You are on page 1of 38

MANUAL DE PRA CTICAS DE

MICROBIOLOGIA GENERAL

Q.C. CLAUDIA ARRONTE


M.C. ANA ROSA CASTILLO GUERRERO

UNIVERSIDAD VERACRUZANA

ODONTOLOGACAMPUS XALAPA
FACULTAD DE
La Microbiologa es una ciencia relativamente reciente con respecto a otras ramas de la
Biologa. El estudio de los microorganismos se inici a partir de que Anton van
Leewenhoek en 1670 invent el microscopio y que a partir de los estudios de Louis Pasteur
en 1876, se logr el mayor desarrollo y reconocimiento de los microorganismos como
actores de una diversidad de procesos.
Aunque durante mucho tiempo estos organismos causaron graves problemas de
enfermedades en plantas, animales y humanos, tambin es cierto que desde la antigedad
algunas especies microbianas han sido utilizadas en procesos de produccin de alimentos
fermentados como quesos, vino, pan y cerveza, entre otros y actualmente se ha
reconocido su importancia en diversas reas de investigacin bsica, en la industria
alimentaria, ambiental y farmacutica.
El objetivo general del curso prctico de Microbiologa General es que el alumno se
inicie con el conocimiento de la biologa bsica de los microorganismos, en sus
caractersticas morfolgicas, nutricionales, de crecimiento, control y que adquiera las
habilidades necesarias para su manipulacin en el laboratorio.
Este manual est dirigido a estudiantes que iniciarn su experiencia en el manejo
de los microorganismos, por lo que consideramos de gran importancia incluir al principio
del mismo una serie de recomendaciones relacionadas con las reglas generales del
laboratorio y los principales procedimientos que el estudiante deber aprender, para que
manipule en forma adecuada a los microorganismos y garantizar tanto su seguridad como
la de sus compaeros.
Este manual contiene 10 prcticas, diseadas para que el estudiante se familiarice
gradualmente con los procedimientos de cultivo y observacin de microorganismos.
En cada prctica se presentan los objetivos y una breve introduccin para facilitar la
comprensin de los mismos, despus se indican los materiales necesarios y
procedimientos a realizarse en forma de instrucciones numeradas que se complementan
con figuras y esquemas.
Posteriormente en cada prctica se proponen formas de presentacin de los
resultados en cuadros, para que el alumno recopile sus observaciones. Tambin se
incluyen preguntas en forma de cuestionario que el estudiante deber resolver
consultando los materiales bibliogrficos sugeridos al final de este manual.
REGLAS DE LABORATORIO
NORMAS GENERALES PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

1. Siempre deber usar bata de algodn, de manga larga, abotonada, que deber quitarse
antes de abandonar el laboratorio

2. Se prohibe fumar, aplicarse cosmticos o tocarse la cara con las manos o algn otro
objeto. Se deber lavar meticulosamente las manos con agua y jabn antes de salir del
laboratorio.
3. Evitar la acumulacin sobre la mesa de trabajo de objetos no relacionados con la prctica
de laboratorio. Colocar todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la zona
especificada por el acadmico.
4. No se admiten visitas personales que distraigan la atencin y pongan en riesgo la seguridad
en el trabajo que se realiza.
5. Limpiar su sector de mesa , antes y despus de trabajar , con un algodn embebido en
solucin desinfectante. Para ello se puede emplear bicloruro de mercurio, solucin de
formol al 5-10%, alcohol 70 grados, etc. (no corrosivas para la piel).
6. Tener siempre a mano sobre la mesa: a) un vaso de precipitado o similar llena con solucin
desinfectante para introducir las pipetas luego de ser utilizadas; b) un recipiente para
colocar el material contaminado o sucio; c) mechero.
7. Tener en cuenta que el cultivo con el que se trabaja puede ser patgeno, razn por la cual
hay que manejarlo siempre como si lo fuera.
8. Al recibir el cultivo NO LO DESTAPE, tome el tubo por su parte media apoyado sobre la
palma de la mano de manera de ver fcilmente el contenido y la inscripcin que lo
identifica.
9. En caso de producirse un incendio o una herida personal, el alumno deber notificarlo
inmediatamante al acadmico. En el caso de derrame de cultivos o rotura de recipientes
con cultivos activos, deber conservar la calma y adems de informar al acadmico, seguir
inmediatamente el procedimiento:
A)Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersin.
B)Poner abundante solucin desinfectante sobre las toallas.
C)Dejar transcurrir por lo menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el recipiente
destinado a la eliminacin de materiales contaminados.
10. En caso de heridas por accidentes durante el manipuleo del material infectado, debe
prevenirse la posibilidad de infeccin. Comunique el hecho al personal de la ctedra.
11. Realice las tcnicas bacteriolgicas al abrigo de las corrientes de aire, con movimientos
pausados, poco amplios y sin brusquedad. Evite hablar mientras realiza maniobras
microbiolgicas a fin de evitar que se contaminen los cultivos.
12. Debe siempre llevarse el asa al rojo antes y despus de toda operacin que se realice con
ella.
13. No deben depositarse los tapones sobre la mesa, para evitar contaminaciones de y con los
cultivos de trabajo.
14. Los tubos con medio de cultivo, ya sean lquidos o slidos, sembrados o no, deben
colocarse siempre sobre una gradilla y nunca sobre la mesa.
15. Los cultivos de descarte deben colocarse siempre en recipientes adecuados para luego ser
esterilizados.
16. Tanto las placas como los tubos deben ser identificados con marcas o rtulos.
17. Los papeles de envoltura de material de vidrio deben arrojarse en los cestos destinados a
tal fin.
18. No deber pipetear oralmente ningn tipo de cultivo microbiano; esta actividad se
realizar con pipetas automticas o accionadas de forma mecnica, tratando de evitar la
formacin de aerosoles.
19. 16. Anotar concisamente todo lo nuevo que se observe en cada experiencia, completando
con dibujos.
20. Al abandonar el laboratorio, debe controlar que los mecheros y llaves de gas, agua, as
como las luces .
21. REQUIERA LA PRESENCIA DEL DOCENTE PARA QUE LO ASESORE CORRECTAMENTE TODA
VEZ QUE TENGA DUDAS SOBRE LA REALIZACIN DE UNA TCNICA.

