Universidad Nacional Autnoma de

Mxico

Facultad De Estudios Superiores Cuautitln

Qumica Industrial

Laboratorio de Cintica Qumica

INFORME DE TRABAJO:
DETERMINACIN CUANTITATIVA DE LA
ACTIVIDAD ENZIMTICA DE UN PREPARADO
ENZIMTICO
INTRODUCCIN

Como es sabido, las enzimas son protena. Polmeros de residuos aminoacdicos

unidos mediante enlaces peptdicos, que tiene la funcin de ser catalizadores de
las reacciones qumicas del metabolismo celular. La produccin de enzimas, de
actividades especficas, es seguida por una purificacin y estandarizacin del
producto. en la formulacin del producto se agregan diversos excipientes. Por lo
que un preparado enzimatico comercial no es 100% puro.La manera de
cuantificar la enzima precente en una formulacion comercial se realizan
determinaciones de su actividad enzimatica y del contenido de proteinas.

La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones qumicas que son

catalizadas por las enzimas. El estudio de la cintica y de la dinmica qumica de
una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo cataltico, su papel en
el metabolismo, cmo es controlada su actividad en la clula y cmo puede ser
inhibida su actividad por frmacos o venenos o potenciada por otro tipo de
molculas.
Las enzimas, en su mayora, protenas con la capacidad de manipular otras
molculas, denominadas sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al sitio activo
de la enzima que lo reconozca y transformarse en un producto a lo largo de una
serie de pasos denominados mecanismo enzimtico. Algunas enzimas pueden
unir varios sustratos diferentes y/o liberar diversos productos, como es el caso de
las proteasas al romper una protena en dos polipptidos.
Efecto del pH sobre la actividad enzimtica: El pH no afecta la actividad
enzimtica directamente sino que modifica la concentracin de protones.Los
protones adems de alterar la estructura de la enzima y del substrato,pueden
participar tambin en la reaccin como substrato o producto. En esos casos,la
concentracin de protones afecta directamente la velocidad de reaccin.Cualquier
cambio brusco de pH,sabiendo que las enzimas son protenas,pueden alterar el
carcter inico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando
as las propiedades catalticas de una enzima. A pH alto o bajo se puede producir
la desnaturalizacin de la enzima y en consecuencia su inactivacin.

Determinacin de la actividad enzimtica.

indica el mximo potencial cataltico de una enzima y esta dado por la
velocidad inicial de la reaccin.
la velocidad de reaccin se mide, cuantificando la evolucin de producto o
sustrato de reaccin en el tiempo.
Se determina en las mejores condiciones para la enzima( temperatura y pH
ptimo) y a concentraciones saturantes de sustrato.
la medicin de actividad se ve afectada por los siguientes factores:
- Denaturacin de la enzima(por temperatura)
- reversibilidad de la reaccin enzimtica
- inhibicin de la enzima
- desaturacin de la enzima( baja concentracin del sustrato)
 para evitar los tres primeros factores,la medicin se realiza a tiempos
cortos; el ltimo factor evita utilizar una concentracin saturante de sustrato.
Al evitar tales problemas la velocidad de reaccin slo est condicionada
por la cantidad de enzima utilizada en la reaccin.

OBJETIVOS
Identificar a partir de un Preparado Enzimtico Crudo de Papaya, la
actividad enzimtica de la amilasa a partir de una tcnica
espectrofotomtrica.
Explicar el efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de una
reaccin enzimtica.
Calcular por mtodos grficos la velocidad mxima de una reaccin
enzimtica.

