenciao genotpica baseada nos 30 loci entre as quatro populaes,
caso euro-brasileiros (CEB), caso afro-brasileiros (CAB), controle euro-brasileiros
(COEB) e controle afro-brasileiros (COAB)................................................................50
Tabela 9 - Diversidade gnica (HS) dos loci nas populaes analisadas.................51
Tabela 10 - Estimativa de mistura tnica nas amostras analisadas, segundo o
mtodo de identidade gnica, considerando os 30 polimorfismos analisados..........52
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Principais origens e destinos de trfico de escravos para o Brasil...........13

Figura 2 Diagrama esquemtico da evoluo da integrao recente de subfamlias
Alu................................................................................................................................19
Figura 3 - Comparao grfica das frequncias allicas da amostra Casos Euro-
brasileiros obtidas no presente estudo com as frequncias das populaes
parentais, Afro-americanos, Europeus e Asiticos.....................................................40
Figura 4 - Comparao grfica das frequncias allicas da amostra Casos Afro-
Figura 5 - Comparao grfica das frequncias allicas da amostra Controles Euro-
Figura 6 - Comparao grfica das frequncias allicas da amostra Controles Afro-
Figura 7 - Estimativas de mistura tnica, africana e europia, a partir dos 30 loci nas
amostras CEB (casos euro-brasileiros), CAB (casos afro-brasileiros) COEB
(controles euro-brasileiros) COAB (controles afro-brasileiros)...................................52
1 INTRODUO
A populao brasileira se caracteriza por apresentar alta heterogeneidade

gentica, formada a partir de diversos grupos tnicos diversificados entre si. Os
estudos casos-controles que investigam a associao entre polimorfismos em genes
candidatos e doenas tm sido amplamente empregados. Entretanto, em
populaes miscigenadas como a brasileira, a existncia de estruturao
populacional pode levar a resultados esprios. Tornando o controle deste fator, um
passo imprescindvel nestes estudos populacionais.
O estado da Bahia caracterizado por uma populao tri hbrida com forte
ascendncia africana tornando de fundamental importncia caracterizar a sua
estrutura populacional.
A estrutura gentica de amostras de casos e controles para doena
aterosclertica coronariana foi examinada usando um conjunto de polimorfismos de
seqncias Alu para avaliar as contribuies africana, europia e amerndia em
indivduos desta amostra. Estas sequncias Alu so excelentes marcadores tnicos,
que investigam a composio gentica de diferentes populaes e podero ser
utilizados para controle da estruturao populacional em estudos genticos
utilizando a metodologia caso-controle.
13
2 REVISO DA LITERATURA
2.1 POPULAO BRASILEIRA
A populao brasileira bastante peculiar em relao a outras populaes do

mundo por ter sido formada a partir da miscigenao de vrios povos que passaram
a co-habitar o Brasil desde 1500, especialmente amerndios, africanos e europeus
(CALLEGARI-JACQUES e SALZANO, 1999). Na poca da chegada dos
portugueses, o Brasil era habitado por vrios povos indgenas, que se distribuam ao
longo de toda a costa. Devida a drstica diminuio da populao indgena,
provocada pelo extermnio, epidemias e o trabalho escravo, foi necessrio
utilizao de uma nova mo-de-obra escrava, os africanos.
A origem dos africanos que foram trazidos para o Brasil foi bastante variada,
tendo envolvido pessoas vindas do ocidente, oriente e sudoeste da frica, bem
como da regio do atual Moambique (em nmero bem menor), sendo que a
maioria originou-se das regies dos atuais, Congo e Angola (KLEIN, 2002). As
cidades Salvador, Recife e Rio de Janeiro constituam na poca os principais
destinos dos africanos que foram trazidos para c (GATTS et al., 2004), conforme
pode ser observado na figura 1.
Figura 1 - Principais origens e destinos de trfico de escravos para o Brasil (Fonte: SOUSA, 2001).
14
Alm dos africanos, amerndios e portugueses, a populao brasileira

recebeu tambm influncia de outros povos na sua formao. Durante o sculo XIX
e incio do sculo XX, outros imigrantes vieram juntar-se aos grupos j existentes,
como italianos, espanhis e alemes, alm dos japoneses e chineses (CALLEGARI-
JACQUES e SALZANO, 1999). A populao brasileira , assim, caracterizada por
grande diversidade tnica e intensa miscigenao.
Em 1800, os negros constituam 47% da populao brasileira, contra 30%
de mulatos e 23% de brancos (IBGE, 2000). Fatores como, por exemplo, a proibio
do trfico de escravos (1850), a elevada mortalidade da populao negra, o forte
estmulo imigrao europia (expanso cafeeira), alm da intensa miscigenao
entre brancos e negros, alteraram profundamente a composio tnica da
populao brasileira. Em 1880, os negros estavam reduzidos a 20% da populao,
contra 42% de mulatos e 38% de brancos.
Assim como o Brasil, a Bahia foi primeira rea de colonizao deste pas e
possui uma populao altamente heterognea, baseada em trs grupos principais,
amerndios, africanos e europeus. No entanto, este estado teve uma miscigenao
mais intensa por parte de africanos e europeus. A chegada dos negros na Bahia se
confunde com a histria dos mesmos no Brasil, tendo em vista que o porto de
Salvador foi um dos mais importantes do incio at o fim do trfico escravo
(TAVARES, 2001).
Nos dias atuais a populao baiana consiste de 75% de indivduos de origem
Africana (GATTS et al., 2004), constituindo-se assim uma das populaes que
melhor caracterizam os afro-descendentes no Brasil.
Recentemente, Callegari-Jacques et al. (2003) analisaram mais de mil
indivduos pertencentes s cinco regies brasileiras. A contribuio europia foi
maior na regio Sul (81%) e menor na regio Nordeste (68%). Ao contrrio, na
regio Sul, a contribuio africana menor (11%), enquanto os maiores valores
foram encontrados nas regies Sudeste e Centro-Oeste (18%). E por fim, a
contribuio amerndia foi menor no Sul e Sudeste do pas (7%) e maior para a
regio Nordeste (17%). Portanto, foi observado um gradiente crescente, norte-sul de
contribuio Europia em concordncia com a histria da formao da populao
brasileira (PEDROSA, 2006).
Dados de marcadores genticos autossmicos e uniparentais em
populaes especiais, afro-descendentes remanescentes de quilombos, mostram
15
grande contribuio africana 53% a 81% nas amostras analisadas de So Gonalo,

Bananal e Barra (SOUSA, 2001; ABE-SANDES, 2002 e BARBOSA et al., 2006). No
entanto no h dados com marcadores moleculares em amostras representativas
do estado da Bahia.
2.2 POLIMORFISMOS GENTICOS
Um polimorfismo gentico refere-se variao em um gene, cromossomo,

ou protena resultando na existncia de duas ou mais formas, cada uma das quais
tem freqncia maior que a que poderia ser mantida apenas por mutao
recorrente.
Como primeiro passo para associar etnia e herana gentica, necessrio
agrupar as populaes humanas de acordo com suas respectivas ancestralidades
(BAMSHAD, 2003). Para determinar diferenas entre grupos populacionais utilizam-
se pequenas variaes no DNA, ou polimorfismos que se caracterizam por
representar uma seqncia de DNA localizada num determinado locus
cromossmico, que difere de indivduo para indivduo, e cujo alelo menos comum
possui freqncia de pelo menos 1%.
A variabilidade de marcadores polimrficos de DNA bem maior do que a
encontrada em seus produtos e esto distribudos por todo genoma, sendo utilizados
para estudos populacionais e na identificao individual (CAVALLI-SFORZA, 1994).
Grande parte dos loci marcadores que apresentam alelos com freqncias
muito diferentes entre grupos populacionais definidos geogrfica e/ ou etnicamente,
os quais se configuram como timos marcadores de individualidade, so
denominados de PSAs (do ingls Population Specific Alleles, SHRIVER, et al.,
1997). Estes marcadores apresentam elevado potencial para discriminar grupos
populacionais e so, portanto, ferramentas eficientes quando se quer estabelecer o
grau de mistura entre as populaes a serem estudadas.
Com a caracterizao dos PSAs tornou-se possvel gerar estimativas mais
precisas das propores ancestrais de uma populao miscigenada (PARRA et al.,
1998; PARRA et al., 2001; SHRIVER et al., 2003). Esses marcadores so
atualmente denominados de AIMs (do ingls Ancestry Informative Markers;
16
BONILLA et al., 2004). Os AIMs podem ser usados para estimar ancestralidade
biogeogrfica em nvel de populao, subgrupo e individual (SHRIVER et al., 2003).
Pequenos fragmentos do DNA conhecidos como polimorfismos de insero
Alu so amplamente utilizados (BATZER & DEININGER, 2002). As inseres Alu
fazem parte da famlia de DNA repetitivo SINE (short interspersed nuclear elements)
e so originrias de um retrotransposon. Ocasionalmente, as seqncias Alu
replicam-se e as cpias resultantes se dispersam aleatoriamente para novas
posies no cromossomo de origem, ou em outro cromossomo, geralmente em
reas que no provocam efeitos no funcionamento dos genes que esto prximos
(BATZER & DEININGER, 2002). Segundo Batzer e Deininger (1994), se duas
pessoas tm a mesma seqncia Alu no mesmo local do seu genoma, elas
descendem de um antepassado comum que lhes forneceu aquele segmento
especfico de DNA. Isto porque, improvvel que o evento de insero ocorra duas
vezes em um mesmo locus.
Estas inseres poderiam ser excelentes marcadores tnicos e, ento, de
grande uso para estimar a composio tnica de populaes hbridas como a
populao brasileira (MENDES Jr. & SIMES, 2001). Estes polimorfismos so
altamente informativos em estudos de gentica de populaes, permitindo sua
utilizao como instrumento de investigao para caracterizar a composio
gentica de diferentes povos, uma vez que possui freqncias diferenciadas para
cada etnia (RAY et al., 2005).
Um estudo realizado com trs marcadores de insero Alu (TPA25, PV92 e
APO) mostrou um grande diferencial de freqncias allicas no locus PV92 entre
Amerndios/Africanos e Amerndios/Europeus, e no locus APO entre
Africanos/Europeus. O locus TPA25 foi o nico que mostrou homogeneidade na
distribuio das freqncias allicas em todos os grupos analisados. As freqncias
gnicas na amostra exibiram valores que so intermedirios entre aqueles descritos
para Europeus e Africanos refletindo a contribuio destes dois grupos tnicos na
formao da populao brasileira (MENDES JR. & SIMES, 2001).
Cotrim et al. (2004) analisaram quatro loci polimrficos Alu (APO, ACE, TPA
e FXIIIB), em uma amostra de indivduos de seis populaes derivadas de Africanos
(remanescentes de quilombos) do Vale do Rio Ribeira, e uma amostra de indivduos
do estado de So Paulo. As quatro inseres Alu foram polimrficas em todas as
populaes. O nmero de heterozigotos observados e esperados foi maior nos
17
remanescentes de quilombos do que na amostra de indivduos do Estado de So

Paulo, segundo estes autores possvel que esta populao tenha sofrido um
significante grau de fluxo gnico. Para Silva - Jr. et al. (1999), a eventual diversidade
perdida pelo isolamento pode ter sido compensada pela miscigenao de diferentes
grupos tnicos (Africanos, Europeus e Amerndios) no momento de fundao dos
quilombos. Alm da miscigenao dos trs grupos tnicos formadores, outra
possvel explicao seria a diversidade de grupos Africanos que foram trazidos
juntos em navios como escravos para o Brasil.
Com o objetivo de investigar a variao gentica entre populaes amerndias
foi analisada uma amostra composta por 193 indivduos de quatro tribos Amerndias,
utilizando 12 polimorfismos de inseres Alu (cinco deles nunca estudados nestas
populaes) e um grupo de 22 protenas sanguneas. Os testes padres de
diferenciao intertribal e outros aspectos de sua variao foram congruentes nos
dois grupos (Alu; grupo protico). Considerando a heterozigose as inseres Alu e
as protenas sanguneas mostram essencialmente o mesmo padro com valores
similares. A variabilidade total devido a diferenas inter-populacionais foram
similares considerando os polimorfismos Alu e grupos proticos (0,26; 8%; 0,23;
10%, respectivamente) (BATTILANA et al., 2002).
Estudos feitos utilizando os marcadores informativos de ancestralidade que
apresentam um alto diferencial de freqncia allica (maior que 45%) entre
Africanos e Europeus mostraram que em nvel populacional era possvel estimar de
forma precisa, o grau de mistura africana e europia em uma populao norte
americana (PARRA et al., 1998).
Com o objetivo de verificar se o grau da aparncia fsica dos indivduos est
relacionado sua ancestralidade genmica africana, PARRA et al. (2003) utilizaram
o mesmo conjunto de AIMs descritos por PARRA et al. (1998) e descreveram o
ndice individual de ancestralidade genmica africana permitindo a estimativa de
ancestralidade genmica africana em nvel individual. Mostraram tambm que todas
as estimativas em amostras brasileiras, baseadas em auto-classificao,
apresentaram ndice de ancestralidade africana (IAA) intermedirio entre Europeus
e Africanos (PARRA et al. 2003).
Os maiores valores de ancestralidade africana foram encontrados nas
regies Nordeste e Sudeste, entretanto as regies Norte e Sul mostraram valores
menores para o IAA. Os resultados obtidos para amostras de brasileiros brancos
18
das quatro regies do pas mostraram contribuio africana superior a 10% em mais
de 75% da amostra de brancos das regies do Norte, Nordeste ou Sudeste. No Sul,
apesar da forte imigrao europia o percentual de brancos com IAA acima de 10%,
mostrou-se alto (49%). Em termos comparativos os dados fornecidos por Shriver et
al (2003) para brancos norte-americanos, apenas 11% deles apresentaram IAA
superior a 10%. A concluso desse estudo de que pelo menos 77 milhes de
pessoas em nosso pas apresentam mais de 90% de contribuio africana, sendo
esta de enorme significncia para a constituio da populao brasileira.
Os polimorfismos de insero Alu escolhidos neste trabalho apresentam
poucos dados em populaes mundiais (WANG et al., 2006, RAY et al., 2005), mas
mostram um amplo diferencial de freqncia (>40%).
2.3 ORIGEM E EVOLUO DAS INSERES ALU
As subfamlias Alu originaram-se como um resultado de mutaes que

