PROGRAMAO AULAS PRTICAS BIOQUMICA GERAL

ENGENHARIA DE ALIMENTOS
Prof. Lvia Bracht

Dia Aula Pgina

Aula prtica 1: Curva de titulao
28/08/2015 3
da alanina
04/09/2015 Aula prtica 2: Fotometria 4
Aula prtica 3: Determinao da
11/09/2015 concentrao de protenas pelo 13
mtodo de Biureto
Aula prtica 4: Extrao,
25/09/2015 caracterizao e dosagem da 14
casena
Aula prtica 5: Cintica da
02/10/2015 16
invertase de leveduras
Aula prtica 6: Hidrlise
09/10/2015 18
enzimtica do amido
Aula prtica 7: Gliclise e
06/11/2015 19
fermentao em leveduras
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NORMAS RECOMENDVEIS AO LABORATRIO

O uso de guarda-p.
Desligar o celular.
No fumar no laboratrio.
Ler o roteiro das prticas com antecedncia para melhor aproveitamento das
aulas.
Realizar somente os experimentos indicados na sala.
Todo material referente aula prtica de responsabilidade da equipe que o
utilizar. Qualquer incidente com este material deve ser comunicado ao
professor.
Qualquer incidente como: derramamento de reagentes sobre a pele, ingesto
dos mesmos durante a pipetagem, lavar a regio com bastante gua, no esfregar
a rea afetada. Comunicar o professor imediatamente.
No jogar fora o material que julgar inutilizado, pois o mesmo poder ser
recuperado.

PRINCPIOS GERAIS DE TCNICA

Usar sempre uma pipeta para cada reagente, evitando contaminao dos
mesmos.
No trocar as rolhas e tampas dos frascos de reativos.
Ler atentamente o rtulo dos frascos de reativos antes de utiliz-los.
No abandonar o laboratrio durante o desenvolvimento de uma reao.
Ao acender o bico de gs, sempre acender a chama antes de abrir a torneira
do mesmo.
No trabalhar com substncias inflamveis (lcool, ter, clorofrmio, etc...)
nas proximidades de uma chama.
Os reagentes txicos ou corrosivos, como lcalis ou cidos fortes e
concentrados no devero ser pipetados com a boca, caso no tenha pra, ou
pipetador automtico, utilize cilindros graduados ou buretas.
Aps o uso de gs ou gua, sempre fechar as torneiras.
Ao desprezar na pia os produtos das reaes, sempre fazer com descarga de
gua, para evitar corroso dos encanamentos.
No jogar na pia papis de filtro usados nas reaes ou substncias slidas
que obstruam os encanamentos.
Os equipamentos s devero ser manipulados aps a instruo de como us-
los.
Ao trmino da aula, realizar a limpeza da rea de trabalho e lavar o material
utilizado ou deposit-los em cubas prprias.
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AULA PRTICA BIOQUMICA GERAL - 1

CURVA DE TITULAO DA ALANINA

Reagentes
Soluo de alanina 0,02 M
cido clordrico 1 M
Hidrxido de sdio 0,1 M

Materiais
1 Bquer pequeno de 20 ou 50 mL
1 proveta de 50 mL
Pipetas automticas de 1 mL
Ponteiras para pipeta automtica
Papel absorvente
Barra magntica
Pissete com gua destilada

Equipamentos
pHmetro
Agitador magntico

Procedimento

1) Calibre cuidadosamente o medidor de pH, utilizando as solues-tampo pH 4,0

e pH 7,0.
2) Aps calibrao lave cuidadosamente o eletrodo com gua destilada e seque
com papel absorvente.
3) Utilizando a proveta, coloque 20 mL da soluo de alanina no bquer
4) Coloque a barra magntica, deposite o bquer sobre o agitador magntico,
mergulhe o eletrodo no lquido e comece a agitao (CUIDADO: comece a
devagar! O bquer deve estar posicionado bem no centro do agitador para evitar
que a barra magntica quebre o eletrodo).
5) Leia o pH inicial e tome nota.
6) Mantendo a agitao, adicione 1,0 mL de HCl 1 M; aps a estabilizao, leia o
pH e tome nota, anotando-o na primeira linha do quadro abaixo.
7) Adicionar a esta mesma soluo em agitao 0,5 mL de NaOH 0,1 M.
8) Espere a estabilizao e tome nota da medida do pH.
9) Repita o procedimento anterior (itens 7 e 8), sempre anotando o pH resultante
at que este atinja valores de aproximadamente 12.
10) Faa um grfico, colocando os valores de pH na ordenada (eixo y) e a
quantidade acumulada de NaOH na abscissa (eixo x).
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AULA PRTICA BIOQUMICA GERAL 2