MATERIALES INDISPENSABLES EN CADA SESIN DE LABORATORIO

1. Bata de laboratorio limpia, de manga larga, con botones.

2. El protocolo de la prctica y la bitcora de laboratorio.


3. Un pedazo de tela sin pelusa, cerillos, tijeras, maskin tape, marcador indeleble o
etiquetas pequeas.
4. Lentes de seguridad.
5. Jabn y toalla individual.
Contenido

REGLAS DE LABORATORIO..............................................................................................................2
NORMAS GENERALES PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO DE MICROBIOLOGA......................2
MATERIALES INDISPENSABLES EN CADA SESIN DE LABORATORIO...............................................3
PRCTICA # 1..................................................................................................................................6
MICROSCOPA................................................................................................................................6
OBJETIVO....................................................................................................................................6
INTRODUCCIN..........................................................................................................................6
EL MICROSCOPIO........................................................................................................................6
MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO............................................................................................7
MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES..........................................................................................8
ACTIVIDADES..............................................................................................................................9
PRCTICA # 2................................................................................................................................10
TCNICAS DE TINCIN..................................................................................................................10
OBJETIVO..................................................................................................................................10
GENERALIDADES.......................................................................................................................10
TINCIN DE BACTERIAS............................................................................................................10
TIPOS DE TINCIN....................................................................................................................10
TINCIN SIMPLE.......................................................................................................................11
TINCIN NEGATIVA...................................................................................................................11
TINCIN DE GRAM...................................................................................................................12
TINCIN DE ESPORAS...............................................................................................................13
PRACTICA # 3................................................................................................................................17
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO........................................................................................17
OBJETIVO..................................................................................................................................17
GENERALIDADES.......................................................................................................................17
CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO...........................................................................17
MEDIOS DE CULTIVO DESHIDRATADOS.....................................................................................18
PRCTICA # 4................................................................................................................................20
MORFOLOGA DE LAS COLONIAS BACTERIANAS...........................................................................20
OBJETIVO..................................................................................................................................20
GENERALIDADES.......................................................................................................................20
PRCTICA # 5................................................................................................................................25
PRUEBAS BIOQUMICAS...............................................................................................................25
OBJETIVO......................................................................................................................................25
GENERALIDADES...........................................................................................................................25
Caldos de carbohidratos con indicador de pH..............................................................................25
Agar de hierro y triple azcar (TSI)...............................................................................................26
Agar de hierro y lisina (LIA)...........................................................................................................26
Prueba del citrato de Simmons....................................................................................................27
Prueba de la ureasa......................................................................................................................27
Medio MIO (Movilidad, Indol y Ornitina).....................................................................................27
MATERIAL Y EQUIPO.....................................................................................................................28
TCNICA.......................................................................................................................................28
PRESENTACON DE RESULTADOS..................................................................................................29
PRCTICA # 6................................................................................................................................30
CONTROL BACTERIANO POR MEDIO DE AGENTES FSICOS Y QUMICOS......................................30
OBJETIVO..................................................................................................................................30
GENERALIDADES.......................................................................................................................30
RADIACIN ULTRAVIOLETA.......................................................................................................30
TEMPERATURA.........................................................................................................................30
DESINFECTANTES......................................................................................................................31
PRCTICA # 7................................................................................................................................35
OBSERVACIN EN FRESCO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS BUCALES...................................35
OBJETIVO..................................................................................................................................35
GENERALIDADES.......................................................................................................................35
PRCTICA # 1