ocorreram na existncia de elementos master ou novos elementos de origem
capazes de uma amplificao significante (ROY-ENGEL et al., 2001).
O termo 'elemento repetitivo' descreve vrias seqncias de DNA que esto
presentes em mltiplas cpias nos genomas em que eles se encontram. Sendo que
as inseres Alu esto includas no grupo dos elementos repetitivos (BATZER e
DEININGER, 2002).
Durante os ltimos 65 milhes de anos, os elementos Alu tm propagado
mais do que um milho de cpias em genomas primatas, e isto tem resultado na
gerao de uma srie de subfamlias Alu de diferentes idades (BATZER &
DEININGER, 2002). Com isso, quase todas as subfamlias da recente integrao
dos elementos Alu dentro do genoma humano so chamadas de subfamlias
jovens, so elas: Y, Yc1, Yc2, Ya5, Ya5a2, Ya8, Yb8 e Yb9, (compreendendo
menos de 10% dos elementos Alu presente no genoma) a maioria existente so
membros da subfamlia Ya5 e Yb8 (ROY et al., 2000).
A recente integrao dos elementos serve como marco temporal na evoluo
do genoma, e muitos deles provaram ser teis no estudo da evoluo humana e no
estudo da histria natural de diferentes regies do genoma (CARROL et al., 2001).
19
As jovens subfamlias Alu so comumente ativas no que diz respeito

retrotransposio, diferentemente das velhas subfamlias Alu (Sx, J e Sg1).
Ressalta-se que as velhas subfamlias compreendem a maioria dos elementos Alu
presente no genoma (ROY et al., 2000).
A relao e a evoluo das subfamlias Alu so apresentadas e descritas na
figura 2.
Figura 2 Diagrama esquemtico da evoluo da integrao recente de subfamlias Alu. Todas as

origens das subfamlias Alu. Todas as origens das jovens subfamlias Yb9, Yc1 e Yc2 so mostradas
depois a divergncia das subfamlias Yb8 e Y, respectivamente. O tamanho da fonte relativo ao
nmero de elementos dentro de cada subfamlia, o maior representante possui 100.000-200.00
cpias; o mdio 1.000-2.000 cpias; e o menor 50-500 cpias. O nmero total de elementos de cada
subfamlia ligados doena indicado direita. A proporo de elementos polimrficos dentro de
cada famlia representado por: elementos polimrficos raramente encontrados; +, baixa
percentagem de elementos polimrficos; ++, 50% dos elementos so polimrficos; +++, quase todos
elementos so polimrficos. (Adaptado de: ROY-ENGEL et al, 2001).
2.4 DOENA ATEROSCLERTICA CORONARIANA
A amostra utilizada no presente estudo constituda por pacientes que

realizaram o exame de cineangiocoronariografia. A amostra foi dividida em amostras
caso/controle de acordo com a presena da doena arterial coronariana.
Aterosclerose um processo dinmico, evolutivo, a partir de dano endotelial
de origem multifatorial, com caractersticas de reparao tecidual. Entretanto, o
20
processo tem incio numa idade bastante precoce, tanto assim que, ao atingir a
idade adulta, a maioria dos homens (e as mulheres em menor escala) apresenta
evidncia de aterosclerose das artrias coronrias (BATISTA, 2000).
Os fatores de risco so capazes de predispor e/ou causar leses diretamente
no endotlio vascular levando a disfuno endotelial (ROSS, 2000). A partir do dano
vascular, ocorre a expresso de molculas de adeso que mediaro entrada de
moncitos em direo ao espao intimal. Estes, por sua vez, englobaro
lipoprotenas modificadas [predominantemente lipoprotenas de baixa densidade
(LDL) oxidadas originando as clulas espumosas. Diferentes mediadores
inflamatrios so liberados no espao intimal, perpetuando e ampliando o processo,
levando finalmente formao da placa aterosclertica (ROSS, 2000).
Durante os ltimos 30 anos se tem presenciado um declnio razovel da
mortalidade por causas cardiovasculares, em pases desenvolvidos, enquanto que
elevaes relativamente rpidas e substanciais tm ocorrido em pases em
desenvolvimento, dentre os quais o Brasil um dos representantes (SOCIEDADE
BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA, 1996). No Brasil, a doena aterosclertica
coronariana uma das principais causas de morte (Servio de Informao sobre
Mortalidade Ministrio da Sade, 2001).
De acordo com as projees da Organizao Mundial de Sade, essa
tendncia de elevao na doena cardiovascular tende a persistir, agravando ainda
mais o quadro de morbidade e mortalidade elevadas nos pases em
desenvolvimento.
O perfil lipdico desfavorvel e elevao da presso arterial, particularmente
em conjunto a outros fatores de risco como a obesidade, diabetes e a predisposio
gentica esto associados ao maior desenvolvimento da aterosclerose (Ministrio
da Sade, 2001).
A maioria das doenas humanas so polignicas e multifatoriais, ou seja, so
governadas por muitos genes e so causadas por um conjunto de fatores que agem
conjunta e simultaneamente. Genes individuais tm papel sutil na expresso de
qualquer patologia polignica. Alm disso, existem variveis no genticas, quer
individuais (gnero, origem, etnia, entre outras.) ou ambientais (tabagismo, consumo
de lcool, entre outras.) que so de grande importncia nos estudos de associao
entre fatores genticos e o risco destas patologias (KATO, 2002).
21
Devido ao carter tri hibrido da populao brasileira e da forte influncia

afro - descendente no estado da Bahia de fundamental importncia caracterizar a
sua estrutura populacional, uma vez que estudos de associao realizados entre
indivduos no-aparentados em populaes miscigenadas podem ser susceptveis a
erro devido estratificao populacional. Nesses casos necessrio, quantificar o
efeito da mistura recente na estrutura da populao e fazer a correo utilizando
modelos estatsticos populacionais (HINDS et al., 2004).
2.5 ESTUDOS DE ASSOCIAO DO TIPO CASO-CONTROLE
Estudos de Associao permitem determinar se uma variante gentica

especfica mais comum em pessoas com a doena do que em pessoas sem a
doena. Muitos estudos de associao utilizam o tradicional mtodo caso-controle
em que a presena da variante gentica comparada entre as pessoas com a
disordem (casos) e aquelas pessoas que no tm a disordem (controles).
Dependendo da caracterstica sob investigao, os estudos de associao
podem ser do tipo populacional ou baseado em famlias.
Estudo de associao baseado na populao compara as diferenas das
freqncias allicas de genes candidatos entre indivduos afetados e controles, no-
afetados e no-relacionados (RISCH, 2000).
J os estudos baseados em famlias levam em conta a transmisso da
caracterstica dos pais para um filho afetado, ou seja, os alelos no-transmitidos so
usados como controle (CARDON & PALMER, 2003).
Segundo Pritchard e Rosenberg (1999), um dos maiores problemas dos
estudos de associao a estratificao gentica que pode ocorrer devido
utilizao de indivduos miscigenados ou de diferentes grupos continentais.
A consequncia seria a obteno de resultados esprios em estudos de
associao gentica. Em situaes como esta, tem-se uma maior representao de
indivduos com ancestralidade para um determinado grupo entre os casos e, assim,
alelos mais frequentes neste grupo populacional aparecero espuriamente
associados doena em questo (KNOWLER et al., 1988). Na populao brasileira
22
esse fato deve ser levado em considerao para os estudos de associao gentica
a fim de se evitar esse erro.
Entretanto, se casos e controles so adequadamente igualados para
potenciais confundidores, tal como idade, sexo, etnia ou origem geogrfica, e
tambm outros fatores confundidores especficos de doenas, ento justo assumir
que a estratificao populacional no suficiente para explicar a associao
observada (ARDLIE et al, 2002).
2.6 ESTRUTURA POPULACIONAL
Um modelo de populao estratificada pode ser definido, como aquele que

contm vrios subgrupos que permaneceram, em sua maior parte, geneticamente
distinto durante a evoluo. Muitos distrbios genticos so caracterizados por
mutaes allicas que variam em freqncia entre populaes de diferentes grupos,
provavelmente porque um pequeno nmero de mutaes ancestrais tornou-se
prevalecente em determinadas populaes devido estratificao (MARCHINI et
al., 2004).
A existncia de variantes allicas especficas de populaes tem um
significado para a compreenso das origens das doenas genticas e tambm cria
oportunidades para o diagnstico de alelos especficos em uma populao de risco.
Estudos de associao tm sido amplamente utilizados para ajudar no
entendimento da base gentica de traos quantitativos, tal como a susceptibilidade
para doenas complexas (ZEMBRZUSKI et al., 2006).
Entretanto, essas diferenas podem, muitas vezes, no ser detectadas.
Assim, a no-deteco de estratificao populacional pode levar a associaes
esprias entre um marcador candidato e um determinado fentipo (RISCH, 2000;
HINDS et al., 2004). Isto significa que tanto o distrbio quanto o alelo
aparentemente associados so comuns na populao que est sendo estudada
A possibilidade de associaes falsas deve-se, principalmente, populao
amostrada, caracterstica em estudo e/ou ao marcador que est sendo testado
(ZIV & BURCHARD, 2003). Talvez o fator mais importante que leva a tais
associaes esteja relacionado s caractersticas da populao, principalmente a
etnia (RISCH, 2000; SANTOS et al., 2002)
23
Diferenas sistemticas na ancestralidade entre casos e controles podem

ser encontradas quando subgrupos populacionais distintos geneticamente tm uma
prevalncia diferente do fentipo alvo (HINDS et al., 2004).
Dez marcadores informativos de ancestralidade (AIMs) foram investigados
em 101 pacientes com doena arterial coronariana e em 102 controles saudveis de
uma populao da regio sul do Brasil, a fim determinar a ocorrncia de
estratificao nesta populao. O grau de miscigenao africana detectado nesta
populao foi estimado sendo maior que 6%, mas nenhuma diferena entre casos e
controles foi observada. Usando o ndice de ancestralidade africana (IAA) foi
possvel detectar nveis individuais de ancestralidade africana e remover da amostra
aqueles indivduos com evidencia de contribuio africana, pois este seria um fator
confundidor. Conseqentemente, mostrou-se que possvel controlar a
estratificao da populao escolhendo indivduos, sem a perda do poder estatstico
que ocorre com o uso de outros mtodos do controle genmico (ZEMBRZUSKI et
al., 2006).
Um estudo realizado por Seldin et al. (2007) mostra a estrutura gentica da
populao da Argentina examinada usando um conjunto de 78 AIMs para avaliar as
contribuies europia, amerndia e africana em 94 indivduos desta populao. O
programa utilizado para os clculos estatsticos foi o STRUCTURE, as contribuies
mdias europia, amerndia e africana foram de respectivamente, 78%, 19,4% e
2,5%. Resultados similares foram encontrados quando se utilizou o mtodo do
quadrado mdio: europeu, amerndio e africano 80,2%, 8,1% e 1,7%,
respectivamente. Consistente com os estudos anteriores os resultados atuais
mostraram muito poucos indivduos (quatro de 94) com miscigenao africana no
superando 10%. Notavelmente, quando se utilizou o ndice de miscigenao
individual, os amerndios e os europeus mostraram uma variao muito grande com
uma contribuio individual de amerndios que variou de 1,5 a 84,5% nos 94
indivduos argentinos. Estes resultados indicam que ndices de miscigenao devem
ser considerados quando estudos casos-controle so realizados nestas populaes.
Alm disso, o estudo atual mostra que um conjunto de SNPs informativos possam
ser usados para verificar ou para controlar potenciais estruturaes que esto
ocultas. Alm disso, a variao da miscigenao em indivduos argentinos sugere
que esta populao apropriada para futuros estudos de miscigenao.
24
Para Enoch et al. (2006), a probabilidade de detectar a estratificao

aumenta com o nmero de marcadores analisados, visto a probabilidade que um
marcador tem de variar entre duas populaes que sero testadas.
25
3 OBJETIVO
3.1 OBJETIVO GERAL
Caracterizar as freqncias de 30 polimorfismos de insero Alu em casos e

controles de uma amostra populacional de coronariopatas do estado da Bahia.
3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS
Estimar as freqncias allicas e genotpicas dos marcadores estudados

nestas amostras;
Estimar parmetros de diversidade gentica intrapopulacional;
Quantificar a mistura tnica;
Verificar as associaes allicas par - a - par entre pares de loci no ligados;
Investigar marcadores informativos de ancestralidade africana, amerndia e
europia nas amostras estudadas, no intuito de avaliar a possibilidade de
estruturao da populao.
26
4 MATERIAL E MTODOS
4.1 CARACTERIZAO DA AMOSTRA
A amostra estudada foi previamente coletada pelo grupo do Prof. Domingos

Lzaro Souza Rios no Centro de Pesquisa Gonalo Moniz/ Fundao Osvaldo Cruz,
Bahia. A amostra composta de 841 indivduos que procuraram o servio de
Hemodinmica do Hospital Santa Izabel em Salvador BA para a realizao de
cineangiocoronariografia devido a sintomas relacionados a doena arterial
coronariana. Na poca da coleta (2004-2005) este servio era o nico na Bahia a
realizar este exame pelo Sistema nico de Sade, recebendo a demanda de todo o
estado. Da amostra coletada 500 indivduos apresentaram leses aterosclerticas
significantes (obstruo da luz arterial > 50%) em coronrias e 341 no
apresentaram leses visveis no exame. Dos 841 indivduos estudados 312 foram
classificados como Afro-descendentes e 529 como Caucasides de acordo com os
critrios morfolgicos descritos por Azevdo (1980) com modificaes. Foram
considerado Euro-descendentes (brancos e mulatos claros) e Afro-descendentes
(mulatos mdios, mulatos escuros e negros). Ento, as amostras foram
consideradas casos (euro-brasileiros e afro-brasileiros) e controles (euro-brasileiros
e afro-brasileiros).
O protocolo de pesquisa foi avaliado e liberado pelo comit de tica do
Hospital Santa Isabel. Todos os pacientes foram informados dos riscos e benefcios
potenciais da pesquisa e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido
(Anexo III).
4.2 POLIMORFISMOS ESTUDADOS
Foram estudados 30 polimorfismos de seqncia Alu (Tabela 1), estes

foram escolhidos por apresentarem altos diferenciais de freqncias entre as
populaes asiticas, afro-americanas e europias
(http://falcon.roswellpark.org:9090/).
27
Tabela 1 - Loci genticos, seqncia dos iniciadores, localizao cromossmica e tamanho do