FOTOMETRIA

1. Aspectos gerais

A fotometria clssica , sem dvida, um dos maiores trunfos de que

dispe o laboratrio na atualidade. Esta tcnica de medida, continuamente
aperfeioada, ainda permanecer durante longo tempo sendo um dos mais teis
instrumentos de medida. Com esta tcnica, compostos desconhecidos podem ser
identificados por seus espectros caractersticos ao ultravioleta, visvel ou
infravermelho. As concentraes de solues de compostos conhecidos podem ser
determinadas, medindo-se a absoro de luz em um ou mais comprimentos de onda.
Reaes enzimticas podem ser freqentemente seguidas, medindo-se,
espectrofotometricamente, o aparecimento de produto ou desaparecimento de
substrato. As regies espectrais do ultravioleta e visvel tm mais importncia para
uso quantitativo, enquanto que a regio do infravermelho e outras, para elucidao
estrutural.
Nossa idia apresentar os princpios e operaes bsicas que devem ser
parte integrante do conhecimento daqueles que operam com espectrofotmetros.
Quando usamos a espectrofotometria como processo de medida,
basicamente estamos empregando as propriedades dos tomos e molculas de
absorver e emitir energia eletromagntica, em uma das muitas reas do espectro
eletromagntico. Os fenmenos fsicos que acompanham a absoro de luz nas
vrias regies do espectro eletromagntico e as caractersticas da faixa visvel so
ilustradas nas tabelas abaixo.

Regio Comprimento de onda Fenmeno fsico

Raios X 0,1 - 100 nm efeito na molcula

Ultravioleta 100 - 400 nm eltrons de subvalncia excitados a nveis
energticos mais altos
Visvel 400 - 700 nm eltrons de valncia excitados a nveis
energticos mais altos
Infravermelh 700nm - 100 m vibrao molecular
o
Microonda 100m - 30 cm rotao molecular

Tabela 1. Caractersticas do Espectro Eletromagntico Radiante

(EMR).

Comprimento Cor Cor

de onda (nm) da soluo absorvida
380 - 430 violeta amarelo-verde
430 - 475 azul amarelo
475 - 495 verde-azul laranja
495 - 505 azul-verde vermelho
505 - 555 verde prpura
555 - 575 amarelo-verde violeta
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575 - 600 amarelo azul

600 - 620 laranja azul-verde
620 - 700 vermelho verde-azul

Tabela 2. Faixa visvel do Espectro Eletromagntico Radiante.

Ao falarmos em fotometria, pensamos instintivamente em luz. Na

realidade, a poro visvel do espectro eletromagntico (EMR) pequena, sendo ela
que excita a retina, produzindo nosso mais importante sentido: a viso. Esta relao
fotometria-luz desvantajosa porque encaramos o EMR em termos de luz e cor,
quando deveria ser considerado em termos de energia, o que a realidade.
Essa energia propagada sob a forma de ondas, que poderiam ser
esquematicamente consideradas como uma unio de vales e elevaes que partem do
ponto de emisso de energia. A distncia entre dois pontos mais altos de duas
elevaes contguas denominada comprimento de onda, simbolizado por (Figura
1). Os comprimentos de onda variam de menores que 0,1 nm (raios gama) a maiores
que 25 x 107 nm (ondas de rdio). O nanmetro (nm) a unidade empregada
atualmente para medida do comprimento de onda. A quantidade de energia
inversamente proporcional ao comprimento de onda e, portanto, os menores
comprimentos de onda fornecem os maiores nveis de energia.

Figura 1. Propagao da energia radiante.

Os aparelhos que medem a absoro de energia eletromagntica radiante

por solues e que tm aplicao no laboratrio so: os fotocolormetros, que
utilizam filtros compostos para selecionar pores do espectro, e os
espectrofotmetros, que utilizam grades de difrao ou prismas na seleo da poro
desejada do espectro.

2. Componentes bsicos da fotometria

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A Figura 2 esquematiza os componentes bsicos da fotometria:

1. Fonte de energia eltrica: fornecedora de energia regulada, constante e
apropriada para a operao do aparelho.
2. Fonte de energia radiante: capaz de emitir uma mistura de
comprimentos de onda.
A lmpada de tungstnio a mais utilizada fonte de energia radiante
para o ultravioleta prximo ao visvel. J a lmpada de hidrognio a melhor fonte
de energia radiante constante na regio do ultravioleta. Estas lmpadas requerem
uma estabilizao de 15 minutos, aps ligadas, para que possam fornecer quantidade
constante de energia radiante.
3. Monocromador: utilizado para isolamento da poro desejada do
espectro. Isto possvel utilizando-se de filtros, prismas e grades de difrao.
O mais comum o uso de prismas. Os pequenos comprimentos de onda
so refratados em grau maior, o que produz um espectro no linear com pequena
definio nos grandes comprimentos de onda.
4. Fenda: o prisma necessita receber energia radiante atravs de uma
fenda de entrada e o isolamento espectral feito por uma fenda de sada. Os prismas
permitem o isolamento de faixas do espectro com diminuta faixa de emisso (0,5 a
1,5 nm).
5. Porta-cubeta: recipiente onde se coloca a cubeta contendo a soluo a
ser medida.
As cubetas so, provavelmente, a poro mais negligenciada do sistema
fotomtrico, apesar de serem de grande importncia. Quando no so corretamente
cuidadas, contribuem decisivamente no aumento do erro fotomtrico. Existem dois
tipos de cubetas: quadrada e redonda. A cubeta quadrada tem faces planas e
paralelas. polida ticamente e totalmente isenta dos efeitos de lente ou dos erros
de refrao da cubeta redonda. utilizada para medies onde se requer grande
preciso e exatido. A cubeta para medidas no ultravioleta, em comprimentos de
onda abaixo de 320 nm, deve ser de quartzo, pois nesta regio o vidro absorve
energia radiante. A cubeta redonda, por sua vez, no exatamente redonda, no
polida, apresentando irregularidades na superfcie. Est sujeita aos erros de refrao
e possui efeito de lente. A cubeta redonda muito sensvel ao efeito de posio em
relao ao feixe de luz e, na maioria dos casos, contm uma marca orientadora para
que seja colocada no porta-cubeta, sempre na mesma posio. Caso esta orientao
no seja seguida, pequenos erros de refrao ou de efeito de lente podem ser
ampliados, acentuando, portanto, o erro fotomtrico.
6. Detector: utilizado para receber a energia radiante transmitida atravs
da soluo e transform-la em energia eltrica. O detector pode ser uma clula
fotoeltrica ou um fotomultiplicador.
A clula fotoeltrica composta de uma placa de ferro com uma das
faces recoberta por uma camada de selnio cristalino. Um condutor eltrico
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transparente colocado sobre a camada de selnio e funciona como polo negativo. A

placa de ferro atua como polo positivo. Os ftons, atingindo a camada de selnio,
transferem sua energia para eltrons que passam placa de ferro, atingem o circuito
medidor que se liga clula e retornam pelo polo negativo camada de selnio.
No h, neste caso, perda de eltrons. O fotomultiplicador se assemelha
a uma vlvula e contm um ctodo recoberto de uma substncia que emite eltrons
proporcionalmente energia recebida.
7. Circuito medidor: recebe a energia eltrica emitida pelo detector,
apresentando-a sob a forma til de medida, isto , absorbncia e/ou transmitncia.
Este circuito consiste basicamente em um m permanente em forma de ferradura
com uma espiral mvel suspensa entre seus plos. A espiral mvel recebe a corrente
fornecida pelo detector e seu eixo est perpendicular ao campo magntico formado
pelos dois plos do m permanente. Um ponteiro ligado espiral,
movimentando-se sobre uma escala graduada em transmitncia e/ou absorbncia.

3. Leis da fotometria

Quando um raio de energia radiante atravessa uma soluo, a energia

incidente (Io) ser sempre mais intensa que a energia emergente (I). Esta atenuao
da intensidade de energia pode ser atribuda a (1) reflexes nas interfaces entre o ar e
a parede da cubeta e entre a soluo e a parede da cubeta; (2) disperso por
partculas presentes na soluo; e (3) absoro da energia pela soluo em estudo
(Figura 3).

Io 2 I

1 3

Figura 3. Absoro da energia radiante que atravessa uma soluo.

Transmitncia

a relao entre a energia transmitida (I) e a energia incidente (Io).

T = I/Io

Se uma determinada soluo no absorve energia, I e I0 tm o mesmo

valor e logo I/I0 ser igual a 1. Conclui-se, assim, que qualquer soluo que absorva
energia ter transmitncia menor que 1 (porque I , neste caso, maior que Io). Para
evitar operaes com decimais, recorreu-se ao artifcio da multiplicao por 100.
Assim, quando I e Io so iguais T = 1 = 100%.

Absorbncia
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a relao logartmica entre a energia incidente (Io) e a energia

transmitida (I) pela soluo.

A = log Io/I = -log T

Nas aplicaes da fotometria, a absoro o fator primrio na reduo

da energia incidente. Quando se usa energia monocromtica (simples comprimento
de onda), a frao de radiao absorvida pela soluo, ignorando perdas por reflexo
e disperso, ser funo da concentrao da soluo e da espessura da soluo.
Matematicamente, esta funo pode ser definida como:
Io = e -( c l)

onde:
IO = intensidade de energia incidente
e = base dos logartimos neperianos (2,303).
= absortividade; constante caracterstica da soluo e que depende do
comprimento de onda.
c = concentrao da soluo.
l = espessura da soluo atravessada pela radiao.