MICROSCOPA

OBJETIVO
Conocer las partes y funcionamiento de un microscopio as como tomar conocimiento del
cuidado, manejo y utilidad de un microscopio en el Laboratorio de Microbiologa.
INTRODUCCIN
Casi la totalidad de los organismos unicelulares son imperceptibles para el ojo humano, y
para observarlos es esencial el microscopio. El uso de este dispositivo es indispensable en
el Laboratorio de Microbiologa para el estudio de la morfologa y estructura de los
microorganismos, as como su reaccin a diferentes colorantes, lo cual junto con otros
criterios, permitir su identificacin, por lo tanto, es importante conocer su adecuado
manejo.
Adems de la ampliacin de la imagen, en microscopa, hay que tener en cuenta dos
factores ms: el contraste y la resolucin. Los objetos deben poseer un cierto grado de
contraste con su medio circundante para poder ser percibidos a travs del microscopio.
Por ello es que la mayora de los organismos necesitan ser previamente teidos para poder
distinguirlos del medio (tinciones simples). Para contrastar o realzar de forma especfica
distintas caractersticas morfolgicas o estructurales se emplean tinciones diferenciales.
Estas tcnicas tienen un gran inters en la identificacin y clasificacin de las bacterias. La
tincin diferencial ms utilizada es la tincin de Gram. Otras tinciones de gran importancia
son las que diferencian bacterias cido- alcohol resistentes, las que diferencian
estructuras significativas como las esporas o la tincin negativa de cpsulas.
Por otra parte, el grado de resolucin (la capacidad para ver separados dos objetos
adyacentes muy prximos entre s), depende de las caractersticas del sistema de lentes
que posea el microscopio. ste se encuentra limitado por la longitud de onda de la luz
emitida, el ndice de
refraccin del medio en
el que se realiza la
visualizacin y la
apertura numrica del
objetivo.

EL MICROSCOPIO
El microscopio compuesto es aquel que dispone de dos o ms lentes de aumento. Un
microscopio se divide en dos partes: el soporte y el sistema ptico.

1) Soporte. Es la pieza fija en la que slo la platina y el condensador tienen un cierto


movimiento. Sus principales partes son:

a) Base. Normalmente alberga la fuente de iluminacin, en determinados modelos


incorpora adems, un sistema portafiltros con varios filtros y un diafragma de campo
luminoso.

b) Brazo. Soporta todo el sistema ptico, el cabezal portaoculares y el revlver


portaobjetivos. En l se dispone tambin un sistema de anclaje de la platina (movimiento
de enfocado de la preparacin).

c) Platina. Es la pieza donde se coloca la preparacin microscpica para su observacin.

d) Los tornillos macromtrico y micromtrico. Ambos permiten enfocar la preparacin. El


primero se emplea para un enfoque rpido cuando se trabaja con objetivo de menor
aumento (10x), mientras que el segundo permite fijar el enfoque cuando se utilizan los
objetivos de mayor aumento (40x, 100x).

2) Sistema ptico. Est formado por un cuerpo tubular donde se instalan las lentes: los
oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto.

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO

1) Compruebe que las lentes del ocular y de los objetivos estn limpias: de no ser as,
lmpielas cuidadosamente con papel especial para ptica. No tocar las lentes con los
dedos.

2) Coloque la preparacin (sin cubreobjetos y con la muestra en la parte superior) sobre la


platina sujetndola con el dispositivo mvil. Compruebe previamente, que el objetivo de
menor aumento est en posicin de empleo.

3) Para bacteriologa, iluminar la preparacin bajando el condensador (ms contraste), y


con el diafragma abierto.

4) Ajuste los binoculares a la distancia interpupilar y ajuste el foco de cada ocular si el


microscopio lo permite.

5) Coloque el objetivo de 10 aumentos (x10) y enfocar:

a) Acerque al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando para ello el


macromtrico. No realizar dicha operacin mirando por el ocular, pues correra el riesgo
de clavar el objetivo en la preparacin con el consiguiente destrozo de ambos.
b) Enfoque con el micromtrico observando por el ocular hasta obtener un enfoque
ntido

6) Pase al objetivo de 40 aumentos (40x). Suba ligeramente el condensador. La imagen


debe estar casi enfocada, afine el foco con el micromtrico. Si la imagen no est ni
medianamente enfocada, es preferible volver a un enfoque con el objetivo de 10x. El
objetivo de 40x trabaja muy cerca de la preparacin y por ello es susceptible de dos tipos
de accidentes: ser clavado en la preparacin y resultar manchado con aceite de
inmersin si se observa la preparacin ya usada con ste ltimo.

7) Empleo del objetivo de inmersin:

a) Gire el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y
el objetivo de 40x

b) Coloque una gota de aceite de inmersin sobre el punto de la luz.

c) Termine de girar el revlver hasta la posicin del objeto de inmersin, asegurndose


de que ste no toca la preparacin, pero s la gota de aceite.

d) Enfoque cuidadosamente con el micromtrico. Recuerde que la distancia entre el


objetivo y la preparacin es mnima.

e) Una vez que ya ha puesto aceite de inmersin sobre la preparacin ya no puede


volverse a colocar los objetivos de 10x y de 40x sobre ese campo. Por lo tanto, si desea
enfocar otro campo, debe retirar el objetivo de inmersin girando el revlver hacia el
objetivo de menor aumento (10x), seleccionando otro campo y empezando a enfocar
desde ste ltimo.

f) Finalizada la observacin de una preparacin, y antes de retirarla de la platina, se


colocar el objetivo de menor aumento girando el revlver en el sentido hacia la lupa.
Nunca retire la preparacin con el objetivo de inmersin en posicin de observacin.

g) Retire la preparacin y limpie el objetivo de inmersin cuidadosamente con un papel


especial para ptica. Compruebe tambin que el objetivo de 40x est limpio.
MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES

1) No se deben tocar nunca las lentes con las manos, sino con pauelos especiales para
lente.