fragmento dos polimorfismos que foram estudados.
Localizao
Tam. dos fragmentos (pb)
Loci Seqncia dos Iniciadores cromossmica
Del / Ins
5ACGTAAGCCTCAAAAAGGCA3
Ya5ACA647 1p31.1 58 / 375
3GGCACTGCAGATACAGTGTGA5
5'TAGGGTAAGGAATATGTGCTGCTTTAG3
Ya5ACA733 1q24.2 175 / 500
3'GTCTCTGAACGACTATGTGAGCAG5
5'TATGGTTCTCAGCCATCACG3
Ya5NBC45 20q11.23 265 / 591
3'ATTCTTCCCCAAAGGGAGTC5
5'TCTGGGTTTCTCTGGTGGAC3
Ya5ac1982 10q11.22 148 / 470
3'CTGGCAAATGCTACCCAAGT5
5TGGCCTGTTTTCACACCTTT3'
Ya5ACA917 2p13.1 171 / 500
3'CCAAAGCAACTTGCACCTTT5
5TTCCTCTGAAAGGCTGGAAA3'
Ya5ACA1400 5q31.1 379 / 677
3'AAACTGAAAATGCAGGTGCC5
5TGGAAAGCAGAGAAATGCTG3'
Ya5ac2282 13q14.2 167 / 498
3'GCTGTTATATGAAGTGTTCACCTTG5
5CAAATGCAATTGGAGTGTTCA3'
Ya5ACA1441 6q15 541 / 849
3'ATTGGGCTAAGCACAGGATG5
5CTCGTGATTCACAGAAGTGTTGTAAG3'
Ya5NBC132 6p22.2 228 / 458
3'CGGGGTTCATCCTTAATACATACAT5
5TGGGCAGAGTGAATATCCTTTAG3'
Ya5ac2670 19p12 159 / 476
3'GACCTTGGTCCTTATTGTCTTCC5
5TTTGTTGATCCAGTTTTATATGGC3'
Ya5ACA1555 6q12 103 / 446
3'CGGTTGGTTTCAATGTCCTT5
5TATGGTTCTCAGCCATCACG3'
Yb8NBC157 10p11.22 423 / 712
3'ATTCTTCCCCAAAGGGAGTC5
5AAATGGAGACACAGAGGTGTAAAGA3'
Ya5NBC150 19q13.41 169 / 491
3'CCCAAACTGCATATTTAAAGGGTAG5
5GGGGTTGGAGAACCCTGTTA3'
Ya5ACA1002 3p24.3 132 / 457
3'AAGGAGTAGATTGTGATGGCCT5
5AGGCAGGTTCAATGTTCAAA3'
Ya5NBC327 6p12.3 339 / 668
3'TTGTCTTATTGTGCTGGCTAGA5
5GCGAGGGCCTTATAAAAGATG3'
Ya5ACA1242 4q26 151 / 471
3'ATTGGGTTTCACATCCGTGT5
5GCAAACACAGTGCCACAAGT3'
Ya5_531F 16p12.1 195 / 502
3'TGGGGATGTGACCCAAGTAT5
5AAGTGAGTCCCAGGGCCTTCT3'
Yb8NBC93 20p12.3 274 / 601
3'CACACAGGCACTTGTTTGGT5
5TTTCATCTTTCTAGGCTTCACG3'
Ya5ACA928 2q31.1 125 / 445
3'TCCTAGCCATAAATCACAAATCA5
5GCATCCTACAAAGCCATT3' 3q25.2
Ya5ACA1100 170 / 492
3'GCCTGGGCAATAATTTTCAA5
5CATGCTTCAAGAGAACATCAGG3'
H7_F_148 7q34 630 / 1401
3'TCTGGTTGCTTGCAGAGAGTAA5
5TGGCTCTAATGACCAAAAGGA3'
Ya5ACA1184 4p13 150 / 467
3'CCCAGGTGATTCATTCCATC5
5GAAAACCACACCAAATTGCAT3'
Ya5ACA866 2p22.3 106 / 426
3'CCGCTCTGTAGAAAATGCGT5
28
Localizao
Tam. dos fragmentos (pb)
Loci Seqncia dos Iniciadores cromossmica
Del / Ins
66 / 392
5GGTTCCAATAGAGAGCAACAGAA3'
Ya5NBC241 15q15.3
3'ACCTTAAGCTTTCCCCCAGA5
122 / 437
5AACTGGGAAAATTTGAAGAAAGT3'
PV92 16
3'TGAGTTCTCAACTCCTGTGTGTTAG5
141 / 471
5GGATTGGGAAAGGTGTTGAA3'
Ya5_541F 10p11.21
3'TGGCTGAGAAAACCTGCAAT5
375 / 503
5TCTCTACCCAGCTTTACCAA3'
Yb8NBC67 6p22.2
3'GAGGACCAGCTTAGTTTGTG5
149 / 485
5TCAGAGTAATGCACACAGATGCT3'
Ya5ACA862 2q11.2
3'TGCATTAAGTGCTCCAGAAGG5
148 / 466
5GTAGCTTGGCCTGTGCTCTT3'
Ya5NBC354 7q32.1
3'CCTCTGGGCTGAGAAACTCTT5
184 / 496
5 TTTTGGTAAAGATGCCACAGAA3'
Ya5ACA1611 7q31.1
3' TCCTAAACATAATACGTACAGGTGA5
4.3 ANLISE LABORATORIAL
4.3.1 Extrao de DNA:
O DNA foi extrado no Centro de Pesquisas Gonalo Moniz/ Fundao

Oswaldo Cruz, Bahia. A extrao do DNA foi realizada com a tcnica de salting-out
(Anexo I), segundo Lahiri e Nurnberger (1991). O mtodo de salting out utiliza
soluo saturada de cloreto de sdio para a precipitao de protenas.
Posteriormente as molculas de DNA que se encontram no sobrenadante so
precipitadas pela adio de etanol absoluto.
4.3.2 Reao em Cadeia de Polimerase (PCR)
O DNA genmico foi amplificado utilizando a tcnica da PCR-multiplex,

segundo as condies padronizadas no Laboratrio de Gentica Molecular da
UESB. Em cada multiplex foram amplificados trs marcadores simultaneamente. A
reao da PCR foi feita utilizando um microtubo tipo eppendorf de 0,5 ml contendo
os componentes descritos para cada locus (Tabela 2). Em seguida a mistura de
PCR foi distribuda em microtubos para cada amostra de DNA, sendo estes
29
numerados corretamente. Por fim, 3L de DNA genmico foi adicionado nos

microtubos contendo a mistura da PCR.
Tabela 2- Componentes da mistura de reao de PCR
Loci gua deionizada Tampoa DNTPsb Primers (2,5 uM) MgCl2 (2,0 Mm) Taq Polimerase
(1U/L)
Ya5ACA647 1,0L
Ya5ACA733 13,2L 2,5L 0,2L 1,0L 2,0L 0,1L
Ya5NBC45 1,0L
Ya5ac1982 0,5L
Ya5ACA917 11,2L 2,5L 0,2L 0,5L 2,0L 0,1L
Ya5ACA1400 0,5L
Ya5AC2282 1,0L
Ya5ACA1441 11,2L 2,5L 0,2L 1,0L 2,0L 0,1L
Ya5NBC132 1,0L
Ya5AC2670 1,0L
Ya5ACA1555 11,2L 2,5L 1,0L 0,1L

0,2L 2,0L
Yb8NBC157 1,0L
Ya5NBC150
1,0L
Ya5ACA1002 0,1L
11,2L 2,5L 0,2L 1,0L 2,0L
Ya5NBC327
1,0L
Ya5ACA1242
1,0L
Ya5_531F 11,1L 2,5L 0,2L

0,2L 1,0L 2,0L
Yb8NBC93
1,0L
Ya5ACA928
1,0L
Ya5ACA1100
11,2L 2,5L 0,2L 1,0L 2,0L 0,1L
H7_F_148
1,0L
Ya5ACA1184
1,0L
Ya5ACA86
1,0L
30
Loci gua deionizada Tampoa DNTPsb Primers (2,5 uM) MgCl2 (2,0 Mm) Taq Polimerase
(1U/L)
Ya5NBC241
1,0L
9,1L 2,5L 2,0L
PV92 9,1L 2,5L 2,0L
0,2L 1,0L 0,2L
Ya5_541F
0,2L 1,0L 0,2L
Yb8NBC67 11,1L 2,5L 2,0L

0,2L 1,0L 0,2L
Ya5ACA862
1,0L
Ya5NBC354
0,2L 1,0L 0,2L
11,1L 2,5L 2,0L
Ya5ACA1611
1,0L
a
Tris HCL 75 mM ph 9,0; KCL 50 mM; 20 mM (NH4)S04
b
0,25 L de soluo (10 mM de cada base)
A soluo da PCR juntamente com o DNA genmico foram submetidos a um

programa especfico no termociclador para a realizao da amplificao (Tabela 3).
Tabela 3- Programa utilizado para amplificao das seqncias Alu
Quantidade de ciclos Temperatura/ Tempo

1 ciclo 94 C por 5 minutos;
94 C por 30 segundos;
5 ciclos 58 C por 45 segundos;
1 ciclo 72 C por 10 minutos
1 ciclo 20 C indefinidamente;
31
4.3.3 Anlise do Produto Amplificado
Depois do trmino da PCR, as amostras foram submetidas eletroforese em

gel no desnaturante de poliacrilamida a 8%. O preparo dos reagentes e solues
so descritos no Anexo II. Para a montagem do gel foi utilizado um tubo falcon, onde
foi colocado primeiramente 5ml de poliacrilamida; 5ml de TBE 5x; 15ml de gua.
Os catalisadores da reao de polimerizao do gel, TEMED e persulfato de
potssio foram adicionados mistura do gel imediatamente antes de verter a mistura
em um cassete previamente montado, composto de duas placas de vidro separadas
por espaadores de teflon e presas com grampos. Logo aps a mistura de gel ter
sido vertida, um pente de teflon foi colocado na borda superior, formando poos no
gel, onde posteriormente foram aplicadas as amostras de DNA amplificado.
Aguardou-se a polimerizao por no mnimo 30 minutos.
Aps a polimerizao do gel o pente foi retirado e os poos foram lavados
com gua. O gel polimerizado foi montado em cuba de eletroforese vertical contendo
tampo TBE, para cubas, em ambos os plos (poro superior e inferior). Esta cuba
foi conectada a uma fonte de voltagem, Amershan Pharmacia Biotech (EPS 1001),
ajustada voltagem ou corrente constante necessria para uma boa separao dos
fragmentos amplificados e as amostras amplificadas foram aplicadas nos poos.
4.3.4 Colorao com Nitrato de Prata e Secagem do Gel
Reagentes e solues:
Soluo de nitrato de prata: 10 g nitrato de prata; 100 ml de H2O.

Dissolver a prata em uma parte da gua e depois completar com o
restante, manter a soluo ao abrigo da luz (volume final 100 ml).
Soluo fixadora: 160 ml etanol (PA) e 7 ml de cido actico glacial (PA);
833 ml de H2O (volume final 1l).
Soluo reveladora: 22,5 g de NaOH; 1l de H2O. Dissolver em um agitador
o hidrxido de sdio em uma parte da gua e depois completar com o
restante (volume final 1l). Na hora da colorao adicionar 1 ml de
formaldedo para cada 100 ml da soluo.
32
Procedimento:
A colorao do gel foi feita de acordo com protocolo adaptado de Sanguinetti

et al. (1994):
Fixao: Aps a retirada das placas de vidro e dos espaadores o gel foi
colocado em um recipiente de vidro contendo 100 ml de soluo fixadora.
Impregnao com Nitrato de prata: Adicionou-se 2,0 ml de soluo de
nitrato de prata, e agitou-se por 5 minutos. A soluo foi ento descartada
e o gel lavado em gua por cerca de 10 segundos, agitando levemente e,
ao final, descartando a gua.
Revelao: A soluo reveladora foi despejada cuidadosamente no
recipiente contendo o gel, que foi submetido agitao por alguns
minutos at que as bandas aparecessem nitidamente. Esta soluo foi
pr-aquecida em estufa, para facilitar a reao de colorao, que no frio
fica mais lenta.
Bloqueio da reao: Aps ter sido revelado, a soluo reveladora foi
descartada e a reao bloqueada com a lavagem direta do gel em 100 ml
de soluo fixadora. No caso de gis maiores (22 cm) adicionou-se o
dobro das solues.
Secagem do gel: Aps a leitura, todos os gis passaram por um simples
processo de secagem para que pudessem ser armazenados para
anlises e confirmaes posteriores. Duas folhas de papel celofane foram
molhadas; uma placa de vidro, com a rea maior que a do gel, foi coberta
com uma das folhas; o gel foi colocado sobre a placa com o celofane sem
deixar bolhas; o gel foi ento bem molhado e coberto com a outra folha de
celofane, tambm com cuidado de no deixar bolhas; este gel foi deixado
secando a temperatura ambiente por dois ou trs dias at a secagem
completa, sendo ento devidamente identificado e arquivado.
33
4.4 ANLISES ESTATSTICAS
4.4.1 Freqncias Allicas e Equilbrio de Hardy-Weinberg
As freqncias allicas foram obtidas por contagem gnica direta a partir da

leitura dos gis de poliacrilamida, sendo ento utilizadas para a estatstica
descritiva, utilizando o programa GENEPOP (RAYMOND e ROUSSET, 1995). A
freqncia allica dada por:
2nii + nij
Xi =
2n
Em que:
Xi= freqncia allica;
nii e nij = correspondem ao nmero de homozigotos e heterozigotos para o

alelo i;
n = nmero de indivduos observados;
A aderncia das freqncias genotpicas observadas s propores tericas

de Hardy-Weinberg foi verificada com o emprego do programa GENEPOP
(RAYMOND e ROUSSET, 1995b) verso 2.0 para Windows. Foram realizados
trs testes baseados na hiptese nula de unio aleatria dos gametas: teste de
probabilidade, teste para deteco da deficincia e para deteco do excesso de
heterozigotos.
No teste de probabilidade, o valor de P corresponde soma de
probabilidades de todas as tabelas com probabilidade menor ou igual ao observado.
O segundo e o terceiro so testes mais sensveis do que o de probabilidade e
utilizam uma hiptese alternativa (H1) de excesso ou de deficincia de
heterozigotos, respectivamente.
O nvel de significncia foi estabelecido em 0,05, mas foram includos
tambm os resultados da correo de Bonferroni, que consiste em dividir o
pretendido pelo nmero de testes independentes realizados (WEIR e
34
COCKERHAM, 1996). Considerando todos os loci analisados, o novo (Bonf) foi

estabelecido em 0,05/31-1= 0,001.
4.4.2 Associao Par-a-Par entre Loci
A anlise de associaes par-a-par entre loci foi realizada utilizando-se o

programa GENEPOP 2.0 (RAYMOND & ROUSSET, 1995b). A hiptese nula de
que a distribuio genotpica em um locus independente da distribuio em outro
locus. Esta anlise foi aplicada para verificar desvios do esperado pela regra de
multiplicao entre pares de loci localizados em diferentes cromossomos. A palavra
ligao neste caso no est relacionada com associao fsica entre alelos de loci
de um mesmo cromossomo.
Com a realizao de mltiplos testes, no caso um para cada par de loci sendo
testado, sob a mesma H0 utilizando os mesmos loci, aumentam as chances de se
cometer um erro do tipo I (Ha, 2008) e, com isso, um aumento no real em
aproximadamente o nmero de testes independentes realizados.
O nvel de significncia foi estabelecido em 0,05, mas foram includos tambm
os resultados da correo de Bonferroni, que consiste em dividir o pretendido pelo
nmero de testes independentes realizados (WEIR e COCKERHAM, 1996). Para as
quatros amostras analisadas, o novo (Bonf) foi estabelecido em 0,05/465-1=
0,00018.
4.4.3 Diferenciao gentica das populaes
Os testes exatos para diferenciao populacional foram realizados com o

uso do programa GENEPOP 2.0 (RAYMOND & ROUSSET, 1995b). Este utiliza
tabelas de contingncia RxC geradas automaticamente para cada locus, em que R
o nmero de populaes e C o nmero de alelos no locus.
Este procedimento compara cada locus em pares de populaes, para
determinar se existem diferenas nas freqncias allicas observadas, onde a
hiptese nula testada a de que a distribuio allica idntica entre as
populaes (RAYMOND & ROUSSET, 1995a) .
35
A diferenciao genotpica para os loci autossmicos foi realizada pelo teste

exato G (GOUDET, 1996) que tem o mesmo princpio e testa a hiptese nula onde a
distribuio genotpica idntica entre as populaes.
4.4.4 Diversidade gnica
A anlise de diversidade gentica foi estimada usando o parmetro HS (NEI,