Portanto, esta frmula estabelece que, quando a energia radiante

monocromtica atravessa uma soluo, a quantidade de energia transmitida diminui
exponencialmente com (1) o aumento da espessura atravessada e (2) aumento da
concentrao ou da intensidade de cor da soluo.
O primeiro conceito deriva da Lei de Lambert que pode ser representada
pela equao:

log Io/I = l

J o segundo conceito deriva da Lei de Beer que, por sua vez, pode ser
representada como:

log Io/I = c

Estes dois conceitos constituem a Lei de Lambert-Beer, que pode ser

representada por:

log Io/I = c l

Como A = log Io/I, ento a equao acima pode ser representada como:

A=cl

4. Aplicaes da fotometria

4.1. Curva de calibrao ou curva padro

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A principal finalidade de uma medida espectrofotomtrica, nas regies

do ultravioleta e visvel, avaliar quantidades. Assim, extremamente importante
efetuar uma rigorosa calibrao visando obter resultados exatos. Para obter-se uma
curva de calibrao alguns aspectos devem ser considerados como: a escolha de uma
soluo padro, o estabelecimento de um branco adequado e a seleo da rea
espectral.

Solues padres

Constituem parte integrante da anlise quantitativa no laboratrio e

usadas nas dosagens de amostras desconhecidas. Uma soluo padro apresenta
concentrao exata de uma substncia conhecida, que servir como referncia na
determinao fotomtrica de concentraes desconhecidas desta mesma substncia.
Uma soluo padro tem grande importncia no preparo da curva de calibrao.

Brancos

As medidas de absoro de luz devem ser feitas em relao a um branco,

uma soluo que contm todos os componentes do experimento exceto o composto
que est sendo medido. Quando usamos o branco em fotometria, para estabelecer o
zero-Absorbncia ou 100%-Transmitncia, estamos realmente usando um sistema
simples para eliminar a absorbncia dos reagentes e das cubetas, perdas por reflexo
e refrao, e compensao do efeito de lente produzido pelas cubetas redondas.
Usamos o ponto zero-A ou 100%-T porque assim eliminamos a
necessidade de clculos, pois neste ponto a energia incidente (Io) torna-se igual a
100 (T = I/Io).
Em algumas dosagens, obtemos brancos com elevada absorbncia, o que
dificulta o acerto do zero em muitos aparelhos. Neste caso, deve-se efetuar a leitura
do branco e da amostra acertando o zero com gua destilada, determinando-se a
seguir as diferenas entre branco e amostra para os posteriores clculos.

Seleo da rea espectral

Quando se realiza uma medida fotomtrica deve-se utilizar uma faixa do

espectro na qual a energia radiante seja absorvida ao mximo, a fim de se obter o
mais alto grau de sensibilidade. Uma soluo azul absorve o amarelo com maior
intensidade e, portanto, deve ser escolhida a poro amarela para medida de soluo
azul. Na maioria das determinaes colorimtricas, utiliza-se sempre uma faixa
espectral cuja cor complementar da soluo a ser medida (ver Tabela 2).
O melhor processo para avaliar a correta regio espectral para uma
medida fotomtrica consiste no preparo do espectro de absoro, que consiste no
relacionamento entre as absorbncias e os respectivos comprimentos de ondas.

Obteno da Curva de Calibrao

O preparo da curva de calibrao de grande importncia e deve ser

bem entendido. Todo analista deve ser capaz de preparar suas prprias curvas de
calibrao e interpretar os resultados obtidos.
 10

Para se obter o valor da concentrao de substncias cuja concentrao

se desconhece, necessrio estabelecer uma relao entre a absorbncia desta
soluo em diferentes concentraes com as suas concentraes. Isto se chama curva
de calibrao.
O procedimento a seguir pode ser usado como processo de preparo da
curva:
1. Preparar uma srie de padres exatos, cobrindo a faixa de trabalho
usada ou indicada. Usar o padro recomendado para o mtodo a ser calibrado.
2. Dosar todos os padres de acordo com a tcnica recomendada. Efetuar
as leituras colorimtricas, usando o branco apropriado para acertar o zero-A ou
100%-T, alm do comprimento de onda recomendado pela literatura ou obtido pela
curva de absoro espectral previamente realizada.
3. Ao proceder as leituras em Transmitncia, recorrer tabela de
converso, transformando os resultados em Absorbncia.
4. Plotar os resultados em papel milimetrado, relacionando Absorbncia
(ordenada) com as concentraes dos padres (abcissa).
Examinar bem os pontos e decidir se eles sero cobertos por uma linha
reta. Se os pontos aparentemente seguirem uma linha reta, traar uma curva de modo
que mais se aproxime de todos os pontos obtidos. A curva no deve ser traada de
ponto a ponto, mas interpolando atravs dos pontos.
5. Examinar a curva traada, avaliando se ela tem sensibilidade correta
(Figura 5).