2) No dejar nunca una preparacin sobre la platina cuando no est usando el microscopio.

3) Para cambiar el objetivo, utilice siempre el revlver.

4) Despus de utilizar el objetivo de inmersin lmpielo. En caso de que el aceite se haya


secado, avise al docente para limpiarlo con xilol.
5) No fuerce nunca los dispositivos giratorios del microscopio (macro y micromtricos,
platina, revlver y condensador).

6) No cambie nunca de objetivo mientras est observando a travs del ocular.

7) Cuando finalice el trabajo ponga el objetivo de menor aumento en posicin de


observacin.

8) Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesin de


prctica.
ACTIVIDADES
1) Siguiendo las indicaciones para el manejo del microscopio:
a) Observar un examen en fresco de microorganismos
b) Observar preparaciones coloreadas suministradas por el catedrtico.
2) Dibujar lo observado

Examen en Fresco Preparacin Coloreada


PRCTICA # 2

TCNICAS DE TINCIN

OBJETIVO
El alumno aprender y aplicar las tcnicas bsicas de tincin ms frecuentes.
GENERALIDADES
La coloracin es el proceso de teir artificialmente los microorganismos con
colorantes o reactivos para facilitar su estudio microscpico forma, agrupacin y
estructuras)
Un colorante es un compuesto orgnico que consta de anillos bencnicos y grupos
cromforos (agrupacin de tomos que da color a ciertos compuestos) y auxocromos
(sustituyentes como el grupo oxidrilo o el amino que mejoran las caractersticas de
absorcin del cromforo).
En el laboratorio de microbiologa se pueden usar los colorantes de varias formas
como:
a) Para teir bacterias y hacerlas visibles al microscopio
b) Para mostrar estructuras del organismo estudiado.
c) Para la identificacin de microorganismos en base a sus caractersticas de tincin,
por ejemplo, si son o no alcohol-cido resistentes, si son Gram positivas o Gram
negativas.
d) En los medios de cultivo para inhibir el desarrollo de algunas bacterias y as poder
estudiar selectivamente a los microorganismos que si crecen.
TINCIN DE BACTERIAS
La clula bacteriana intacta se tie fcilmente con colorantes bsicos como el
cristal, azul de metileno y fucsina bsica, pero relativamente mal con colorantes cidos
como la eosina.
Un colorante bsico es aquel constituido por un agrupamiento de tomos orgnicos
con carga positiva que ser la parte activa del colorante ya que tendr afinidad por los
cidos nucleicos. Un colorante cido es aquel que se encuentra constituido por tomos
orgnicos con carga neta negativa por lo cual tiene afinidad por el citoplasma.
TIPOS DE TINCIN
1. Tincin simple. Conocida con ese nombre ya que solo nos sirve para hacer ms
fcilmente visibles a las bacterias sin resaltar ninguna caracterstica en especial.
Una tincin simple se lleva a cabo cubriendo con colorante bsico un frotis seco y
fijado al calor. El frotis se deja reaccionar con las clulas por un minuto y se lava
suavemente con agua. El frotis se puede dejar secar o usar papel secante para que
quede listo para observarse.
2. Tincin negativa. Este mtodo de tincin utiliza colorantes neutros o cidos ya que
tienen poca afinidad por la clula bacteriana por lo tanto como no se absorben se
colorea el fondo en el que estn las bacterias pero la clula queda incolora y
transparente, as pues las bacterias aparecen como pequeas reas iluminadas en
un fondo oscuro. La tincin acdica con nigrosina, o neutral ( con tinta china) son
las ms usadas.
3. Tincin diferencial. Las bacterias se diferencian unas de otras tanto fsica como
qumicamente, por lo cual su reaccin ante algunos colorantes tambin ser
diferente dando lugar as a grupos tintoreales caractersticos. Entre estos grupos
estn los que se originan por la tincin descubierta por Hans Christian Gram, esta
tincin divide a las bacterias en Gram positivas o Gram negativas lo cual no solo
sirve para diferenciarlas sino an para elegir la terapia adecuada en algunos casos.
Existen otras tinciones diferenciales de utilidad en microbiologa clnica como la de
Ziehl- Neelsen.
4. Tincin estructural. Existen diferentes tipos de colorantes que de acuerdo a su
afinidad se utilizan para teir y detectar ciertas estructuras de la clula bacteriana
como son las esporas, los flagelos y las cpsulas.
TINCIN SIMPLE
MATERIAL Y EQUIPO
2 portaobjetos
Asa bacteriolgica
Aceite de inmersin
Microscopio
Mechero
Azul de metileno de Leffler
Cepa de Escherichia coli, Staphylococcus aureus
TCNICA
1. Preparar un frotis de E. coli y se S. aureus de acuerdo a las indicaciones de la figura
1 y fijarlo al calor.
2. Cubrir el frotis con azul de metileno y dejar en reposo por un minuto.
3. Lavar con agua corriente suavemente y dejar secar.
4. Observar con el objetivo de inmersin.
TINCIN NEGATIVA
MATERIAL Y EQUIPO
4 portaobjetos
Asa bacteriolgica
Aceite de inmersin
Microscopio
Vaso de precipitado de 200 ml con fenol al 5%
Nigrosina o tinta china
Puente de tincin
Cepa de Klebsiella pneumoniae
TCNICA
1. Hacer una suspensin ligera en solucin salina de K. pneumoniae y mezclar una
gota de esta suspensin con una pequea gota de nigrosina o tinta china en el
borde central del portaobjetos.
2. Con el extremo de otro portaobjetos extender la gota a lo ancho del primer
portaobjetos. Prepare un frotis delgado y otro grueso.
3. Deje secar al aire. NO SE DEBE FIJAR AL CALOR.
4. Observe con el objetivo de inmersin.
TINCIN DE GRAM
MATERIAL Y EQUIPO
3 portaobjetos
Asa bacteriolgica
Aceite de inmersin
Microscopio
Mechero
Puente de tincin
Cepas de Gram negativos (Escherichia coli) y de Gram positivos (Staphylococcus
aureus).
Cristal violeta
Yodo de Gram
Etanol al 95%
Safranina