1987) usando o programa FSTAT 2.8 (GOUDET, 1996).
Em que:
HS = a heterozigose mdia dentro das populaes, ou diversidade gnica;
A diversidade gnica mdia ( H S ) com o respectivo erro padro foi calculada

para cada amostra utilizando o programa DISPAN (OTA, 1993) , conforme a
equao 8.6 apresentada em Nei (1987).
4.4.5 Mistura tnica
As estimativas de mistura tnica foram obtidas por meio do mtodo de

identidade gnica (CHARKRABORTY, 1985) com o auxlio do programa ADMIX2. O
ajuste a este modelo avaliado pelo coeficiente de correlao mltipla (R 2) entre as
freqncias allicas nas populaes hbridas e aquelas das populaes ancestrais
(CHARKRABORTY, 1986).
Para o clculo das estimativas de mistura tnica foram utilizadas as
freqncias das populaes parentais descritas na literatura
(http://falcon.roswellpark.org:9090/) e estas se encontram disponveis na tabela 4.
A utilizao simultnea de diversos loci genticos, no clculo de mistura
tnica, teve por objetivo minimizar os efeitos dos fatores limitantes, inerentes ao
mtodo de investigao, tais como desvios de amostragem, freqncias ancestrais
representadas por mdias ponderadas, foras microevolutivas atuando junto com a
mistura (BORTOLINI, 1991)
36
5 RESULTADOS
5.1 FREQNCIAS ALLICAS
Todos os alelos identificados para estes loci foram encontrados na amostra

do presente estudo (Tabela 4). Todos os marcadores utilizados so caracterizados
como informativos de ancestralidade por apresentarem um alto diferencial de
freqncia.
Os loci Ya5AC1982, Ya5ACA1400, Ya5ACA1441, Ya5ACA1555,
Ya5ACA1184, Ya5_541F e Ya5NBC354 foram os que apresentaram maior
freqncia allica para ausncia da insero Alu em todas as amostras analisadas.
J o locus Ya5ACA733 apresentou menor freqncia para ausncia da insero nos
controles euro-brasileiros (Figura 5). Os loci Ya5_541F, Ya5NBC354 esto com
maior freqncia allica nas amostras de controles afro-brasileiros (Figura 6). Os loci
Ya5ACA647 e Ya5ACA1400 foram mais frequentes nos controles euro-brasileiros e
os loci Ya5ACA1555 e Yb8NBC157 foram mais frequentes nos casos afro-brasileiros
(Figura 4), enquanto que o locus Yb8NBC157 teve maior frequncia allica em
controles afro-brasileiros (Figura 6).
37
Tabela 4 - Freqncias allicas dos 30 polimorfismos de insero Alu analisados em casos e

controles e nas populaes parentais.
Casos Controles
Inseres Afro-
Euro- Afro- Euro- Afro- Europeus1 Asiticos1
Alu americanos1
brasileiros brasileiros brasileiros brasileiros
Ya5ACA647
n 364 175 164 138 16 18 18
*
- 0, 576 0, 595 0, 678 0, 622* 0, 406 0, 833 1, 000
+ 0, 424 0, 405 0, 322 0, 378 0, 594 0, 167 0, 000
Ya5ACA733
n 364 175 164 138 20 20 19
- 0, 454 0, 460 0, 397 0, 492 0, 775 0, 700 0, 158
+ 0, 546 0, 540 0, 603 0, 508 0, 225 0, 300 0, 842
**
Ya5NBC45
n 364 175 164 138 20 20 20
- 0, 519 0, 555 0, 531 0, 489 0, 500 0, 950 1, 000
+ 0, 481 0, 445 0, 469 0, 511 0, 500 0, 050 0, 000
Ya5AC1982
n 364 175 164 138 20 20 20
- 0, 615 0, 624 0, 644* 0, 643* 0, 225 0, 300 0, 725
+ 0, 385 0, 376 0, 356 0, 357 0, 775 0, 700 0, 275
Ya5ACA917**
n 364 175 164 138 20 20 20
- 0, 546 0, 590 0, 586 0, 590 0, 225 0, 700 0, 675
+ 0, 454 0, 410 0, 414 0, 410 0, 775 0, 300 0, 325
Ya5ACA1400
n 364 175 164 138 19 14 12
* * *
- 0, 653 0, 636 0, 663 0, 545 0, 474 0, 893 0, 875
+ 0, 347 0, 364 0, 337 0, 455 0, 526 0, 107 0, 125
Ya5AC2282
n 364 175 164 138 20 20 20
- 0, 533 0, 536 0, 509 0, 542 0, 300 0, 850 0, 900
+ 0, 467 0, 464 0, 491 0, 458 0, 700 0, 150 0, 100
**
Ya5ACA1441
n 364 175 164 138 16 20 18
- 0, 625* 0, 605 0, 595 0, 636* 0, 469 0, 850 0, 889
+ 0, 375 0, 395 0, 405 0, 364 0, 531 0, 150 0, 111
Ya5NBC132**
n 364 175 164 138 08 13 09
- 0, 517 0, 563 0, 479 0, 496 0, 500 1, 000 1, 000
+ 0, 483 0, 437 0, 521 0, 504 0, 500 0, 000 0, 000
Ya5AC2670**
n 364 175 164 138 17 13 13
- 0, 576 0, 599 0, 552 0, 534 0, 441 0, 000 0, 000
+ 0, 424 0, 401 0, 448 0, 466 0, 559 1, 000 1, 000
Ya5ACA1555
n 364 175 164 138 15 16 17
* *
- 0, 629 0, 683 0, 648 0, 630 0, 467 0, 562 1, 000
+ 0, 371 0, 317 0, 352 0, 370 0, 533 0, 438 0, 000
38
Casos Controles
Inseres Afro-
Alu americanos1
Yb8NBC157
n 364 175 164 138 20 18 12
* *
- 0, 596 0, 665 0, 586 0, 664 0, 950 0, 417 0, 708
+ 0, 404 0, 335 0, 413 0, 336 0, 050 0, 583 0, 292
Ya5NBC150
n 364 175 164 138 17 20 18
- 0, 564 0, 509 0, 482 0, 470 1, 000 0, 950 0, 361
+ 0, 436 0, 491 0, 518 0, 530 0, 000 0, 050 0, 639
**
Ya5ACA1002
n 364 175 164 138 20 21 20
* *
- 0, 609 0, 623 0, 561 0, 496 0, 000 0, 452 0, 575
+ 0, 391 0, 377 0, 439 0, 504 1, 000 0, 548 0, 425
**
Ya5NBC327
n 364 175 164 138 20 19 20
- 0, 544 0, 553 0, 537 0, 615* 0, 325 1, 000 0, 800
+ 0, 456 0, 447 0, 463 0, 385 0, 675 0, 000 0, 200
Ya5ACA1242**
n 364 175 164 138 16 11 15
- 0, 548* 0, 586* 0, 562* 0, 578* 0, 668 0, 000 0, 167
+ 0, 452 0, 414 0, 438 0, 422 0, 332 1, 000 0, 833
Ya5_531**
n 364 175 164 138 07 20 15
* *
- 0, 572 0, 633 0, 543 0, 574 0, 286 1, 000 1, 000
+ 0, 428 0, 367 0, 457 0, 426 0, 714 0, 000 0, 000
**
Yb8NBC93
n 364 175 164 138 14 14 14
- 0, 513 0, 491 0, 469 0, 515 0, 179 0, 571 0, 679
+ 0, 487 0, 509 0, 531 0, 485 0, 821 0, 429 0, 321
Ya5ACA928
n 364 175 164 138 20 20 20
* * * *
- 0, 551 0, 610 0, 515 0, 613 0, 500 0, 425 0, 025
+ 0, 449 0, 390 0, 485 0, 387 0, 500 0, 575 0, 975
**
Ya5ACA1100
n 364 175 164 138 20 18 20
- 0, 587 0, 567 0, 565 0, 564 0, 450 1, 000 0, 900
+ 0, 413 0, 433 0, 435 0, 436 0, 550 0, 000 0, 100
H7_F_148
n 364 175 164 138 20 20 20
- 0, 607* 0, 601* 0, 630* 0, 556 0, 425 0, 375 0, 000
+ 0, 393 0, 399 0, 370 0, 444 0, 575 0, 625 1, 000
Ya5ACA1184**
n 364 175 164 138 19 16 20
* *
- 0, 581 0, 603 0, 619 0, 632* 0, 158 0, 688 0, 950
+ 0, 419 0, 397 0, 381 0, 368 0, 842 0, 312 0, 050
**
Ya5ACA866
n 364 175 164 138 20 20 20
* * *
- 0, 536 0, 539 0, 575 0, 496 0, 025 0, 700 0, 275
39
Casos Controles
Inseres Afro-
Alu americanos1
+ 0, 464 0, 461 0, 425 0, 504 0, 975 0, 300 0, 725
Ya5NBC241
n 364 175 164 138 17 18 19
- 0, 559* 0, 536* 0, 506* 0, 541* 0, 441 0, 194 0, 605
+ 0, 441 0, 464 0, 494 0, 459 0, 559 0, 806 0, 395
PV92
n 364 175 164 138 43 32 49
- 0, 524* 0, 552* 0, 566* 0, 598* 0, 209 0, 141 0, 860
+ 0, 476 0, 448 0, 434 0, 402 0, 791 0, 859 0, 140
Ya5_541F**
n 364 175 164 138 17 20 19
- 0, 607* 0, 593 0, 641* 0, 709* 0, 059 0, 550 0, 105
+ 0, 393 0, 407 0, 359 0, 291 0, 941 0, 450 0, 895
Yb8NBC67
n 364 175 164 138 18 15 19
* *
- 0, 600 0, 584 0, 591 0, 659 0, 583 0, 933 0, 632
+ 0, 400 0, 416 0, 409 0, 341 0, 417 0, 067 0, 368
**
Ya5ACA862
n 364 175 164 138 19 20 19
- 0, 574 0, 560 0, 578 0, 550 0, 711 0, 300 0, 132
+ 0, 426 0, 440 0, 422 0, 450 0, 289 0, 700 0, 868
Ya5NBC354
n 364 175 164 138 20 19 18
- 0, 636* 0, 618* 0, 601* 0, 663* 0, 700 0, 632 0, 278
+ 0, 364 0, 382 0, 399 0, 337 0, 300 0, 368 0, 722
Ya5ACA1611**
n 364 175 164 138 19 18 19
- 0, 473 0, 530 0, 585 0, 572 0, 211 0, 611 0, 737
+ 0, 527 0, 470 0, 415 0, 428 0, 789 0, 389 0, 263
Nota: *alelos mais freqentes.
**
Loci que diferenciam exclusivamente afro-americanos de europeus e asiticos.
1
(BENNETT et al. 2004; CARTER et al. 2004; MAMEDOV et al. 2005; OTIENO et al. 2004; RAY et al.
2005; ROY et al. 2000; WANG et al. 2006; WATKINS et al. 2001).
Nas Figuras a seguir, podemos observar a comparao grfica das amostras

analisadas com as frequncias das populaes parentais, afro-americanos,
europeus e asiticos. Pode-se observar alta frequncia europia e asitica para a
maioria dos loci analisados. Dos 30 loci analisados, apenas sete (Ya5ACA733,
Yb8NBC157, Ya5NBC150, Ya5ACA1242, Yb8NBC67, Ya5ACA862 e Ya5NBC354)
apresentam uma frequncia maior que 50% para o componente afro-americano.
Porm, do total de loci analisados, 16 diferenciam exclusivamente os afro-
americanos dos europeus e asiticos.
Ya
0
1
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
5A
Y a CA6 4
5A
C 7
Y a A7 33
5N
Ya BC
5A 45
Y a C198
5A
C 2
Ya
5A A9 17
CA
Ya 14
5A 00
Ya C2
5A 2 82
C
Y a A1 44
5N 1
parentais, Afro-americanos, Europeus e Asiticos.

BC
Ya
5 1 3 2
Y a A C26
5A
C 7 0
Y b A1 55
8N 5
BC
Ya 1 5
5N
B 7
Ya
5A C1 50
C
Y a A1 00
5N
B 2
Ya
5A C3 27
CA
12
Ya 42
5
Y b _5 31
8N
Ya B
5A C93
Ya C
5A A9 28
CA
11
H7 00
Y a _F_1
5A 48
C
Y a A1 18
5A 4
CA
Ya 8 6
5N 6
BC
24
1
P
Y a V9 2
5_
Y b 5 41F
8N
Ya B
5A C67
CA
Ya
5N 8 62
Ya B
5A C3 54
CA
16
11
Europeus
Asisticos
Figura 3 - Comparao grfica das frequncias allicas da amostra Casos Euro-brasileiros obtidas no presente estudo com as frequncias das populaes
Afro-americanos
40
Casos Euro-brasileiros
Ya
0
1
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
5A
CA
Ya
5A 6 47
C
Y a A7 33
5N
Ya BC
5A 45
Ya C 1
5A 98 2
Ya C
5A A9 17
CA
Ya 14
5A 00
Ya C2
5A 2 82
C
Y a A1 44
5N
BC 1
parentais, Afro-americanos, Europeus e Asiticos.