DIAGRAMA EXPERIMENTAL

RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS

SESIN EXPERIMENTAL 1:

Tabla 1.0 Resultados experimentales de Absorbancia en funcin del tiempo de

degradacin del almidn por la enzima amilasa
t(s) Abs t(s) Abs

5 0.507 120 0.332

10 0.496 150 0.303

20 0.472 180 0.28

25 0.461 210 0.262

30 0.452 240 0.251

35 0.441 270 0.268

40 0.432 300 0.256

50 0.418 330 0.255

60 0.405 360 0.246

90 0.367

E+S ES P + S

[ Almidn ] = 0.35g / 50 ml
[ Almidn] = 0.7%

La cintica de degradacin del almidn a causa de la enzima amilasa presente en la

papaya result ser de orden 2, debido al coeficiente de correlacin, obteniendo de esta
manera una constante especfica de velocidad de 0.0064 g/100 mL seg que es el
equivalente a la actividad enzimtica de la amilasa.
 Tabla 1.1 Concentraciones de los sistemas blanco y problema

TUBOS SUSTRATO AGUA SOLUCIN ENZIMA HCl VOLUMEN |S|

(ALMIDON) DESTILADA YODADA mL 0.1N FINAL
mL mL mL mL mL

BLANCO 0 2.9 0.5 0.1 2.5 6 0

MUESTRA 2.5 0.4 0.5 0.1 2.5 6 0.3

1

Se calcul la concentracin de almidn residual a partir de las absorbancias

obtenidas experimentalmente, haciendo uso de la Ley de Lamber-Beer.
A = . C. I
Aplicando esta ecuacin a las absorbancias obtenidas, teniendo en cuenta que I = 1 cm y
= 7.22 mM-1 cm-1, se obtiene la concentracin de almidn que no ha sido degradado por
la enzima en el tubo problema.

Tabla 1.2 Concentracin residual de almidn en funcin de la Absorbancia

medida a travs del tiempo

t(s) Abs |S| t(s) Abs |S| (mM)

5 0.507 0.07022161 120 0.332 0.04598338

10 0.496 0.06869806 150 0.303 0.04196676

20 0.472 0.06537396 180 0.28 0.04196676

25 0.461 0.06385042 210 0.262 0.03628809

30 0.452 0.06260388 240 0.251 0.03476454

35 0.441 0.06108033 270 0.268 0.03711911

40 0.432 0.0598338 300 0.256 0.03545706

50 0.418 0.05789474 330 0.255 0.03531856

60 0.405 0.05609418 360 0.246 0.03407202

90 0.367 0.05083102
A continuacin se calcula la velocidad de la reaccin (mM/seg) que es la concentracin de
almidn residual entre el tiempo de incubacin: V = [S]/ t

Tabla 1.3 Velocidad de reaccin en funcin del almidn residual

t(s) V t(s) |S| V
|S| (mM/seg) (mM/seg)
5 0.07022161 0.00019506 120 0.04598338 0.00012773

10 0.06869806 0.00019083 150 0.04196676 0.00011657

20 0.06537396 0.00018159 180 0.04196676 0.00011657

25 0.06385042 0.00017736 210 0.03628809 0.0001008

30 0.06260388 0.0001739 240 0.03476454 9.6568E-05

35 0.06108033 0.00016967 270 0.03711911 0.00010311

40 0.0598338 0.0001662 300 0.03545706 9.8492E-05

50 0.05789474 0.00016082 330 0.03531856 9.8107E-05

60 0.05609418 0.00015582 360 0.03407202 9.4645E-05

90 0.05083102 0.0001412
Donde:
Vmax= 0.00019506
Vmax= 9.753x10-5
Interpolando:
Km= 0.0348 mM

SESIN EXPERIMENTAL 3:

Tabla 2.0 Resultados experimentales de Absorbancia en funcin del tiempo de

degradacin del almidn por la enzima amilasa a 30C
t(s) Abs t(s) Abs

5 0.64 120 0.551

10 0.636 150 0.554

20 0.632 180 0.525

25 0.626 210 0.512

30 0.618 240 0.496

35 0.613 270 0.484

40 0.608 300 0.474

50 0.602

60 0.594

90 0.570
La cintica de degradacin del almidn a causa de la enzima amilasa presente en la
papaya a una temperatura de 30C result ser de orden 2, obteniendo una constante
especfica de velocidad de 0.0019s.