TCNICA
1. De acuerdo a la figura 1 preparar un frotis de E. coli, uno de S. aureus y uno con
una mezcla de ambos microorganismos.
2. Dejar secar y fijar al calor como se indica.
3. Teir con cristal violeta por un minuto.
4. Enjuagar con agua corriente suavemente y escurrir.
5. Cubrir el frotis con Yodo de Gram y dejar reposar por un minuto.
6. Enjuagar con agua corriente y escurrir
7. Decolorar con etanol al 95%. Para esto, incline el portaobjetos sobre la charola
de tincin y aada goteando el etanol, dejando que corra por todo el frotis.
Para un frotis delgado es suficiente con 10 a 20 segundos.
8. Detener la accin decolorante lavando con agua.
9. Contrastar con safranina por 20 a 30 segundos, enjuagar y dejar secar el frotis.
10. Examinar con el objetivo de inmersin.

TINCIN DE ESPORAS

MATERIAL Y EQUIPO
2 portaobjetos
Asa bacteriolgica
Aceite de inmersin
Microscopio
Mechero
Papel filtro
Lmpara de alcohol
Cepa de Bacillus subtilis
cido actico al 5%
Azul de metileno de Leffler

TNICA
1. Hacer un frotis, secar y fijar al calor como se describe en la figura 1.
2. Cubrir el frotis con fucsina fenicada y calentar con la lmpara de alcohol hasta
la emisin de vapores. Es importante que su puente de tincin est bien
nivelado para que la fucsina no se escurra y el frotis no se seque al calentar.
3. Dejar en reposo por 5 minutos
4. Lavar con agua corriente
5. Decolorar con cido actico al 5% hasta que el frotis tome un ligero color rosa
6. Lavar con agua corriente
7. Teir durante 3 minutos con azul de metileno de Leffler
8. Lavar nuevamente con agua corriente, dejar secar y observar con el objetivo de
inmersin

FIGURA 1
PREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO
PRESENTACIN DE RESULTADOS

1. Dibuje y coloree sus observaciones, indicando en cada caso:


a) Tipo de tincin
b) Nombre de la bacteria
c) Caracterstica observada
Reportar las observaciones de forma, agrupacin y tamao relativo de cada
uno de los microorganismos en el cuadro de resultados.
Comparar sus observaciones con las reportadas en la literatura.

Cuadro 2
Observaciones microscpicas de frotis de cultivos bacterianos

Tincin simple

Forma (cocos, bacilos,


etc.)

Agrupamiento de las
clulas (solos, pares,
cadenas, etc.)
Tincin negativa

Forma (cocos, bacilos,


etc.)

Agrupamiento de las
clulas (solos, pares,
cadenas, etc.)

Tincin simple Staphylococcus aureus Escherichia coli


Forma (cocos, bacilos,
etc.)

Agrupamiento de las
clulas (solos, pares,
cadenas, etc.)

Tincin simple Staphylococcus aureus Escherichia coli

Forma (cocos, bacilos,


etc.)

Agrupamiento de las
clulas (solos, pares,
cadenas, etc.)
PRACTICA # 3

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

OBJETIVO

El alumno aprender las tcnicas bsicas para preparar un medio de cultivo.