Ya 13
5 2
Y a A C26
5A
C 7 0
Y b A1 55
8N 5
BC
Ya 1 5
5N
B 7
Ya
5A C1 50
C
Y a A1 00
5N 2
Ya B
5A C3 27
CA
12
Ya 42
5_
Yb 5
8N 31
Ya B
5A C93
Ya C
5A A9 28
CA
11
H7 00
_ F
Ya
5A _ 14
CA 8
Ya 1
5A 184
CA
Ya
5N 8 66
BC
24
1
PV
Ya 92
5_
Y b 5 41F
8N
Ya B
5A C67
Ya C A
5N 8 62
Ya B
5A C3 54
CA
16
11
Asiticos
Europeus
Figura 4 - Comparao grfica das frequncias allicas da amostra Casos Afro-brasileiros obtidas no presente estudo com as frequncias das populaes
Afro-americanos
41
Casos Afro-brasileiros
Ya
5A
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Ya CA6
5A 47
C
Ya A73
5 3
Ya NBC
5A 45
Ya C19
5 8
Ya ACA 2
5A 91
C 7
Ya A14
5A 00
Ya C
5A 228
2
Ya CA14
5N 41
Ya BC1
5A 32
Ya C
5A 267
C 0
Yb A15
8N 5
populaes parentais, Afro-americanos, Europeus e Asiticos.

Ya BC1 5
5 5
Ya NBC 7
5A 15
C 0
Ya A10
5N 02
Ya BC
5A 3
CA 27
1
Ya 242
Yb 5_53
8 1
Ya NBC
5A 93
Ya C
5A A92
CA 8
H 11
0
Ya 7_F_ 0
5A 1
C 48
Ya A11
5A 84
Ya CA8
5N 6
BC 6
24
1
Ya PV92
5
Yb _541
8N F
Ya BC
5A 67
Ya CA8
5 6
Ya NBC 2
5A 3
CA 54
16
11
Asiticos
Europeus
Afro-americanos
Figura 5 - Comparao grfica das frequncias allicas da amostra Controles Euro-brasileiros obtidas no presente estudo com as frequncias das
42
Controles Euro-brasileiros
Ya
5A
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Ya CA6
5A 47
Ya CA73
5N 3
Ya BC4
5A 5
Ya C19
5A
C 8 2
Ya
5A A91
C 7
Ya A14
5A
C 0 0
Ya
5A 228
C 2
Ya A14
5N 41
Ya BC1
5A 32
Ya C
5A 267
C
Yb A15 0
8N 5
Ya BC1 5
5 5
Ya NBC 7
populaes parentais, Afro-americanos, Europeus e Asiticos.

5A 15
0
Ya CA10
5N 0
Ya BC 2
5A 32
CA 7
1
Ya 242
Yb 5_
8 531
Ya NBC
5 9
Ya ACA 3
5A 92
CA 8
H7 110
Ya _F_ 0
5A 14
8
Ya CA11
5A 8
Ya CA8 4
5N 6
BC 6
24
1
Ya PV92
5
Yb _541
8N F
Ya BC
5A 67
Ya CA8
5 6
Ya NBC 2
5A 35
CA 4
16
11
Asiticos
Europeus
Afro-americanos
Figura 6 - Comparao grfica das frequncias allicas da amostra Controles Afro-brasileiros obtidas no presente estudo com as frequncias das
43
Controles Afro-brasileiros
44
5.2 EQUILBRIO DE HARDY-WEINBERG
As estimativas de aderncia ao equilbrio de Hardy-Weinberg (EHW)

encontram-se na Tabela 5. Todos os desvios do EHW observados se encontram em
negrito nesta tabela. Foram observados 21, 11, 13 e 8 desvios do EHW nas
amostras de casos euro-brasileiros, casos afro-brasileiros, controles euro-brasileiros
e controles afro-brasileiros, respectivamente (Tabela 5). Testes mais sensveis de
dficit e excesso de heterozigotos foram aplicados com o objetivo de explicar os
desvios encontrados. Os loci H7_F_148 e Ya5_541F em casos euro-brasileiros,
embora estivessem em desequilbrio, no apresentaram dficit nem excesso de
heterozigotos (Tabela 5).
Todas as amostras analisadas apresentaram dficit de heterozigotos nos
loci Yb8NBC157, Ya5ACA1242, Yb8NBC93, Ya5ACA928, Ya5ACA1184 e
Ya5ACA866 (Tabela 6). Os loci Ya5ACA1400, Ya5ACA1441 e Ya5AC2670
apresentaram dficit de heterozigotos nas amostras casos euro-brasileiros, casos
afro-brasileiros e controles euro-brasileiros.
O locus Ya5NBC241 apresentou dficit de heterozigotos para os casos
euro-brasileiros e afro-brasileiros. J os loci Ya5AC2282, Ya5NBC132,
Ya5ACA1002, PV92 e Ya5ACA1611 apresentaram dficit de heterozigotos para a
amostra de casos euro-brasileiros. Para as amostras de casos euro-brasileiros e
controles euro-brasileiros, os loci Ya5ACA733, Ya5NBC327, Ya5_541F e
Yb8NBC67 apresentaram valores significativos (Tabela 6). Os loci Ya5ACA862
apresentou valores significativos para o dficit de heterozigotos nas amostras casos
euro-brasileiros e controles afro-brasileiros, e o Ya5ACA1100, em controles afro-
brasileiros.
Apesar de no ser observados desvios para o EHW, nos loci Ya5ACA647,
Ya5NBC150, Ya5_531F, Yb8NBC93, Ya5ACA1100, Ya5ACA1184, Ya5NBC241,
Ya5ACA862 apresentaram dficit de heterozigotos para os controles euro-
brasileiros, assim como, Ya5ACA866 e Ya5_541F apresentaram dficit de
heterozigotos para os controles afro-brasileiros (Tabela 6). Isto ocorre porque estes
dois testes so mais sensveis que o teste global do EHW, indicando a falta (ou o
excesso) de heterozigotos mesmo que estes no afetem o equilbrio calculado
45
(ROUSSET & RAYMOND 1995). Quanto ao teste para verificar excesso de

heterozigotos, nenhum loci apresentou valores significativos.
Tabela 5 - Probabilidades obtidas com o teste exato para a verificao da aderncia ao Equilbrio de
Hardy-Weinberg nas amostras analisadas.
Teste P
Loci Casos Controles

Euro- Afro- Euro- Afro-
Ya5ACA647 0, 018 0, 001 0, 001 0, 009
Ya5ACA733 0, 000 0, 031 0, 000 0, 036
Ya5NBC45 0, 001 1, 000 0, 875 0, 606
Ya5AC1982 0, 004 1, 000 0, 863 0, 122
Ya5ACA917 0, 003 0, 029 0, 000 0, 099
Ya5ACA1400 0, 000 0, 000 0, 000 0, 001
Ya5AC2282 0, 000 0, 346 0, 007 0, 724
Ya5ACA1441 0, 000 0, 000 0, 000 0, 001
Ya5NBC132 0, 000 0, 012 0, 004 0, 022
Ya5AC2670 0, 000 0, 000 0, 000 0, 002
Ya5ACA1555 0, 014 0, 013 0, 089 0, 577
Yb8NBC157 0, 000 0, 000 0, 000 0, 000
Ya5NBC150 0, 040 0,164 0, 002 0, 299
Ya5ACA1002 0, 000 0, 074 0, 002 1, 000
Ya5NBC327 0, 000 0, 086 0, 000 0, 003
Ya5ACA1242 0, 000 0, 000 0, 000 0, 000
Ya5_531F 0, 051 0, 002 0, 001 0, 008
Yb8NBC93 0, 000 0, 000 0, 001 0, 000
Ya5ACA928 0, 000 0, 000 0, 000 0, 000
Ya5ACA1100 0, 003 0, 012 0, 196 0, 000
H7_F_148 0, 000 0, 000 0, 000 0, 000
Ya5ACA1184 0, 000 0, 000 0, 001 0, 000
Ya5ACA866 0, 000 0, 000 0, 000 0, 001
Ya5NBC241 0, 000 0, 000 0, 012 0, 001
PV92 0, 000 0, 007 0, 004 0, 007
Ya5_541F 0, 000 0, 001 0, 000 0, 001
Yb8NBC67 0, 000 0, 005 0, 000 0, 054
Ya5ACA862 0, 000 0, 029 0, 001 0, 000
Ya5NBC354 0, 001 0, 151 0, 032 0, 003
Ya5ACA1611 0, 000 0, 044 0, 008 0, 053
Obs., *Os valores em negrito so diferenas estatisticamente significativas Bonf = 0,001.
46
Tabela 6 - Probabilidades obtidas com o teste do Equilbrio de Hardy-Weinberg para verificar o dficit
de heterozigotos.
Dficit de
Heterozigotos
Loci Casos Controles
Brasileiros brasileiros brasileiros brasileiros
Ya5ACA647 0,009 0,001 0,000 0,005
Ya5ACA733 0,000 0,018 0,000 0,021
Ya5NBC45 0,001 0,623 0,433 0,331
Ya5AC1982 0,002 0,586 0,495 0,092
Ya5ACA917 0,002 0,017 0,000 0,057
Ya5ACA1400 0,000 0,000 0,000 0,001
Ya5AC2282 0,000 0,186 0,005 0,377
Ya5ACA1441 0,000 0,000 0,000 0,000
Ya5NBC132 0,000 0,006 0,001 0,015
Ya5AC2670 0,000 0,000 0,000 0,002
Ya5ACA1555 0,009 0,009 0,059 0,813
Yb8NBC157 0,000 0,000 0,000 0,000
Ya5NBC150 0,022 0,084 0,000 0,173
Ya5ACA1002 0,000 0,044 0,001 0,601
Ya5NBC327 0,000 0,044 0,000 0,002
Ya5ACA1242 0,000 0,000 0,000 0,000
Ya5_531F 0,029 0,001 0,000 0,005
Yb8NBC93 0,000 0,000 0,000 0,000
Ya5ACA928 0,000 0,000 0,000 0,000
Ya5ACA1100 0,002 0,007 0,000 0,000
H7_F_148 0,000 0,000 0,102 0,000
Ya5ACA1184 0,000 0,000 0,000 0,000
Ya5ACA866 0,000 0,000 0,000 0,000
Ya5NBC241 0,000 0,000 0,000 0,001
PV92 0,000 0,003 0,008 0,005
Ya5_541F 0,000 0,001 0,001 0,000
Yb8NBC67 0,000 0,003 0,000 0,039
Ya5ACA862 0,000 0,020 0,000 0,000
Ya5NBC354 0,001 0,100 0,001 0,001
Ya5ACA1611 0,000 0,024 0,019 0,028
Obs., Os valores em negrito so diferenas estatisticamente significativas Bonf = 0,001.
5.3 ASSOCIAES ALLICAS PAR-A-PAR
Associaes (desvios) significativas entre os loci foram analisadas no intuito

de investigar a existncia de estrutura gentica nas amostras analisadas, o que
sugerido pela presena de associaes (desvios) significativas entre loci no
ligados.
Para cada uma das quatro amostras foram realizadas 465 comparaes
entre os 30 loci. As amostras analisadas apresentaram desequilbrio de ligao entre
pares de loci no ligados quando se considerou = 0,05. Destas 465 combinaes,
47
277 foram significativas, 98 em casos euro-brasileiros (21,1%), 58 em casos afro-

brasileiros (12,5%), 63 em controles euro-brasileiros (13,5%), 58 em controles afro-
brasileiros (12,5%).
Ao considerar Bonf = 0,0018, apenas uma amostra apresentou associao
significativa. Sendo, 84 associaes significativas, 35 em casos euro-brasileiros
(7,5%), 18 em casos afro-brasileiros (3,9%), 15 em controles euro-brasileiros (3,2%)
e 16 em controles afro-brasileiros (3,4%). A amostra de casos euro-descendentes
apresentou associaes significativas, pois nesta amostra o nmero de pares que
apresentaram associaes significativas so superiores a 5%, caso contrrio, s
associaes seriam atribudas ao acaso.
Devido ao nmero elevado de associaes par-a-par (465 para cada
amostra) s foram descritos aqui os resultados que foram significativos.
5.4 DIFERENCIAO GENTICA ENTRE POPULAES
O teste de diferenciao gnica par-a-par entre os loci foi testado com o

objetivo de verificar se h diferena significativa entre as populaes analisadas,
considerando o valor de p < 0,05.
Das 186 comparaes par-a-par possveis para os 30 loci analisados, 11
foram significativas e nove altamente significativas (Tabela 7). Todas as amostras
apresentaram valores significativos para algum loci. Em todos loci analisados, 19
no apresentaram diferenas (Tabela 7).
Entre as amostras controles euro-brasileiros x controles afro-brasileiros
(COEB X COAB), os loci Ya5ACA733 e Ya5ACA928 apresentaram valores
significativos e o locus Ya5ACA1400 apresentou valor altamente significativo.
Quando se comparou controles euro-brasileiros x casos euro-brasileiros (COEB X
CEB), os loci Ya5ACA647, Ya5NBC150 e Ya5ACA1611, apresentaram valores
significativos, 0, 003, 0, 015 e 0, 002, respectivamente. Para o par de populaes
controles euro-brasileiros x casos afro-brasileiros (COEB X CAB), cinco loci
(Ya5ACA647, Ya5NBC132, Ya5_531F, Ya5ACA928 e Ya5_541F) apresentaram
valores significativos.
Assim como, COEB X CAB, os controles afro-brasileiros x casos euro-
brasileiros (COAB X CEB) tambm apresentaram cinco loci (Ya5ACA1400,
48
Ya5NBC150, Ya5ACA1002, PV92 e Ya5ACA1611) com valores significativos. J