Se calcul la concentracin de almidn residual a partir de las absorbancias

obtenidas experimentalmente, haciendo uso de la Ley de Lamber-Beer.
A = . C. I
Aplicando esta ecuacin a las absorbancias obtenidas, teniendo en cuenta que I = 1 cm y
= 7.22 mM-1 cm-1, se obtiene la concentracin de almidn que no ha sido degradado por
la enzima en el tubo problema.

Tabla 2.2 Concentracin residual de almidn en funcin de la Absorbancia

medida a travs del tiempo
 t(s) Abs |S| t(s) Abs |S|

5 0.64 0.0886 120 0.551 0.0763

10 0.636 0.0880 150 0.554 0.0767

20 0.632 0.0875 180 0.525 0.0727

25 0.626 0.0867 210 0.512 0.0709

30 0.618 0.0855 240 0.496 0.0686

35 0.613 0.0849 270 0.484 0.0670

40 0.608 0.0842 300 0.474 0.0656

50 0.602 0.0833

60 0.594 0.0822

posteriormente se calcular la velocidad de la reaccin (mM/seg) que es la

concentracin de almidn residual entre el tiempo de incubacin: V = [S]/ t

Tabla 1.3 Velocidad de reaccin en funcin del almidn residual

t(s) |S| V (mM/seg) t(s) |S| V (mM/seg)

 5 0.0886 0.000295 120 0.0763 0.000254

10 0.0880 0.000293 150 0.0767 0.000255

20 0.0875 0.000291 180 0.0727 0.000242

25 0.0867 0.000289 210 0.0709 0.000236

30 0.0855 0.000285 240 0.0686 0.000228

35 0.0849 0.000283 270 0.0670 0.000223

40 0.0842 0.000280 300 0.0656 0.000218

50 0.0833 0.000277

60 0.0822 0.000274

Donde:
Vmax= 0.000295
Vmax= 1.475x10-4
Interpolando:
Km= 0.044025mM

SESIN EXPERIMENTAL 4:

Tabla 3.0 Resultados experimentales de Absorbancia en funcin del tiempo de

degradacin del almidn por la enzima amilasa a pH=7
t(s) Abs t(s) Abs
 5 0.256 120 0.085

10 0.245 150 0.073

20 0.236 180 0.059

25 0.227 210 0.048

30 0.214 240 0.036

35 0.177 270 0.025

40 0.156

50 0.132

60 0.108

90 0.098

La cintica de degradacin del almidn a causa de la enzima amilasa presente en la

papaya a un pH=7 result ser de orden 1, obteniendo una constante especfica de
velocidad de 0.0082s.

Tabla 3.2 Concentracin residual de almidn en funcin de la Absorbancia medida a

travs del tiempo a un pH= 7

t(s) Abs |S| t(s) Abs |S|

5 0.256 0.03545706 60 0.108 0.01495845

10 0.245 0.03393352 90 0.098 0.01357341

20 0.236 0.03268698 120 0.085 0.01177285

 25 0.227 0.03144044 150 0.073 0.0101108

30 0.214 0.02963989 180 0.059 0.00817175

35 0.177 0.02451524 210 0.048 0.0066482

40 0.156 0.02160665 240 0.036 0.00498615

50 0.132 0.01828255 270 0.025 0.0034626

Tabla 3.3 Velocidad de reaccin en funcin del almidn residual a pH=7

t(s) |S| V (mM/seg) t(s) |S| V (mM/seg)