Abs A

B
C

concentrao

Figura 5. Tipos de curva de calibrao. (A) curva muito sensvel; (B)

curva de sensibilidade ideal e (C) curva pouco sensvel.

A curva de calibrao ideal deve ter ngulo de 45 em relao ao ponto

de origem. Curvas de ngulos muito agudos ou obtusos no devem ser utilizadas.
6. Se a curva no for ideal devemos procurar um meio de corrigir este
problema usando os seguintes processos:
a. utilizar uma cubeta com dimetro interno maior ou menor;
b. alterar o comprimento de onda. Este processo ir diminuir a
sensibilidade em muitos casos, mas um recurso de muita valia;
c. aumentar ou diminuir a alquota. Isto deve ser feito com muito
cuidado, verificando se no ocorrem alteraes no sistema colorimtrico
comprometendo a segurana do mtodo;
d. aumentar ou diminuir o volume final da reao, variando os volumes
dos reagentes.
 11

Evidentemente, uma curva de calibrao no estvel indefinidamente,

podendo variar com: (a) variao da sensibilidade do aparelho de medida (fonte de
energia radiante, detector, calibrao do comprimento de onda etc) e, (b) com
variaes da sensibilidade dos reagentes.
Todas as vezes que forem preparados novos lotes de reagentes ou que
forem substitudas lmpadas do aparelho, novas curvas de calibrao devero ser
realizadas.
interessante observar a relao existente entre a curva de calibrao e a
Lei de Lambert-Beer. Verifica-se que a Absorbncia (A) diretamente proporcional
concentrao (C) quando considera-se e l constantes caractersticas da soluo e
da cubeta, respectivamente.

4.2. Calibrao com padro dirio

prtica considerada correta porque a calibrao no dia-a-dia feita

com um padro dosado praticamente nas mesmas condies das amostras. O clculo
feito da seguinte forma:

[amostra] = absorbncia da amostra

[padro]
absorbncia do padro

4.3. Calibrao com fator

O fator de calibrao (FC) um artifcio utilizado rotineiramente e seu

clculo feito de acordo com o que se segue:

concentrao do padro
FC =
absorbncia do padro

Outra maneira de se obter o fator de calibrao atravs da prpria

curva de calibrao, ou seja, pelo coeficiente angular da reta obtida.

FC = cotag = 1/tg

como tg = sen / cos , ento:

cos

FC = sen

De onde se conclui que:

cateto adjacente x2 x1
FC = = y
cateto oposto 2 y1

De posse do fator de calibrao (FC), possvel obter-se a concentrao

da amostra:
[amostra] = absorbncia da amostra FC
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5. Fotometria - Parte experimental

5.1. Espectro de absoro do permanganato de potssio

Reagente:
Soluo de KMnO4 a 4,5 mg/mL

Procedimento:
1. Marcar 3 tubos com as letras B (branco), A(amostra) e A2 (amostra
com a metade da concentrao de A);
2. Distribuir os reagentes como indicado no quadro abaixo:
Reagentes/mL Tubo B Tubo A Tubo A2
gua destilada 5,0 - 2,5
KMnO4 - 5,0 2,5

3. Ligar o espectrofotmetro;
4. Escolher um filtro ou selecionar um valor de , de acordo com o
aparelho.
5. Colocar o tubo B no local apropriado do aparelho e zerar (100%T ou 0
de Absorbncia)
6. Substituir o primeiro tubo pelo tubo A, observar e anotar os resultados
mostrados na escala de Transmitncia e na escala de Absorbncia; e
aps, pelo tubo A2 e anotar os resultados na Tabela abaixo.
7. Repetir os itens 4, 5, e 6 (mudando o ).

Comprimento Transmitncia (T) Absorbncia (Abs)

de onda - A A2 A A2
460
490
520
580
650

8. Representar graficamente: na ordenada os valores de T e de Abs

encontrados e na Abscissa os respectivos .
9. Identificar o comprimento de onda onde a Absorbncia for mxima e
discutir os resultados.
10. Identificar o comprimento de onda mais sensvel para as determinaes
fotomtricas da substncia utilizada, ponto no qual as duas
concentraes apresentam maior diferena de Transmitncia (T%)
possibilitando reconhecimento de pequenas diferenas de concentrao.
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AULA PRTICA BIOQUMICA GERAL - 3

DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PROTENAS PELO MTODO
DE BIURETO

Objetivos:
- Elaborar uma curva padro de protena e estabelecer a sensibilidade de um mtodo
espectrofotomtrico. - Resolver problemas especficos: clculos envolvendo diluio e
determinao da concentrao de diferentes solues.