GENERALIDADES

Las bacterias al igual que otros microorganismos requieren para su crecimiento de una
fuente de energa exgena y nutriente esenciales tales como agua, carbn, nitrgeno,
minerales y factores de crecimiento, adems de las condiciones ambientales apropiadas
como son pH, temperatura, presin osmtica y oxgeno atmosfrico. Cuando las bacterias
se cultivan en el laboratorio tales requerimientos se llenan con los medios de cultivo los
cuales pueden ser de muy variados tipos de acuerdo al microorganismo que se desee
estudiar. Muchos materiales naturales como jugos, leche, vegetales y carnes pueden ser
usados como bases para medios de cultivo.

El medio de cultivo puede ser lquido como los caldos, semislido o slido dependiendo de
la consistencia que adquiere el medio lquido al agregar diferentes concentraciones de un
solidificante como el agar, que es un extracto de algas marinas. El agar no es utilizado
como nutriente por la mayora de las bacterias, as pues acta solamente como
solidificante. Se funde alrededor de 100 C y permanece lquido hasta que se enfra de 42
a 43C. La gelatina se puede usar tambin pero con el inconveniente de que funde a 25C y
puede ser hidrolizada por muchas bacterias.

CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Existen diversas clasificaciones de los medios de cultivo: se abocar a dos de uso prctico,
una de acuerdo a su composicin y la otra de acuerdo a su uso en el laboratorio:

A) Clasificacin de los medios de cultivo de acuerdo a su composicin:


+ Sintticos. Son aquellos medios preparados con alta pureza y en los cuales la
composicin se conoce en forma precisa. Su uso es muy definido, por ejemplo medios
para ensayo de vitaminas o para enriquecimiento.

+ No sintticos. Estos se preparan a partir de una gran variedad de productos crudos


como son extractos de carne, extractos de levaduras, hidrolizados proteicos (peptonas)
etc. y aunque se conoce cules son los ingredientes, estos pueden variar ligeramente, por
ejemplo el contenido de aminocidos entre la carne de un animal y otro.

B) Clasificacin de los medios de acuerdo a su uso en el laboratorio

~ Medios de cultivo de uso general. En este grupo se encuentran los medios qe contienen
los nutrientes bsicos y no contienen sustancias inhibitorias por lo que en ellos pueden
crecer una gran variedad de hetertrofos. Entre estos medios tenemos Agar de soya y
tripticasena, agar de Mller Hinton, agar nutritivo, etc.

~ Medios de cultivo diferencial. Este tipo de medios es usado para distinguir entre
diferentes tipos de bacterias. Usualmente contienen colorantes o indicadores de pH que
darn un color caracterstico a las colonias o viraran el color del medio de cultivo de
acuerdo al microorganismo que se trate.

Un medio puede ser diferencial y selectivo al mismo tiempo.

~ Medios de cultivo selectivos. Este es un medio nutritivo al que se le aaden productos


que actan como agentes inhibitorios, de tal manera que slo permiten el crecimiento de
cierto grupo de microorganismos. Se usan para aislar organismos particulares e inhibir el
crecimiento de los no deseados.

Entre los medios selectivos y diferenciales tenemos:

Agar de MacConkey el cual contiene una mezcla de sales biliares que inhiben a los
microorganismos Grampositivos, adems de lactosa y como indicador rojo de fenol para
distinguir las bacetrias que fermentan la lactosa de las que no lo hacen.

Agar EMB (Eosina azul de metileno) mediante el azul de metileno y la eosina inhibe los
organismos Grampositivos. Al mismo tiempo, al igual que el Agar de MacConkey, permite
diferenciar bacterias que fermentan la lactosa y/o a la sacarosa de las que no lo hacen.

El Agar de sal y manitol, por su alto contenido de NaCl (7.5%) inhibe a las bacterias que no
lo toleran, al mismo tiempo con el indicador rojo de fenol sirve para detectar la
fermentacin del manitol. Se utiliza para el aislamiento y diferenciacin del gnero
Staphylococcus.
MEDIOS DE CULTIVO DESHIDRATADOS

Hasta 1930 la preparacin de medios de cultivo requera de mucho tiempo ya que se deba
de partir de materiales crudos que se iban pesando individualmente y algunos se tenan
que preparar como las infusiones y extractos por mtodos muy tediosos. Sin embargo,
ahora se cuenta con medios de cultivo deshidratado que han simplificado mucho el
trabajo ya que solo hace falta leer las instrucciones en cada frasco, disolver la cantidad
necesaria en agua, ajustar el pH, dispensar en tubos y esterilizar.

DISOLUCIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Para disolver los medios de cultivo deshidratados se debe utilizar agua recin destilada o
desmineralizada con un pH lo ms cercano posible a 7.0. El recipiente que se utilice debe
ser de preferencia un matraz Erlenmeyer con una capacidad mayor al volumen de medio
que se va a preparar para que se pueda agitar fcilmente. Los medios que no contienen
agar se pueden disolver fcilmente en agua fra o con un ligero calentamiento, sin
embargo si el medio contiene agar o gelatina requerir de calentamiento.