nos controles afro-brasileiros x casos afro-brasileiros (COAB X CAB) trs loci
(Ya5ACA1400, Ya5ACA1002 e Ya5_541F) tiveram valores significativos. Entre as
amostras casos euro-brasileiros x casos afro-brasileiros (CEB X CAB) apenas o
locus Yb8NBC157 apresentou valor significativo (Tabela 7). No entanto, ao
considerar Bonf = 0,0016, nenhum valor significativo foi observado.
Tabela 7- Diferenciao gnica baseada nos 30 loci entre as quatro populaes, caso euro-brasileiros
(CEB), caso afro-brasileiros (CAB), controle euro-brasileiros (COEB) e controle afro-brasileiros
(COAB).
Populaes
Loci COEB COEB COEB COAB COAB CEB
x x x x x x Total
COAB CEB CAB CEB CAB CAB
Ya5ACA647 0, 152 0, 003 0, 031 0, 214 0, 499 0, 599 0, 021
Ya5ACA733 0, 015 0, 097 0, 125 0, 300 0, 453 0, 898 0, 137
Ya5NBC45 0, 328 0, 729 0, 584 0, 426 0, 088 0, 272 0, 439
Ya5AC1982 1, 000 0, 347 0, 620 0, 438 0, 669 0, 776 0, 763
Ya5ACA917 0, 932 0, 259 0, 937 0, 234 1, 000 0, 182 0, 367
Ya5ACA1400 0, 003 0, 789 0, 510 0, 001 0, 033 0, 634 0, 014
Ya5AC2282 0, 466 0, 505 0, 549 0, 826 0, 935 0, 946 0, 868
Ya5ACA1441 0, 312 0, 361 0, 819 0, 754 0, 435 0, 573 0, 716
Ya5NBC132 0, 672 0, 249 0, 030 0, 557 0, 108 0, 164 0, 147
Ya5AC2670 0, 682 0, 509 0, 239 0, 272 0, 124 0, 490 0, 385
Ya5ACA1555 0, 666 0, 572 0, 367 1, 000 0, 197 0, 106 0, 413
Yb8NBC157 0, 060 0, 788 0, 050 0, 055 1, 000 0, 032 0, 043
Ya5NBC150 0, 809 0, 015 0, 474 0, 010 0, 386 0, 084 0, 021
Ya5ACA1002 0, 121 0, 143 0, 122 0, 002 0, 001 0, 687 0, 006
Ya5NBC327 0, 053 0, 831 0, 697 0, 050 0, 132 0, 803 0, 190
Ya5ACA1242 0, 742 0, 668 0, 574 0, 429 0, 868 0, 258 0, 633
Ya5_531F 0, 454 0, 407 0, 021 1, 000 0, 169 0, 067 0, 124
Yb8NBC93 0, 278 0, 191 0, 609 1, 000 0, 568 0, 542 0, 539
Ya5ACA928 0, 018 0, 302 0, 018 0, 103 1, 000 0, 080 0, 017
Ya5ACA1100 1, 000 0, 541 1, 000 0, 569 1, 000 0, 612 0, 855
H7_F_148 0, 074 0, 496 0, 479 0, 167 0, 317 0, 884 0, 323
Ya5ACA1184 0, 802 0, 270 0, 683 0, 167 0, 502 0, 493 0, 449
Ya5ACA866 0, 074 0, 237 0, 392 0, 283 0, 313 0, 947 0, 275
Ya5NBC241 0, 415 0, 122 0, 473 0, 656 0, 935 0, 531 0, 493
PV92 0, 447 0, 245 0, 757 0, 044 0, 289 0, 421 0, 226
Ya5_541F 0, 087 0, 316 0, 006 0, 216 0, 006 0, 676 0, 010
Yb8NBC67 0, 097 0, 781 0, 105 0, 872 0, 074 0, 625 0, 271
Ya5ACA862 0, 553 0, 947 0, 683 0, 508 0, 867 0, 677 0, 898
Yb8NBC419 0, 533 0, 409 0, 802 0, 109 0, 329 0, 574 0, 427
Ya5NBC354 0, 151 0, 298 0, 680 0, 420 0, 277 0, 574 0, 438
Ya5ACA1611 0, 804 0, 002 0, 142 0, 006 0, 287 0, 956 0, 004
Obs.: Bonf = 0,0016
49
A diferenciao genotpica foi realizada para cada par de populaes,

considerando os loci analisados. Dos 30 loci analisados, 23 no apresentaram
valores significativos para as amostras analisadas (Tabela 8).
Das comparaes par-a-par possveis para os 30 loci analisados, 10 foram
significativas e quatro altamente significativas. Os resultados mostraram valores
significativos para o locus Ya5ACA647 quando os controles euro-brasileiros foram
comparados com casos euro-brasileiros e casos afro-brasileiros. Quando se
comparou COEB X COAB apenas o locus Ya5ACA1400 se mostrou significante.
Este mesmo locus foi significante para COAB X CEB. O locus Ya5NBC150
apresentou significncia entre os pares de populaes COEB X CEB e COAB X
CEB (Tabela 8).
Os loci Ya5ACA1002 e Ya5_541F apresentaram valores altamente
significativos e significativos, respectivamente, para os controles afro-brasileiros
comparados com casos euro-brasileiros e casos afro-brasileiros. O locus Ya5_531F
mostrou significncia para a populao COAB X CEB. O locus Ya5ACA1611
apresentou alta significncia para a populao COEB X CEB e significncia para a
populao COAB X CEB. Apenas a populao casos euro-brasileiros comparada
com casos afro-brasileiros no apresentaram significncia para nenhum dos loci
analisados (Tabela 8). No entanto, ao considerar Bonf = 0,0016, nenhum valor
significativo foi observado.
50
Tabela 8 - Diferenciao genotpica baseada nos 30 loci entre as quatro populaes, caso euro-
brasileiros (CEB), caso afro-brasileiros (CAB), controle euro-brasileiros (COEB) e controle afro-
brasileiros (COAB).
Populaes
Loci COEB COEB COEB COAB COAB CEB
x x x x x x Total
COAB CEB CAB CEB CAB CAB
Ya5ACA647 0, 223 0, 007 0, 049 0, 239 0, 536 0, 605 0,036
Ya5ACA733 0, 050 0, 129 0, 153 0, 363 0, 487 0, 905 0,223
Ya5NBC45 0, 329 0, 752 0, 443 0, 586 0, 119 0, 296 0,463
Ya5AC1982 1, 000 0, 391 0, 637 0, 487 0, 675 0, 798 0,793
Ya5ACA917 0, 939 0, 298 0, 946 0, 265 1, 000 0, 222 0,445
Ya5ACA1400 0, 015 0, 817 0, 600 0, 013 0, 064 0, 688 0,068
Ya5AC2282 0, 482 0, 549 0, 558 0, 835 0, 936 0, 951 0,878
Ya5ACA1441 0, 397 0, 427 0, 837 0, 792 0, 512 0, 635 0,805
Ya5NBC132 0, 711 0, 329 0, 060 0, 611 0, 153 0, 246 0,269
Ya5AC2670 0, 718 0, 563 0, 330 0, 354 0, 204 0, 568 0,538
Ya5ACA1555 0, 675 0, 597 0, 410 1, 000 0, 205 0, 132 0,444
Yb8NBC157 0, 120 0, 824 0, 092 0, 118 1, 000 0, 078 0,133
Ya5NBC150 0, 824 0, 027 0, 520 0, 014 0, 382 0, 127 0,033
Ya5ACA1002 0, 141 0, 208 0, 150 0, 002 0, 002 0, 708 0,016
Ya5NBC327 0, 101 0, 863 0, 085 0, 728 0, 165 0, 800 0,295
Ya5ACA1242 0, 787 0, 754 0, 652 0, 513 0, 893 0, 356 0,785
Ya5_531F 0, 520 0, 451 0, 039 1, 000 0, 212 0, 087 0,180
Yb8NBC93 0, 364 0, 285 0, 635 1, 000 0, 631 0, 628 0,693
Ya5ACA928 0, 055 0, 410 0, 154 0, 046 1, 000 0, 142 0,121
Ya5ACA1100 1, 000 0, 565 1, 000 0, 603 1, 000 0, 622 0,895
H7_F_148 0, 134 0, 575 0, 535 0, 239 0, 400 0, 908 0,526
Ya5ACA1184 0, 822 0, 368 0, 735 0, 249 0, 574 0, 577 0,586
Ya5ACA866 0, 107 0, 318 0, 450 0, 346 0, 401 0, 955 0,431
Ya5NBC241 0, 462 0, 209 0, 520 0, 722 0, 944 0, 580 0,628
PV92 0, 510 0, 273 0, 777 0, 068 0, 325 0, 463 0,274
Ya5_541F 0, 162 0, 417 0, 325 0, 012 0, 012 0, 726 0,062
Yb8NBC67 0, 139 0, 813 0, 894 0, 156 0, 091 0, 668 0,352
Ya5ACA862 0, 614 0, 950 0, 712 0, 559 0, 877 0, 726 0,923
Ya5NBC354 0, 186 0, 330 0, 708 0, 461 0, 306 0, 595 0,508
Ya5ACA1611 0, 819 0, 002 0, 200 0, 019 0, 351 0, 132 0,005
Obs.: Bonf = 0,0016
5.5 DIVERSIDADE INTRAPOPULACIONAL (HS)
A diversidade gnica intrapopulacional variou de 0,415 nos casos afro-

brasileiros no locus Ya5_541F a 0,503 em casos afro-brasileiros no locus
Ya5ACA866. A heterozigose mdia variou de 0,484 0,004 em controles afro-
brasileiros a 0,488 0,002 em casos euro-brasileiros (Tabela 9). A heterozigose
mdia observada para as quatro amostras (casos euro-brasileiros 0,488 0, 002,
casos afro-brasileiros 0,485 0, 003, controles euro-brasileiros 0,486 0,003 e
controles afro-brasileiros 0,484 0,004) (Tabela 9).
51
Tabela 9 - Diversidade gnica (HS) dos loci nas populaes analisadas.
Casos Controles
Loci Euro- Afro- Euro- Afro-
Ya5ACA647 0, 438 0, 472 0, 489 0, 484
Ya5ACA733 0, 481 0, 502 0, 497 0, 499
Ya5NBC45 0, 500 0, 502 0, 500 0, 495
Ya5AC1982 0, 460 0, 461 0, 475 0, 471
Ya5ACA917 0, 487 0, 486 0, 497 0, 485
Ya5ACA1400 0, 449 0, 498 0, 454 0, 465
Ya5AC2282 0, 502 0, 498 0, 499 0, 499
Ya5ACA1441 0, 484 0, 465 0, 470 0, 480
Ya5NBC132 0, 501 0, 502 0, 500 0, 494
Ya5AC2670 0, 497 0, 500 0, 489 0, 483
Ya5ACA1555 0, 458 0, 468 0, 467 0, 435
Yb8NBC157 0, 487 0, 449 0, 483 0, 448
Ya5NBC150 0, 501 0, 500 0, 493 0, 501
Ya5ACA1002 0, 494 0, 502 0, 477 0, 471
Ya5NBC327 0, 500 0, 476 0, 497 0, 496
Ya5ACA1242 0, 495 0, 491 0, 496 0, 487
Ya5_531F 0, 498 0, 491 0, 490 0, 466
Yb8NBC93 0, 500 0, 502 0, 501 0, 502
Ya5ACA928 0, 502 0, 477 0, 496 0, 478
Ya5ACA1100 0, 493 0, 494 0, 486 0, 493
H7_F_148 0, 468 0, 496 0, 478 0, 482
Ya5ACA1184 0, 473 0, 468 0, 488 0, 481
Ya5ACA866 0, 491 0, 503 0, 498 0, 499
Ya5NBC241 0, 502 0, 499 0, 494 0, 499
PV92 0, 493 0, 483 0, 500 0, 497
Ya5_541F 0, 463 0, 415 0, 478 0, 484
Yb8NBC67 0, 486 0, 452 0, 481 0, 488
Ya5ACA862 0, 490 0, 498 0, 490 0, 494
Ya5NBC354 0, 482 0, 449 0, 464 0, 474
Ya5ACA1611 0, 487 0, 492 0, 499 0, 500
Heterozigose
0, 488 0, 485 0, 486 0, 484
mdia
Erro Padro 0, 002 0,003 0, 003 0, 004
5.6 MISTURA TNICA
A estimativa de mistura tnica foi testada para caracterizar as contribuies

das populaes parentais nas amostras aqui estudadas. Inicialmente utilizamos o
programa ADMIX3, porm os resultados apresentados se mostraram inconsistentes
para o modelo trihbrido. Portanto, as estimativas foram obtidas utilizando o
programa ADMIX2 e os valores de freqncias das populaes ancestrais europias
e afro-americanas.
Todas as populaes apresentaram valores consistentes para o modelo
dihbrido (Tabela 10). Em todas as amostras a contribuio afro-americana foi maior,
52
porm essa contribuio foi similar em todas as amostras, no diferenciando afro-

brasileiros de euro-brasileiros (Figura 7). A contribuio europia variou entre 38, 6
7,1 nos casos euro-brasileiros e 39, 5 7,7 nos controles euro-brasileiros.
Tabela 10 - Estimativa de mistura tnica nas amostras analisadas, segundo o mtodo de identidade
gnica, considerando os 30 polimorfismos analisados. Valores em percentuais.
Freqncias dos Marcadores (%)

Casos Controles
POP
Afro-americanos 61,4 7,3 60,5 7,3 60,5 7,7 60,8 7,4
Europeus 38,6 7,1 39,4 7,3 39,5 7,7 39,2 7,4
* 2
R 71,8 70,2 67,7 69,9
*
valor de adaptao ao modelo da mistura
70
60
50
40
30
20
10
0
CEB CAB COEB COAB
Africanos Europeus
Figura 7 - Estimativas de mistura tnica, africana e europia, a partir dos 30 loci nas amostras CEB
(casos euro-brasileiros), CAB (casos afro-brasileiros) COEB (controles euro-brasileiros) COAB
(controles afro-brasileiros).
53
6 DISCUSSO
O estudo da ancestralidade do indivduo utilizando marcadores genticos

pode ser til por fornecer informaes, por exemplo, sobre mapeamento por
mistura, predio de riscos mdicos, estudos de disperso de populaes, fluxo
gnico e histria evolutiva (MACIEL, 2007).
O que torna a populao brasileira to peculiar o fato de que durante a
formao da populao os povos no se mantiveram isolados, interagiram e
miscigenaram entre si. Devido a sua histria de formao, a populao brasileira
um modelo ideal para o estudo gentico de populaes, tendo como principal
objetivo estimar a composio do conjunto gnico da populao atual. Os
marcadores moleculares so as ferramentas mais utilizadas, sendo que diversos
desses j foram utilizados em estudos na populao brasileira, dentre eles:
inseres Alu, microssatlites e marcadores uniparentais.
6.1 FREQNCIAS ALLICAS
A anlise de dados de frequncias allicas, ou seja, o estudo da variabilidade

gentica auxilia no conhecimento da histria evolutiva de uma dada populao, tais
como endogamia, deriva gentica, efeito do fundador e gargalos populacionais.
Todos os marcadores utilizados no presente estudo so caracterizados como
informativos de ancestralidade por apresentarem alto diferencial de freqncia entre
as populaes.
Com a formao de uma populao miscigenada, espera-se que a frequncia
de qualquer locus, e em especial de loci AIMs, definidos como marcadores que
apresentam frequncias extremas e distintivas entre populaes diferenciadas por
fatores tnicos ou geogrficos, atinja valor intermedirio ao encontrado nas
populaes parentais (GONTIJO, 2008).
Dentre os 30 marcadores analisados, 11 apresentaram diferencial de
freqncia allica superior a 50% para ausncia da insero em populaes
54
asiticas/europeus, trs em populaes europias/africanas. Seis foram exclusivos