Reativos:
- Soluo padro de protena: albumina se soro bovino 5 mg/mL
- Soluo de protena de concentrao desconhecida
- Reagente de Biureto

Preparo dos reativos:

1. Reagente de Biureto: dissolver em 500 mL de gua destilada:
- 1,5 g de sulfato de cobre pentaidratado
- 6,0 g de tartarato duplo de sdio e potssio
- Adicionar 300 mL de soluo de hidrxido de sdio a 10 % com constante
agitao.
- Adicionar gua destilada suficiente para 1 litro de soluo.

2. Soluo padro de protena: pesar exatamente 500 mg de albumina bovina

(balana analtica) e dissolver em 100 mL de gua destilada (balo volumtrico).
Aliquotar em fraes de 10 mL de conservar a -20 C (freezer).

Tcnica:
I. Curva de calibrao
1. Organizar uma bateria de 8 tubos de ensaio.
2. Identifica-los de 1 a 6 e dois tubos como A e B.
3. Adicionar os reagentes conforme a tabela:
Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo
Reagentes (mL) 1 2 3 4 5 6 A B

Soluo padro de - 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 - -

protena (5mg/mL)
Amostra protena - - - - - - 1,0 0,5
gua destilada 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 - - 0,5
Reagente de biureto 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

4. Agitar e deixar em repouso por 10 minutos

5. Utilizar o tubo 1 para calibrar o espectrofotmetro: 0 de absorbncia ou 100% de
transmitncia em 540 nm.
6. Determinar a absorbncia das solues dos tubos 2 a 6 e dos tubos A e B.
7. Traar em papel milimetrado, o grfico: concentrao final de protenas
(mg/mL) X Absorbncia (A). Interpolar a melhor reta possvel, passando pela
origem dos eixos cartesianos.
8. Determinar a concentrao de protena (mg/mL) presente nas amostras problema
utilizando o grfico da curva de calibrao.
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AULA PRTICA BIOQUMICA 4

EXTRAO, CARACTERIZAO E DOSAGEM DE CASENA

1. Extrao e caracterizao

Em um bquer de 100 ml contendo 10 ml de leite, adicionar 40 ml de

gua destilada. Retirar uma alquota de 1 ml e realizar a reao do biureto (1 ml de
amostra + 4 ml do reagente de biureto). Analisar.
A seguir, utilizando-se de um medidor de pH, acrescentar cido actico
5%, gota a gota, at que ocorra precipitao. Isto deve ocorrer quando o pH est
prximo de 4,6. A adio do cido ao leite provoca a precipitao da casena,
juntamente com gua, lipdeos, protenas. Deixar em repouso por 5 minutos.
Agitar o frasco e recolher uma alquota de 10 ml.
Centrifugar a 3000 rpm por 10 minutos e recolher o sobrenadante.
Determinar o teor de protenas no sobrenadante.
Adicionar 2 ml de ter etlico, e a seguir, homogeneizar com um basto
de vidro. A adio de ter etlico tem por finalidade retirar materiais gordurosos.
Centrifugar a 3000 rpm por 2 minutos e desprezar o sobrenadante.
Se necessrio adicionar, novamente, 2 ml de ter etlico,
homogeneizando com basto de vidro. Centrifugar e desprezar o sobrenadante.
Adicionar 2 ml de etanol absoluto e homogeneizar. A adio de etanol
tem por finalidade retirar a gua de solvatao que permaneceu junto protena.
Centrifugar a 3000 rpm por 2 minutos e desprezar o sobrenadante. Repetir esta
etapa, adicionando lcool, caso seja necessrio.
Opcionalmente, aps o tratamento com ter etlico e etanol, pode-se
pesar a matria seca (casena) e comparar com o resultado da dosagem de protenas
feita pela tcnica do biureto.
Finalmente, adicionar 2ml de hidrxido de sdio 2 N e redissolver o
precipitado, completando com gua destilada para um volume final de 5 ml.
Realizar a dosagem de protenas.

2. Dosagem quantitativa da casena do leite

A quantidade de protenas presentes em uma soluo ou suspenso pode

ser medida pelo mtodo quantitativo do biureto.

Material
Soluo padro de albumina 10 mg/ml
Reagente de biureto

Dosagem
Retirar uma alquota de 0,2 ml de amostra e acrescentar 0,8 ml de gua.
A seguir, acrescentar 4 ml do reagente de biureto e ler contra o branco, em 540 nm.
Determinar a concentrao de casena, atravs da curva de calibrao,
obtida em aula anterior. Calcular a concentrao de casena em um litro de leite.