AJUSTE DEL pH

Si se utiliza agua neutra y un medio deshidratado de buena calidad el pH del medio


usualmente quedar dentro de los lmites adecuados, an as es conveniente ajustar el pH
lo que se puede hacer con un potencimetro o en su defecto con papel pH 4.0-7.0.

Si el medio es slido la medicin y el eventual ajuste se hace a 45-50C ( an est liquido)


y en los medios lquidos se hace a temperatura ambiente. La correccin del pH se efecta
con HCl o NaOH 1N o 0.1 N tomando una muestra del medio de cultivo preparado y estril,
se mide el pH y si fuera necesario se ajusta en la muestra calculando despus el volumen
de cido o base que sea requerido para el total de medio.

ESTERILIZACIN

Los medios que van en tubo se pueden esterilizar directamente en los tubos; en el caso de
los medios en cajas de Petri se pueden esterilizar en tubos con el volumen para vaciar una
placa (aprox. 20 ml cada uno) o bien matraces para varias placas.

Si en las instrucciones del medio no se indica otra cosa, la esterilizacin se lleva a cabo en
autoclave a 121C por 15 minutos.
PRCTICA # 4

MORFOLOGA DE LAS COLONIAS BACTERIANAS

OBJETIVO

Aprender las diferentes caractersticas de la morfologa colonial utilizadas en la


identificacin de bacterias.
GENERALIDADES

Una colonia es una agrupacin de bacterias formada a partir de la reproduccin de una


Unidad Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio slido; aunque vara de tamao
generalmente es visible a simple vista.

Una UFC puede ser un solo microorganismo o bien un grupo de microorganismos


de una misma especie como en el caso de bacterias que tienen tendencia a permanecer
unidas como los estafilococos o los estreptococos.
Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos
color caractersticos, que aunque puede variar de acuerdo al medio en que se encuentren,
es constante bajo condiciones controladas y depende de la especie bacteriana que la
forme.
Debido a que las caractersticas de las colonias ocurren en varios grados y
combinaciones dependiendo de las bacterias y son a menudo muy uniformes, sirven para
identificar bacterias en cultivos mezclados. Sin embargo, adems de stas caractersticas
se requiere tambin estudiar la fisiologa y propiedades inmunolgicas de las bacterias
para poder realizar una identificacin completa.
La morfologa colonial es comparable a una estadstica ya que se deriva de una
clula individual pero es la caracterstica de la masa celular.As pues, por ejemplo, la
pigmentacin es aparente en la colonia, pero no en la clula individual, en el caso de la
consistencia mucosa de algunas colonias esta se deriva de la sustancia capsular en aquellas
bacterias con cpsula muy grande.
Medida de las colonias. sta caracterstica es bastante constante dentro de las especies
y puede ir desde colonias muy diminutas hasta un dimetro de varios milmetros.
Forma. Est determinada por su borde y su espesor. En la figura 2 se pueden observar
varias formas, elevaciones y bordes de colonias bacterianas.
Consistencia y textura. La consistencia de las colonias puede variar desde una colonia
seca que puede moverse sobre el agar con el asa, hasta una colonia viscosa que se pega al
asa y forma filamentos o hilos mucosos cuando se trata de separarla del agar..
La susperficie puede ser uniformemente brillante y suave o puede ser estriada con
muescas concntricas o quebradas. Al examinar la colonia con luz transmitida puede
aparecer con textura granular o amorfa.
Pigmentacin. Esta caracterstica es muy comn en las bacteria saprfitas en las que
las colonias aparecen rojas, anaranjadas, amarillas, etc. De los microorganismos patgenos
uno de los pigmentados ms importantes es Staphylococcus aureus que tiene un color
amarillo dorado. El pigmento no se aprecia en las clulas individuales a que se debe a
grnulos intracelulares muy pequeos para verse con luz transmitida.

MATERIAL Y EQUIPO
Se utilizarn las placas y tubos sembrados en la prctica anterior.
1 mechero Bunsen
1 asa bacteriolgica

TRMINOS DESCRIPTIVOS PARA LA MORFOLOGA DE COLONIAS EN LA SUPERFICIE DE UN


MEDIO SLIDO
SUPERFICIE
Lisa
Rugosa
Plegada

CONSISTENCIA (probarla con el asa)


Cremosa
Membranosa

COLOR
Se usan trminos comunes para definirlo y se especifica si el pigmento producido difusible
o no.

CARACTERSTICAS PTICAS
LUZ TRANSMITIDA (observar a traves de la colonia)
Opaca: no permite el paso de luz
Traslcida: Deja pasar la luz sin permitir la completa visibilidad de los objetos observados a
travs de la colonia.
Transparente: Deja pasar la luz permitiendo ver claramentelos objetos observados a travs
de la colonia.