de afro-americanos, sete exclusivos de asiticos e trs de europeus (Tabela 4).
Pode-se observar alta frequncia europia e asitica para a maioria dos loci
analisados. Dos 30 loci analisados, apenas sete (Ya5ACA733, Yb8NBC157,
Ya5NBC150, Ya5ACA1242, Yb8NBC67, Ya5ACA862 e Ya5NBC354) apresentam
frequncia maior que 50% para o componente afro-americano.
Apesar de apresentar alta frequncia europia e asitica para a maioria dos
loci, mas de 50% (16) dos loci, diferenciam exclusivamente os africanos dos
europeus e asiticos.
Podemos salientar que as amostras foram selecionadas no Hospital Santa
Izabel onde recebe pacientes vindos de todas as partes da Bahia no sendo,
portanto, indivduos necessariamente da cidade de Salvador na qual a contribuio
africana maior.
6.2 EQUILBRIO DE HARDY-WEINBERG
Foram observados 21, 11, 13 e 8 desvios do EHW nas amostras de casos

euro-brasileiros, casos afro-brasileiros, controles euro-brasileiros e controles afro-
brasileiros, respectivamente (Tabela 5). Dos 53 desvios observados 51 podem ser
explicados por dficit de heterozigotos.
A falta de heterozigotos pode ser gerada por um sistema regular de
endocruzamento ou por estrutura populacional (ROUSSET & RAYMOND 1995).
Lins et al (2009), realizou um estudo para avaliar o contedo da informao
gentica de um painel de 28 SNPs aplicados, para investigar a composio gentica
de uma amostra da populao brasileira. A populao parental selecionada para
este trabalho compreendeu amostras de Africanos (Botsuana, Camares, Gana, e
Senegal), Europeu-americanos (Baltimore e Chicago) e Amerndios nativos
(Mexicanos Zapoteca). Quando se realizou o calculo para EHW, as populaes
parentais estavam em equilbrio, desvios de EHW foram observados apenas em
brasileiros, sugerindo miscigenao recente nesta populao. Segundo Falush et al.
(2003) se a estratificao da populao for real, desvios de Hardy-Weinberg em
alguns ou vrios loci so detectados.
55
Apesar do seu potencial de vantagem em estudos populacionais as

sequncias repetitivas do DNA podem aumentar a incidncia de erros de
genotipagem. A principal causa desses erros pode ocorrer devido a amplificao
preferencial de alelos pequenos, onde os alelos maiores falham na amplificao
(OOSTERHOUT et al., 2004). Tais erros de genotipagem podem causar desvios no
EHW, em particular uma deficincia de heterozigotos (SHAW et al., 1999).
Quanto ao teste para verificar excesso de heterozigotos, nenhum loci
apresentou valores significativos.
6.3 ASSOCIAES ALLICAS PAR-A-PAR
As associaes parapar tm o intuito de investigar a presena de

estrutura populacional entre os loci que apresentaram valores significativos de
associaes e que no esto ligados fisicamente. Esse desequilbrio de ligao
interessante porque pode revelar a origem das populaes humanas, pois a
distribuio do desequilbrio de ligao determinado em parte, pela histria
populacional (HARTL E CLARK, 2007).
O nmero de associaes significativas quando se considerou = 0,05, em
casos euro-brasileiros foi de 21,1% (98 em 465), nos casos afro-brasileiros o valor
foi de 12,5% (58 em 465). A amostra de controle euro-brasileiros obteve valor de
13,5% (63 em 465) e os controles afro-brasileiros foi de 12,5% (58 em 465).
Porm, ao considerar Bonf = 0,0018, apenas uma amostra apresentou
associao significativa. Sendo, 84 associaes significativas, 35 em casos euro-
brasileiros (7,5%), 18 em casos afro-brasileiros (3,9%), 15 em controles euro-
brasileiros (3,2%) e 16 em controles afro-brasileiros (3,4%). A amostra de casos
euro- brasileiros apresentou associaes significativas, pois nesta amostra o nmero
de pares que apresentaram associaes significativas so superiores a 5%.
Portanto, o nmero de associaes significativas entre loci no ligados est acima
dos 5% admitidos pela casualidade (LINS et al. 1998; BUDOWLE et al. 1999), com
isto estas associaes podem ser indicativas de estrutura populacional (PARRA et
al. 2001).
A estruturao populacional pode ser causada por vrios fatores como, fluxo
gnico contnuo, subestrutura populacional e acasalamento preferencial (PARRA et
56
al. 2001). Estudos de associao gentica procuram diferenas entre frequncias de

alelos em uma amostra populacional constituda de pessoas com a doena e outro
grupo sem a doena (BURTON, 2005).
A aterosclerose uma doena multifatorial, com fatores de risco
estabelecidos genticos e ambientais. H vrias provas convincentes de
envolvimentos das concentraes sanguneas de lipdeos na aterosclerose. Por
exemplo, depois de ajuste para fatores socioeconmicos, Afro-americanos em geral,
tm nveis mais saudveis de lipdeos, do que as pessoas de ascendncia europia
(COHEN et al., 2005), visto que ambos tm nveis de lipdeos mais saudveis do
que Sul - asiticos (PAIS et al., 1996). Isto ressalta a importncia de estudos casos-
controles das populaes com diferentes origens tnicas.
O desequilbrio de ligao entre alelos no mesmo cromossomo resulta de
vrios processos evolucionrios e desta forma descreve a histria das populaes
(DELVIN et al. 2001). Por isso populaes miscigenadas facilitam o mapeamento de
genes complexos devido ao desequilbrio de ligao que criado quando duas ou
mais populaes previamente separadas interagem (NEI e LI, 1973).
Segundo Pritchard e Przeworski (2001), a miscigenao recente de uma
populao com diferentes frequncias allicas um fator conhecido na gerao do
desequilbrio de ligao. No entanto, um ponto que emerge claramente que, para
entender desequilbrio de ligao em humanos, ns precisamos ter um melhor
entendimento da demografia humana. Isto inclui as histrias de mudanas no
tamanho populacional e outras formas de acasalamento ao acaso. Ns tambm
precisamos ter mais dados sobre as taxas de recombinao atravs do genoma.
Outro fato que esta amostra no completamente aleatria, so
indivduos de uma faixa etria com um risco cardaco. No devemos trat-la como
amostra populacional da Bahia sem considerar o risco da doena e principalmente
se existe uma propenso maior devido etnia e a fatores de risco ambiental.
Portanto, em teoria, acredita-se que os nveis de desequilbrio de ligao
entre alelos na populao brasileira atual deva ser um produto resultante dos efeitos
de migrao e miscigenao principalmente, mas no exclusivamente, das
populaes europias, africanas e indgenas (MARRERO et al, 2005).
57
6.4 DIFERENCIAO GENTICA ENTRE POPULAES
O teste de diferenciao gnica par-a-par entre os loci foi testado com o

objetivo de verificar se h diferena significativa entre as populaes analisadas,
considerando o valor de p < 0,05. Das 186 comparaes par-a-par possveis para os
31 loci analisados, 11 foram significativas e nove altamente significativas (Tabela 8).
Todas as amostras apresentaram valores significativos para algum loci.
As amostras que apresentaram maior diferenciao foram controles euro-
brasileiros x casos afro-brasileiros (COEB X CAB) e controles afro-brasileiros x
casos euro-brasileiros (COAB X CEB). Enquanto que a menor diferenciao foi entre
casos euro-brasileiros x casos afro-brasileiros (CEB X CAB). As comparaes entre
COEB x COAB, COEB X CEB e COAB X CAB, foram diferenciadas pelo mesmo
nmero de loci.
A diferenciao genotpica foi realizada para cada par de populaes,
considerando os loci analisados (Tabela 9). Dessas comparaes 10 foram
significativas e quatro altamente significativas. A amostra que apresentou maior
diferenciao foram controles afro-brasileiros x casos euro-brasileiros (COAB X
CEB). COEB X COAB apresentaram a menor diferenciao. As amostras COEB X
CAB e COAB X CAB, foram diferenciadas pelo mesmo nmero de loci. Na amostra
CEB X CAB no houve diferenciao genotpica.
No entanto, ao considerar Bonf = 0,0016, nenhum valor significativo foi
observado, nas diferenciaes gnicas e genotpicas.
6.5 DIVERSIDADE INTRAPOPULACIONAL (HS)
A diversidade gnica esperada (HS) variou de 0,415 nos casos afro-

brasileiros no locus Ya5_541F a 0,503 em casos afro-brasileiros no locus
Ya5ACA866. A heterozigose mdia variou de 0,484 0,004 em controles afro-
brasileiros a 0,488 0,002 em casos euro-brasileiros (Tabela 10).
Uma maior diversidade gentica era esperada ser encontrada entre os afro-
brasileiros, pois populaes africanas apresentam altos valores de diversidade. Os
afro-americanos apresentam altos valores de heterozigose, provavelmente
58
resultante do processo de miscigenao envolvendo estas populaes (PARRA et

al. 2001). O tamanho efetivo populacional e a mobilidade das populaes so
fatores importantes que influenciam o padro de diversidade.
6.6 MISTURA TNICA
Inicialmente utilizamos o modelo trihibrido, porm este se mostrou

inconsistente, pois as freqncias obtidas estavam no sentido decrescente de
contribuio, africanos asiticos europeus, enquanto o esperado seria africanos
europeus asiticos. A segunda maior contribuio do componente asitico foi
inesperada vista a histria de formao da populao baiana (TAVARES, 2001).
Portanto, as estimativas foram obtidas utilizando o programa ADMIX2 e os valores
de freqncias das populaes ancestrais europias e afro-americanos.
O que mais dificulta os clculos de mistura tnica a falta de informaes
das freqncias allicas destes marcadores nas populaes consideradas
ancestrais (RAY et al. 2005; WANG et al. 2006).
Todas as populaes apresentaram valores consistentes para o modelo
dihbrido (Tabela 10). Os resultados demonstram maior contribuio africana para
todas as amostras (Figura 7). Este resultado corrobora com a histria de formao
da populao baiana, pois a Bahia foi o principal foco de distribuio dos escravos
que vinham de vrias regies da frica.
Em todas as amostras a contribuio africana foi maior, porm essa
contribuio foi similar em todas as amostras, no diferenciando afro-brasileiros de
euro-brasileiros (Figura 7).
A utilizao simultnea de diversos loci genticos no clculo de mistura
tnica teve por objetivo minimizar os efeitos dos fatores limitantes inerentes ao
mtodo de investigao, tais como: desvios de amostragem, freqncias ancestrais
representadas por mdias ponderadas e foras micro evolutivas atuando junto com
a mistura (BORTOLINI, 1991) . Desta forma procurou-se utilizar o maior nmero de
loci em cada estimativa, desde que estes no tivessem um grande impacto nos
desvios das freqncias.
A diferena nas estimativas de mistura tnica nas amostras tambm pode
ser explicada pelos diferentes tipos de problemas, tais como a determinao da
59
populao. Dessa maneira, se verifica que existe falta de informaes sobre alguns
grupos tnicos formadores da populao brasileira (africanos do Oeste, europeus
principalmente portugueses e amerndios).
A escolha das populaes parentais uma etapa crucial nesse tipo de
analise. Essa escassez de dados na literatura restringiu as possibilidades de seleo
de populaes parentais adequadas para a anlise de composio gentica, e,
portanto, alguma variao nos resultados provavelmente seria observada caso
essas parentais fossem diferentes. O ideal seria que as populaes parentais
utilizadas fossem as mesmas para os tipos de marcadores.
A avaliao dos estimadores de erro constitui outro problema nas anlises
de mistura (SANS, 2000). O valor de R2 obtido foi baixo sendo que o esperado que
estes valores se aproximem de 100% o que indicaria uma boa adaptao ao modelo
de mistura. Os valores variaram de 67,7% nos controles euro-brasileiros a 71,8%
nos casos euro-brasileiros (Tabela 10). Estas amostras tambm apresentaram
estimativas de mistura com erros padro elevados. Isso pode ter acontecido porque
os europeus tomados como parentais so populaes alems e a amostra que
representa os africanos so indivduos afro-americanos com elevado grau de
mistura. Outro fator a ser considerado, que, para todos os parentais o nmero de
indivduos analisados para a obteno das freqncias no superior a 20
indivduos (http://falcon.roswellpark.org:9090/). provvel que estas discrepncias
sejam causadas pelas freqncias das populaes consideradas ancestrais e/ou
pelo mtodo utilizado para estimar a mistura.
60
7 CONCLUSES
Os resultados obtidos na genotipagem dos marcadores de insero Alu nas

amostras deste estudo mostraram que a informao sobre ancestralidade
apresentada, depende totalmente da informao e taxa de atribuio correta do
marcador e da utilizao conjunta de vrios marcadores em uma populao
miscigenada.
Os marcadores analisados nesse estudo se mostraram eficientes para
atribuio de ancestralidade em uma amostra di-hibrda, composta por parentais
europeus e afro-americanos. Para atender ao modelo tri-hibrdo, estes polimorfismos
esto sendo genotipados em uma amostra Afro-brasileira a fim de complementar e
aprimorar as estimativas de ancestralidade nestas amostras. Uma vez que, estes
polimorfismos de insero Alu j foram genotipados para amostras amerndias e
euro-brasileiras.
Foram observados desvios do EHW, mesmo aps a correo de

Bonferroni, sendo que a maioria deles pode ser explicado por dficit
de heterozigotos. Talvez estes desvios ocorreram pela presena de
estruturao populacional presente em populaes miscigenadas.
Em todas as amostras analisadas para Associaes allicas par-a-par

entre loci no-ligados, os resultados foram significativos. Porm ao
considerar o para a correo de Bonferroni, apenas a amostra
casos euro-brasileiros apresentou valores significativos, com isto
estas associaes podem ser indicativas de estrutura populacional.
As estimativas de mistura foram obtidas utilizando o programa

ADMIX2 e as populaes parentais, europia e afro-americana. Os
resultados apresentaram maior contribuio africana para todas as
amostras, o que era esperado devido histria de formao da
populao baiana. Porm, a contribuio africana foi similar em todas
61
as amostras, no diferenciando euro-brasileiros de afro-brasileiros.