3. Valores tericos
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Protenas totais do leite de vaca = 3,3 g%

80% deste total corresponde a casenas

Protenas do leite de vaca Concentrao aproximada pI

(g%)
s1-Casena 1,37 4,1
K-Casena 0,37 3,7
-Casena 0,62 4,5
-Casena 0,12 5,8 6,0
-Lactoglobulina 0,30 5,3
-Lactoalbumina 0,07 5,1
Albumina do soro bovino 0,03 4,7
Imunoglobulina (IgG) 0,06 5,6 6,0

3. Esquema operacional

10 ml de leite + 40 ml de gua

cido actico gota a gota at
precipitao

Repouso por 5 minutos. Agitar

Retirar alquota de 10 ml.
Centrifugar. Desprezar o sobrenadante

2 ml de ter etlico. Homogeneizar

Centrifugar. Desprezar o sobrenadante

2 ml de etanol absoluto. Homogeneizar

Centrifugar. Desprezar sobrenadante

Ressuspender o precipitado

Determinar a concentrao de protenas
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AULA PRTICA BIOQUMICA 5

CINTICA ENZIMTICA DA INVERTASE DE LEVEDURAS

Reativos:
1. Soluo da enzima invertase (0,05 e 0,1 mg protena/mL): pesar 50 g de
leveduras secas (fermento de po), suspender em 250 mL de bicarbonato de
sdio 0,15 mol/L e manter em banho-maria a 37 C durante 6 horas, com
agitao ocasional. Centrifugar por 20 minutos a 3.500 rpm. Coletar o
sobrenadante, que contm a enzima invertase ativa. Conservar a tpt de 4 C.
Normalmente, a concentrao de enzima para os ensaios de 0,1 mg de
protena/mL.
2. Soluo de sacarose 0,2 mol/L
3. Soluo-tampo acetato 0,05 mol/L pH 4,7
4. Reativo de 3,5-dinitrosalicilato (DNS): dissolver por aquecimento 5g de cido
3,5-DNS em 100 mL de NaOH 2 mol/L. Separadamente dissolver tambm por
aquecimento 150 g de tartarato duplo de sdio e potssio em 250 mL de gua
destilada. Misturar as 2 solues e completar o volume para 500 mL de gua
destilada.
5. Solues-tampo: pH 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0.

Procedimento:
A) Efeito da variao do pH do tampo sobre a atividade enzimtica

1. Organizar uma bateria com 9 tubos de ensaio.

2. Identific-los com nmeros de 1 a 9.
3. Adicionar os diferentes tampes e demais reagentes conforme a tabela:

Tubos
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Reagentes (mL)
Tampo pH 2,0 1,0 1,0 - - - - - - -
Tampo pH 3,0 - - 1,0 - - - - - -
Tampo pH 4,0 - - - 1,0 - - - - -
Tampo pH 5,0 - - - - 1,0 - - - -
Tampo pH 6,0 - - - - - 1,0 - - -
Tampo pH 7,0 - - - - - - 1,0 - -
Tampo pH 8,0 - - - - - - - 1,0 -
Tampo pH 9,0 - - - - - - - - 1,0
gua destilada 1,0 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8
Sacarose (0,2 mol/L) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Soluo de enzima 0,1 _ 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
mg/mL

4. Levar a bateria de tubos ao banho-maria a 25 C.

5. Incubar durante 5 minutos.
6. Adicionar 1,0 mL de soluo de 3,5-dinitrosalicilato (DNS) a cada um dos
tubos.
7. Levar os tubos para aquecer em banho-maria fervente por 5 minutos.
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8. Deixar esfriar por 5 minutos.

9. Adicionar 6,5 mL de gua destilada em cada um dos tubos.
10. Calibrar o espectrofotmetro a 540 nm com o tubo 1.
11. Proceder a leitura das absorbncias dos demais tubos. Traar o grfico: pH
(abcissa) x Absorbncia (ordenada)
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AULA PRTICA BIOQUMICA 6

HIDRLISE ENZIMTICA DO AMIDO CURVA DE TEMPO PARA A

ATIVIDADE DA AMILASE SALIVAR

1. Objetivos
Traar uma curva de tempo para a reao de hidrlise do amido pela amilase
salivar
Quantificar o substrato utilizando uma soluo de iodo/iodeto de potssio

2. Relao terico-prtica
Qumica de carboidratos; enzimas.

3. Reativos
Soluo de amido a 0,7%
Soluo de iodo 0,1mol/L
Soluo de iodeto de potssio 0,5 mol/L
Soluo de tampo imidazol 0,1mol/L pH 7,2
Saliva (mistura de 2 ou 3 doadores) diluda em tampo imidazol (1:250 a 1:500)

4. Diluio da saliva
Transferir 20 microlitros da mistura de saliva para um tubo de ensaio contendo 4,98
mL de tampo imidazol
* Evitar pegar s espuma da soluo de salina
**Manter na geladeira ou em banho de gelo at o momento do uso

5. Procedimento tcnico
a. Organizar uma bateria com quatro tubos de ensaio
b. Identific-los com nmeros de 1 a 4
c. Adicionar os reagentes conforme a tabela:

