INSTITUTO TECNOLOGICO DE MERIDA.

INSTRUMENTACION ANALITICA

Cromatografa de lquidos de
alta resolucin
HPLC
Jorge Carlos Vzquez Snchez.
 ndice
Objetivo Teora cintica o dinmica.
Que es la cromatografa. Detectores empelados en HPLC.
Utilidad de la cromatografa. Anlisis cuantitativos.
Empleo. Cuantificacin cromatografica.
Tipos de cromatografa. Mtodos de cuantificacin.
Diagrama de bloques.
Fase mvil y estacionaria.
Sistema de pretratamiento de fases.
Equipo de filtracin para HPLC.
Lenguaje del Analista.
Vlvula de inyeccin.
Eluyentes usados en HPLC
 Objetivo
Conocer que estudia la cromatografa de lquidos de alta
resolucin y su campo de aplicacin.
 Que es la cromatografa
Tcnica de separacin en la cual, los componentes de la muestra, se
distribuyen entre dos fases de diferente naturaleza, como consecuencia de
la variacin de velocidad que se establece al ser arrastrados por una fase
mvil, lquida o gaseosa, a travs de una fase estacionaria
 Tcnicas Antiguas de Cromatografa de Lquidos.
Recipiente para
abastecimiento
Unin de vidrio del solvente
esmerilado

Relleno previo para proteger

el empaque de la cada del
liquido
Columna empacada

Llave

Tapn de hule
A la bomba

Matraz de succin
 Utilidad de la Cromatografa de lquidos de alta resolucin

Determinaciones cuantitativas exactas.

Determinacin de compuestos no voltiles (alto Peso Molecular,
iones metlicos) o termolbiles.

El poder de la cromatografa de lquidos permite efectuar la separacin,

identificacin y cuantificacin de las especies solubles.
 Empleo
Aplicabilidad a sustancias de inters general (industria, salud,
medioambiente).

Aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos,

frmacos, terpenoides, plaguicidas, antibiticos, esteroides, etc.

Separacin y determinacin de especies en diversos materiales orgnicos,

inorgnicos y biolgicos.
Diagrama de bloques que muestra los componentes de un
aparato de HPLC
 Fase mvil y Fase estacionaria
Fase mvil: es un disolvente liquido que contiene la muestra como
mezcla de solutos.

Fase estacionaria: es donde se retienen los componentes

provenientes de la fase mvil y esta compuesto de un material poroso
que tiene afinidad por las partculas.

1. Slidos muy porosos con capacidad adsorbente: Gel de slice (SiO2);

Almina(Al2O3)
 Sistemas de pretratamiento de fases
mviles
1. Para eliminacin de gases disueltos y slidos en suspensin
2. desgasificacin por vaco
3. calentamiento
4. agitacin
5. inyeccin de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio).
6. Filtros para polvo y partculas slidas en suspensin.
 Equipo de filtracin HPLC

Es imprescindible filtrar y desgasificar

todos los estndares y muestras antes de
introducirlos en el hplc
 Lenguaje del Analista
Eluato: es el liquido que sale de la columna de CL.

Elucin: Es la migracin de los solutos a lo largo de la columna hacia la salida

de esta.

Eluyente: es la fase mvil que ocasiona la elucin.

Elucin isocratica: es una corrida cromatografica en la cual permanece

constante la composicin de la fase mvil(contrario al gradiente de elucin).

Gradiente de elucin: en una tcnica de CL en la cual varia en forma continua la

composicin de la fase mvil durante la elucin. Algunas veces se cambia la
composicin en etapas y en este caso el termino gradiente se puede cuestionar.
 Tiempo de retencin: tR: tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el
sistema cromatogrfico. Esta retencin se ejerce en funcin de las
caractersticas moleculares de cada compuesto.
 TEORA CINTICA O DINMICA.
La eficacia de la columna para separar los componentes de la muestra vendr
dada por dos factores:

1. La diferencia de la velocidad de migracin de los solutos de la mezcla, que

origina la separacin fsica entre los picos.

2. La velocidad que tarda en alcanzarse el equilibrio en cada plato terico que

traer consigo un ensanchamiento del pico cromatogrfico.
 Todos los detectores producen una seal que se relaciona con la concentracin
de las especies en disolucin

El TR nos sirve desde el punto de vista cualitativo para determinar la presencia

de una determinada sustancia en la muestra.

Se utiliza un estndar interno para comparar los tiempos de retencin y la

respuesta del detector con la concentracin
 Detectores empleados en HPLC
Detector espectrofotomtrico: puede ser un tubo fotomultiplicador o un
arreglo de diodos. Con este se puede efectuar un anlisis simultneos en
mltiples longitudes de onda, ya sea en la regin visible o en la ultravioleta.
Cuando la ptica permite que el detector y la fuente de radiacin estn a 90
grados, es posible efectuar determinaciones fluorescentes.

Detector de ndice de refraccin: totalmente mide la diferencia entre el

eluyente puro y el eluyente mas el componente de la muestra. Mientras
mayor sea la diferencia entre los ndices de las dos especies, mayor ser la
pendiente. Son limitantes la baja sensibilidad, la imposibilidad de usarse con
programacin de eluyentes, y la afectacin producida por cambios de
temperatura.
 Detector de conductividad: posee respuesta universal con respecto a los iones,
es simple y econmico. Su seal es proporcional a la diferencia de conductividad
entre la fase mvil y el componente de la muestra.

Si se emplean contra iones de baja conductividad (biftalato benzoato,fenolato), la

seal ser positiva y proporcional a la concentracin

Cuando se usan contra iones de alta conductividad KOH para cationes o HNO3 ,
el componente produce una disminucin de la seal, y esto es por lo que se
conoce como deteccin indirecta.

Detector electroqumico: Es muy sensible y selectivo hacia las especies inicas

o complejos capaces de ser oxidados o reducidos
 Anlisis cuantitativos
Altura del pico: su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los
clculos al efectuar la cuantificacin. Las desventajas son la mayor
variabilidad de la altura con respecto al rea del pico, y la perdida de
informacin cuando el pico se sale de la escala. La sobrecarga de la
columna altera todos los tipos de integracin, pero en este caso es mas
significativo el deterioro de la cuantividad.

rea de pico: su empleo se basa en el hecho de que la concentracin de un

componente en la muestra es directamente proporcional a su rea. La
determinacin por rea de pico es independiente de los efectos de
ensanchamiento. Por lo tanto es el parmetro analtico mas adecuado para
realizar el anlisis cuantitativo. Los programas de computo actuales permiten
obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetra
del pico
 Cuantificacin cromatografica.
Disponer de patrones adecuados
Cromatograma reproducibles.

mi = Ki* Ai
mi = masa del compuesto inyectado en la columna.
Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i.
Ai = rea del pico de elucin del compuesto correspondiente al compuesto i
 1. Estndar o patrn
externo.
Mtodos de cuantificacin 2. Curva analtica o
calibracin.
3. Adicin de estndares
4. Estndar interno

Estndar o patrn externo

 Curva analtica o calibracin.

y = 0.4846x + 0.0689
CURVA 1 R = 0.9765
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
0.9

0.8
0.8199
0.7

0.6

0.5
Area

0.4894
0.4

0.3 0.3523

0.2
0.2196
0.1

0
0.0383
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
Concentracion
Adicin de estndares
Estndar o patrn interno: factores de respuesta relativos