5 0.03545706 0.00013132 60 0.01495845 5.5402E-05

10 0.03393352 0.00012568 90 0.01357341 5.0272E-05

20 0.03268698 0.00012106 120 0.01177285 4.3603E-05

25 0.03144044 0.00011645 150 0.0101108 3.7447E-05

30 0.02963989 0.00010978 180 0.00817175 3.0266E-05

35 0.02451524 9.0797E-05 210 0.0066482 2.4623E-05

40 0.02160665 8.0025E-05 240 0.00498615 1.8467E-05

50 0.01828255 6.7713E-05 270 0.0034626 1.2824E-05

Donde:
Vmax= 0.00013132
Vmax= 6.566x10-5
Interpolando:
Km= 0.0177 mM

Tabla 3.1 Resultados experimentales de Absorbancia en funcin del tiempo de

degradacin del almidn por la enzima amilasa a pH=6
t(s) Abs t(s) Abs

5 1.738 120 1.11

10 1.569 150 1.089

20 1.51 180 0.93

25 1.324 210 0.859

30 1.301 240 0.769

35 1.194 270 0.756

40 1.176

50 1.151

60 1.145

90 1.128
La cintica de degradacin del almidn a causa de la enzima amilasa presente en la
papaya a un pH=6 result ser de orden 1, obteniendo una constante especfica de
velocidad de 0.0025s.

Tabla 3.1 Concentracin residual de almidn en funcin de la Absorbancia medida

a travs del tiempo a un pH= 6

t(s) Abs |S| t(s) Abs |S|

5 0.64 0.08864266 60 0.594 0.08227147

10 0.636 0.08808864 90 0.57 0.07894737

20 0.632 0.08753463 120 0.551 0.07631579

25 0.626 0.0867036 150 0.554 0.0767313

30 0.618 0.08559557 180 0.525 0.07271468

35 0.613 0.08490305 210 0.512 0.07091413

40 0.608 0.08421053 240 0.496 0.06869806

50 0.602 0.0833795 270 0.484 0.06703601

 Tabla 3.3 Velocidad de reaccin en funcin del almidn residual

t(s) |S| V (mM/seg) t(s) |S| V (mM/seg)

5 0.24072022 0.00089156 60 0.15858726 0.00058736

10 0.21731302 0.00080486 90 0.15623269 0.00057864

20 0.20914127 0.0007746 120 0.15373961 0.00056941

25 0.1833795 0.00067918 150 0.15083102 0.00055863

30 0.18019391 0.00066738 180 0.12880886 0.00047707

35 0.16537396 0.0006125 210 0.11897507 0.00044065

40 0.16288089 0.00060326 240 0.1065097 0.00039448

50 0.15941828 0.00059044 270 0.10470914 0.00038781

Donde:
Vmax= 0.00089156
Vmax= 4.4578x10-4
Interpolando:
Km= 0.1204 mM

CONCLUSIONES

Cumplimos los objetivos planteados pues identificamos la actividad enzimtica de la

amilasa a partir de una tcnica espectrofotomtrica, como sabemos la espectrofotometra
es la medida de la cantidad de energa radiante absorbida por las molculas de una
muestra en funcin de las longitudes de onda especficas, para lograr esto nosotros
usamos almidn, y como sabemos amilosa tiene una forma helicoidal a la que al agregar
la solucin de yodo /yoduro crea un complejo azul con el yodo molecular, tomando en
cuenta esto en la grfica 1.0 nos mostr una lnea que va en declive, esto debido a que
la concentracin de almidn fue degrada por la enzima (papana) hasta que la
concentracin de almidn se mantuvo constante.
El segundo objetivo fue cubierto pues representamos en una grfica a V0 frente a una
concentracin de sustrato [S]0 y pudimos observar que cuando [S]0 es pequea la
velocidad inicial es directamente proporcional a la concentracin del sustrato y por tanto la
reaccin es de primer orden , se puede decir entonces que la enzima se encuentra
saturada por el sustrato y la velocidad y no depende de [S]0 , en este punto la reaccin es
de orden cero y la velocidad es mxima., cabe mencionar que el orden de la reaccin
vara dependiendo de la condiciones en las que nos encontremos como lo son pH y
temperatura, por ejemplo obtuvimos una reaccin de segundo orden en la primera parte
de nuestra experimentacin pues la velocidad de degradacin del sustrato y la formacin
del producto dependi de la concentracin al cuadrado del nico sustrato.

Para cumplir el tercer objetivo realizamos grficas pudimos calcular la velocidad mxima
de la enzima , para conocer la velocidad mxima una enzima debe estar siempre en
las condiciones ptimas de pH, temperatura y usar concentraciones saturantes de
sustrato. En estas condiciones la velocidad de reaccin observada es la velocidad
mxima.