Reagentes (mL) Tubo Tubo Tubo Tubo

1 2 3 4
Soluo de amido 0,1 0,1 0,1 0,1
Tampo imidazol 0,1 0,1 0,1 0,1
Saliva diluda em tampo imidazol 0,1 0,1 0,1 0,1
Soluo de iodo/iodeto 5,0 - - -

d. Levar os tubos 2, 3 e 4 ao banho-maria a 37 C.

e. Incub-los durante 10 min (tubo 2); 20 min (tubo 3) e 30 min (tubo 4).
f. Aps cada tempo, adicionar 5 mL de soluo de iodo/iodeto de potssio em cada
tubo.
g. Calibrar o espectrofotmetro a 640 nm (filtro vermelho) com um tubo contendo
5 mL de soluo de iodo/iodeto de potssio, 0,1 mL de tampo inidazol e 0,1
mL de saliva diluda em tampo imidazol (tubo branco).
h. Proceder a leitura das absorbncias dos demais tubos.
i. Traar o grfico: tempo de incubao (minutos) X absorbncia. Interpretar.
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AULA PRTICA BIOQUMICA 7

METABOLISMO - GLICLISE E FERMENTAO EM LEVEDURAS

Curva padro da glicose pelo mtodo do cido dinitro-saliclico

(DNS)

Reagentes
cido dinitro-saliclico (DNS) 1%: em um recipiente, misturar 1 g de DNS
em 30 ml de gua destilada. Num outro recipiente dissolver 30 g de tartarato de
sdio e potssio em 20 ml de hidrxido de sdio 2 N. Colocar os dois recipientes
em banho-maria 56C, at completa dissoluo. Misturar ambas solues e
completar o volume para 100 ml com gua destilada.

Glicose 2,5 mM

Tampo fosfato 0,1 M, pH 7,0

Leveduras 1,5% (em tampo fosfato 0,1 M pH 7,0)
Glicose 24 mM
Fluoreto de sdio 1,5 M

Curva de calibrao

Preparar uma curva de calibrao considerando que o volume final, de

cada tubo, de 1,0 ml e a concentrao do padro de glicose de 2,5 mM. Em cada
tubo acrescentar 0,5 ml da soluo de DNS. Colocar em banho-maria fervente por 5
minutos. Adicionar 5,0 ml de gua destilada em cada tubo. Ler no espectrofotmetro
em = 540 nm, contra o tubo branco. Traar um grfico de absorbncia versus
concentrao. Calcular o fator de calibrao.

Tubo Glicose 2,5 gua Concentrao DNS Absorbncia

mM - (ml) (ml) (mM) (ml)

1 0,1 0,9 0,25 0,5

2 0,2 0,8 0,50 0,5
3 0,3 0,7 0,75 0,5
4 0,4 0,6 1,00 0,5
5 0,5 0,5 1,25 0,5
6 0,6 0,4 1,50 0,5
7 0,7 0,3 1,75 0,5
8 0,8 0,2 2,00 0,5
9 0,9 0,1 2,25 0,5
10 1,0 ----- 2,50 0,5
Branco ---- 1,0 ------ 0,5
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2. Acompanhamento do consumo de glicose

Tcnica

Ao do fluoreto: em um erlenmeyer de 50 ml, colocar 10 ml de

leveduras 1,5%, 4 ml de fluoreto de sdio 1 M e 10 ml da soluo de glicose 24
mM.
Controle: em um segundo erlenmeyer, colocar 10 ml de leveduras 1,5%,
4 ml de gua destilada e 10 ml de glicose 24 mM.

Incubar, a 37C, sob agitao. Retirar alquotas de 0,1 ml dos dois

erlenmeyers, nos tempos 0, 20, 40 e 60 minutos e coloc-las em tubos de ensaio.
Acrescentar, em cada tubo, 0,9 ml de gua destilada e 0,5 ml de DNS. Colocar em
banho-maria fervente por 5 minutos. Acrescentar 5,0 ml de gua destilada em cada
tubo e transferir o contedo dos mesmos para tubos de centrfuga. Centrifugar por 5
minutos a 3.000 rpm. Cuidadosamente, transferir parte do sobrenadante para cubeta
e proceder a leitura em 540 nm.

Branco: preparar um tubo branco contendo 1,0 ml de leveduras 1,5%,

1,0 ml de tampo fosfato 0,1 M pH 7,0 e 0,4 ml de gua. A partir desta mistura,
retirar uma alquota de 0,1 ml e transferir para um outro tubo de ensaio. Acrescentar
0,9 ml de gua destilada e 0,5 ml de DNS. Coloc-lo em banho-maria fervente por 5
minutos. Acrescentar 5,0 ml de gua destilada e proceder a leitura em 540 nm.

Determinar a concentrao de glicose a partir do fator de calibrao

(FC).
Construir grficos de concentrao de glicose em funo do tempo para
as condies experimentais.
Interpretar os resultados.