Efetivamente, isso demonstra que, na amostra analisada, o alto ndice
de mistura faz com que caractersticas de aparncia fsica como cor
da pele, olhos, cabelos, formatos dos lbios e do nariz sejam pobres
indicadores da origem geogrfica dos ancestrais de um individuo.
A contribuio do componente asitico (representando a contribuio

amerndia) seria esperado, porm, houve inconsistncia para o
modelo tri-hibrido. Isto pode ser explicado, - pela escolha das
populaes parentais; - pela dificuldade de comparar dados genticos
tanto entre a populao brasileira com a europia, quanto com a
africana ou indgena, pois a populao brasileira possui diferentes
fraes de ancestralidade e assim, um padro de desequilbrio de
ligao diferente das populaes base.
Sugerimos que seja obtida a freqncia allica deste conjunto de

polimorfismos em amostras de afro-brasileiros, euro-brasileiros e
amerndios no intuito de minimizar os erros de efeito de amostragem
dos parentais na deteco do efeito de estruturao populacional real
e possa ser realizado o controle genmico.
62
8 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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69
ANEXO I
EXTRAO DE DNA
70
Extrao de DNA
Transferir 500l do creme leucocitrio para um tubo de microcentrfuga, (1,5ml de

capacidade) e acrescentar 700l de tampo lise para as clulas vermelhas (RCLB) e
centrifugar a 13.000 rpm por dois minutos;
Desprezar o sobrenadante e repetir a lise de glbulos vermelhos, adicionando

1ml de tampo RCLB, at obter um sobrenadante lmpido;
Ressuspender o boto de glbulos brancos em 1 ml de gua ultra-pura e

centrifugar a 13.000 rpm por dois minutos;
Desprezar o sobrenadante e adicionar 80l de tampo da proteinase K 5x, 40l

de proteinase K (10mg/ml), 20l de SDS 20% e 240l de gua ultra - pura.
Homogeneizar em agitador tipo vortx;
Incubar em bloco de aquecimento ou banho-maria a 60C por 40 min. Deixar

atingir a temperatura ambiente antes de prosseguir;
Adicionar 100l de soluo saturada de NACl (6M);
Centrifugar a 13.000 rpm por cinco minutos para precipitar toda a protena
restante e o que no for DNA;
Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrfuga de 1,5ml e

centrifugar novamente a 13.000 rpm por cinco minutos;
Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrfuga de 1,5ml,

acrescentar 700l a 1 ml de etanol absoluto, e inverter gentilmente, vrias vezes,
para precipitar o DNA e centrifugar a 13.000 rpm por dois minutos;
Desprezar o sobrenadante e adicionar 1 ml de etanol 70% e centrifugar a 13.000

rpm por dois minutos;
Desprezar o sobrenadante e deixar secar temperatura ambiente;
Ressuspender a amostra de DNA em 50l de gua ultra-pura e armazenar a

amostra de DNA a 20C.
71
No mtodo de extrao com Chelex 100 seguimos as etapas descritas:
Transferir 5l de cada amostra para o respectivo tubo;
Agitar no vortex por 10 segundos;
Deixar em repouso por 20 minutos temperatura ambiente;
Retirar o mximo possvel de sobrenadante com auxlio de pipeta automtica e

ponteiras com filtro;
Colocar 100l de Chelex em cada tubo;
Agitar no vortx por 10 segundos;
Incubar no termobloco a 56C por 30 minutos;
Incubar no termobloco a 105C por 10 minutos;
Centrifugar a 14.000 rpm por 3 minutos;
Armazenar a amostra no freezer a 20C.

72
ANEXO II
REAGENTES E SOLUES DA REAO EM CADEIA DA POLIMERASE
73
Reagentes e Solues da Reao em Cadeia da polimerase
DNA polimerase (Taq): 1 U/L de tampo de estocagem (BIOTOOLS B &

M Labs, AS).
dNTP soluo estoque: quatro solues separadas de 100mM de cada
base (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), pH 8,3 (BIOTOOLS B & M Labs, AS).
dNTP (20 mM): foi obtida diluindo-se com gua a soluo estoque (100mM)
de cada dNTP para uma soluo nica de concentrao 20mM (20 l de
gua de MiliQ autoclavada mais 20 L da soluo estoque de cada
dNTP).
Iniciadores (Primers) especficos: os primers liofilizados A e B especficos
para cada locus foram diludos em 50 L de gua autoclavada, ficando
50 mM (Bio-Synthesis).
Iniciadores (Primers) soluo estoque: 50 mM foram diludos com gua
autoclavada para 2,55 mM, os primers A e B so estocados
separadamente.
Iniciadores (Primers) soluo trabalho: 10 L do primer A, 10 L do
primer B e 180 L de gua autoclavada.
MgCl2: Concentrao de 50 mM (BIOTOOLS B & M Labs, AS).
Tampo de estocagem da DNA polimerase: 10 mM de Tris/HCl (pH 8,0),
50 mM KCl, 1 mM EDTA, 01% Triton x-100, 50% de glicerol (BIOTOOLS
B & M Labs, AS).
Tampo PCR livre de MgCl2: Tris/HCl 75 mM pH 9.0; KCl 50 mM;
(NH4)2SO4 20 mM. (BIOTOOLS B & M Labs, AS).
Tampo PCR com MgCl2 (20 mM): 4 mL de Tris/HCl 0,5M; 2,5 mL KCl 2 M;
0,2 mL MgCl2 1 M (feito no laboratrio).
74
ANEXO III
TERMO DE CONSENTIMENTO DOS PACIENTES PARA ESTUDO DE FATORES

GENETICOS NA DOENA CARDIOVASCULAR ISQUMICA
ATEROSCLERTICA
75
Variabilidade em genes envolvidos no processo inflamatrio arterial:

Implicaes no risco e gravidade da aterognese coronariana em amostra
da populao de Salvador Bahia
Centro de Pesquisas Gonalo Moniz Fundao Oswaldo Cruz Bahia
Hospital Santa Isabel
TERMO DE CONSENTIMENTO DOS PACIENTES PARA ESTUDO DE

FATORES GENETICOS NA DOENA CARDIOVASCULAR ISQUMICA
ATEROSCLERTICA
A doena aterosclertica coronariana apresenta uma srie de fatores que

esto associados com a proteo ou aumento no risco de se ter esta doena.
Alguns destes fatores j so bem conhecidos, como o caso dos nveis altos de
colesterol, presso arterial alta, fumo, entre outros. No entanto, outros fatores
so menos conhecidos e precisam ser mais estudados. Mudanas no nosso
material gentico, o DNA, podem ter algum efeito no risco para se ter esta
doena e poucos estudos analisaram estas mudanas em nossa populao. A
presena destas variaes no material gentico em conjunto com outros fatores
externos (hbitos de vida, tabagismo, inatividade fsica, dieta rica em gorduras,
etc) podem aumentar o risco de desenvolver infarto e/ou angina (dor no peito). O
conhecimento de quais destas variantes genticas so importantes para prever
o risco de se ter essa doena permitir que os indivduos que as possuem sejam
aconselhados, quando ainda jovens, a mudarem seus hbitos de vida no
saudveis, diminuindo desta forma o risco de vir a desenvolverem esta doena
em idades mais avanadas. O nosso trabalho estudar algumas destas
mudanas genticas, procurando verificar quais delas podem ser usadas para
prevenir o risco de desenvolvimento da doena cardaca aterosclertica em
nossa populao.
Eu__________________________________________________________consi
nto, voluntariamente, em participar do presente estudo sobre fatores genticos
envolvidos com a doena isqumica cardaca. Eu permito ser entrevistado por
um mdico sobre fatores associados ao risco de doena cardaca durante o
perodo de espera para realizao do exame de cateterismo cardaco. Concordo
em doar 15 (vinte) ml. de sangue a serem coletados atravs do cateter utilizado
para realizao do exame.
No serei submetido a nenhum desconforto ou risco adicional, alm dos j
previstos pela realizao do exame de cateterismo cardaco. O sangue doado vai
ser utilizado para dosagens de lipdeos e de marcadores inflamatrios
associados ao risco para a doena aterosclertica. Este sangue tambm ser
utilizado para extrao de material gentico (DNA) e investigao de alteraes
que podem estar associadas doena cardaca.
Permito tambm que os responsveis por este estudo tenham acesso aos
resultados do meu exame de cateterismo cardaco. Meus direitos de no
fornecer informaes a pessoas no-mdicas e de receber sigilo pelos
profissionais sero respeitados.
As informaes genticas a serem analisadas neste estudo no me
beneficiaro diretamente no diagnstico de minha doena, mas no futuro, com o
acmulo de informaes vindas de estudos como este, outras pessoas sero
beneficiadas na preveno e tratamento da doena cardaca.
76
Entretanto, os resultados das dosagens bioqumicas e das variaes no meu

DNA estaro a minha disposio, assim que estiverem prontos. Se for da minha
opo ser informado sobre os resultados destes exames deverei entrar em
contato com o mdico pesquisador responsvel pelo projeto (Dr. Domingos
Rios) no telefone que consta neste termo de consentimento e marcar uma data
para recebimento destes resultados no endereo que consta no rodap deste
documento. Neste caso, as informaes sobre os exames de DNA no sero
utilizadas para aconselhamento gentico pois este estudo ainda um estudo
preliminar em nossa populao carecendo de mais informaes para que estes
dados possam servir para aconselhamentos gentico e clnico. Quando da
entrega dos resultados receberei esclarecimentos cientficos a respeito dos
exames de DNA e no caso dos exames bioqumicos, caso haja alguma
alterao, serei encaminhado ao cardiologista que me acompanha e que
solicitou o exame de cateterismo cardaco.
Permito aos pesquisadores armazenar os dados e material biolgico/gentico
coletado para futuros estudos envolvendo genes candidatos a associao com
doena cardaca. O sigilo sobre estas informaes ser mantido e as amostras
com material biolgico no sero identificados com o meu nome de tal forma
que meu anonimato ser mantido. Se estes dados forem utilizados em outros
projetos no futuro, os pesquisadores responsveis pelo projeto devero entrar
em contato comigo para solicitarem nova autorizao para incluir meu material
gentico nestes estudos. Quando no for possvel contactar-me, o fato ser
justificado ao comit de tica em pesquisa. Tenho a liberdade de recusar-me a
participar deste estudo ou retirar as informaes e materiais fornecidos a
qualquer momento sem qualquer penalizao.
Os resultados deste estudo sero publicados em revistas cientficas,
respeitando o direito ao sigilo sobre as informaes individuais fornecidas. Em
caso de descontinuidade do projeto, tal fato ser comunicado ao Comit de tica
em Pesquisa do Centro de Pesquisas Gonalo Moniz.
Salvador, / / .
Assinatura do Paciente
Pesquisador responsvel:
Dr. Domingos Lzaro Souza Rios
CRM BA 15073 Tel: 71 356-8822 ramal 213
Centro de Pesquisas Gonalo Moniz
Laboratrio Avanado de Sade Pblica
R. Waldemar Falco, 121
Brotas Salvador Bahia
CEP 40290-001

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM BIOTECNOLOGIA

JAQUELINE FAGUNDES PEREIRA

ANLISE DE POLIMORFISMOS DE INSERO ALU COMO

Feira de Santana, BA.

ANLISE DE POLIMORFISMOS DE INSERO ALU COMO

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-graduao em

Orientador: Prof. Dr. Domingos Lzaro Souza Rios

Feira de Santana, BA.

Pelo incentivo ao estudo, enfatizando

Os polimorfismos de seqncia Alu podem ser usados para estimar

Palavras-chaves: Polimorfismos, sequncia Alu, ancestralidade, estruturao

The polymorphisms of Alu sequence can be used estimate ancestry,

Word-keys: Polymorphisms, Alu sequence, ancestry, population stratification.

4.4 ANLISES ESTATSTICAS...............................................................................33

Tabela 1 - Loci genticos, sequncia dos iniciadores, localizao cromossmica e

Figura 1 - Principais origens e destinos de trfico de escravos para o Brasil...........13

A populao brasileira se caracteriza por apresentar alta heterogeneidade

2.1 POPULAO BRASILEIRA

A populao brasileira bastante peculiar em relao a outras populaes do

Alm dos africanos, amerndios e portugueses, a populao brasileira

grande contribuio africana 53% a 81% nas amostras analisadas de So Gonalo,

2.2 POLIMORFISMOS GENTICOS

Um polimorfismo gentico refere-se variao em um gene, cromossomo,

remanescentes de quilombos do que na amostra de indivduos do Estado de So

2.3 ORIGEM E EVOLUO DAS INSERES ALU

As subfamlias Alu originaram-se como um resultado de mutaes que

As jovens subfamlias Alu so comumente ativas no que diz respeito

Figura 2 Diagrama esquemtico da evoluo da integrao recente de subfamlias Alu. Todas as

2.4 DOENA ATEROSCLERTICA CORONARIANA

A amostra utilizada no presente estudo constituda por pacientes que

Devido ao carter tri hibrido da populao brasileira e da forte influncia

2.5 ESTUDOS DE ASSOCIAO DO TIPO CASO-CONTROLE

Estudos de Associao permitem determinar se uma variante gentica

2.6 ESTRUTURA POPULACIONAL

Um modelo de populao estratificada pode ser definido, como aquele que

Diferenas sistemticas na ancestralidade entre casos e controles podem

Para Enoch et al. (2006), a probabilidade de detectar a estratificao

3.1 OBJETIVO GERAL

Caracterizar as freqncias de 30 polimorfismos de insero Alu em casos e

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Estimar as freqncias allicas e genotpicas dos marcadores estudados

4.1 CARACTERIZAO DA AMOSTRA

A amostra estudada foi previamente coletada pelo grupo do Prof. Domingos

4.2 POLIMORFISMOS ESTUDADOS

Foram estudados 30 polimorfismos de seqncia Alu (Tabela 1), estes

Tabela 1 - Loci genticos, seqncia dos iniciadores, localizao cromossmica e tamanho do

4.3 ANLISE LABORATORIAL

4.3.1 Extrao de DNA:

O DNA foi extrado no Centro de Pesquisas Gonalo Moniz/ Fundao

4.3.2 Reao em Cadeia de Polimerase (PCR)

O DNA genmico foi amplificado utilizando a tcnica da PCR-multiplex,

numerados corretamente. Por fim, 3L de DNA genmico foi adicionado nos

Tabela 2- Componentes da mistura de reao de PCR

Ya5ACA733 13,2L 2,5L 0,2L 1,0L 2,0L 0,1L

Ya5ACA917 11,2L 2,5L 0,2L 0,5L 2,0L 0,1L

Ya5ACA1441 11,2L 2,5L 0,2L 1,0L 2,0L 0,1L

Ya5ACA1555 11,2L 2,5L 1,0L 0,1L

Ya5_531F 11,1L 2,5L 0,2L

Yb8NBC67 11,1L 2,5L 2,0L

A soluo da PCR juntamente com o DNA genmico foram submetidos a um

Tabela 3- Programa utilizado para amplificao das seqncias Alu

Quantidade de ciclos Temperatura/ Tempo