LUZ REFLEJADA (observar la superficie de la colonia)


Opaca
Brillante

CULTIVO EN CALDO
Al igual que en los medios slidos, en los medios lquidos las caractersticas de la bacteria
sembrada se reflejan en las caracteristicas que presenta el caldo inoculado como son:
Turbidez: Opacidad ms o menos densa, signo de crecimiento.
Pelcula: Crecimiento casi contnuo sobre el lquido
Sedimento: Depsito de clulas en el fondo del tubo que se resuspende al agitar.
PRESENTACIN DE RESULTADOS
Anote las caractersticas coloniales de cada cepa en la tabla , basndose en el texto, las
figuras:
AGAR EN SUPERFICIE
Bacteria
Forma
Borde
Elevacin
Superficie
Consistencia
Color
Luz transmitida
Luz reflejada

CALDO
Pelcula
Turbidez
Sedimento

MEDIO SEMISLIDO
Movilidad
PRCTICA # 5

PRUEBAS BIOQUMICAS
OBJETIVO

El alumno observar algunas reacciones bioqumicas relacionadas con la fisiologa


bacteriana, a la vez aprender su utilizacin para la identificacin de enterobacterias

GENERALIDADES

El estudio bioqumico que se lleva a cabo como complemento de otros estudios


bacteriolgicos es posible gracias a las reacciones fisiolgicas y qumicas que llevan a cabo
los microorganismos. Para esto se emplean medios de cultivo enriquecidos con productos
tiles para el metabolismo celular, los cuales adems contienen algn indicador que hace
cambiar el color del medio al efectuar dichos microorganismos sus funciones.

Los organismos varan en su capacidad para utilizar diferentes compuestos (por


ejemplo: carbohidratos, urea, citrato, etc.) para algunos microorganismos que se usan en
su identificacin en el laboratorio. De acuerdo a los productos de su actividad qumica, las
bacterias se pueden clasificar como:

1. Zimgenas: las que fermentan los carbohidratos, desdoblndolos en alcohol, cido


lctico o actico.

2. Aergenas: las que producen gas como hidrgeno y dixido de carbono como resultado
de su actividad metablica.

3. Anaergenas: las que no producen cantidades visibles de gas durante su actividad


metablica.

4. Cromgenas: las que producen pigmentos solubles o insolubles.

5. Fotgenas: las que causan putrefaccin y producen una dbil fosforescencia (algunas
bacterias marinas)

Entre las pruebas bioqumicas ms comunes tenemos:

Caldos de carbohidratos con indicador de pH, rojo de fenol: Al fermentar algunos


carbohidratos, muchas bacterias producirn cido, y con un medio con pH original
alrededor de 7.4 al bajar ste a 6.8 por el cido que produce un cambio de color gracias a
la incorporacin de un indicador de pH como es el rojo de fenol.
Agar de hierro y triple azcar (TSI)

El agar TSI es uno de los ms usados para ver la fermentacin de carbohidratos en la


familia Enterobacteriaceae. Se pueden tener varias posibilidades de fermentacin de
acuerdo a las caractersticas metablicas del microorganismo como son: Utilizacin de
glucosa sola. Los microorganismos que fermentan solo la glucosa provocan en este medio
una reaccin alcalina en la superficie ( roja) sobre un fondo cido (amarillo, k/a) debido a
que realizan una degradacin aerbica de la glucosa en la superficie, convirtiendo el
piruvato en agua y dixido de carbono. Despus de 18 a 24 horas de incubacin como la
concentracin de glucosa es baja (0.1%), los microorganismos empiezan a utilizar las
peptonas que se encuentran en el medio, causando la liberacin de amoniaco y
produciendo un pH alcalino ( rojo) gracias al rojo de fenol que tiene el medio como
indicador de pH. En el fondo, como no hay oxgeno, se realiza una degradacin anaerbica
y el piruvato se convierte en lactato con lo cual el pH disminuye quedando el pH cido
( amarillo).

Utilizacin de lactosa y/o sacarosa. Algunos microorganismos tienen la facultad de


fermentar la glucosa y la lactosa resultando una reaccin cida en la superficie (amarilla) y
cida en el fondo (amarilla, a/a). En este caso despus de 18 a 24 hrs como la
concentracin de lactosa es alta (1.0%), o sea 10 veces ms que la de la glucosa presente,
no se ha utilizado completamente y la acidez persiste tanto en el fondo como en la
superficie. En el caso de usar sacarosa la reaccin sera la misma.

Sin utilizacin de ninguna de las anteriores. En el caso de no utilizar ninguno de los


carbohidratos presentes (glucosa, lactosa y sacarosa), lo que se usara seran las peptonas,
ya sea aerbicamente o anaerbicamente. Slo utilizndolas aerbicamente dara una
superficie alcalina (roja, k) sobre un fondo sin cambio (sc) o sea k/sc). Si las usara
aerbicamente dara una superficie alcalina (rojo) sobre fondo alcalino (rojo) o sea k/k.

En este medio tambin es posible detectar la produccin de gas por la formacin de


burbujas dentro del medio, y la produccin de cido sulfhdrico, el cual reaccionar con un
indicador con base de fierro dando un color negro debido al sulfuro de hierro formado.

Agar de hierro y lisina (LIA)

Algunos microorganismos son capaces de provocar la descarboxilacidon de los


aminocidos por induccin de enzimas especficas, el resultado de esta descarboxilacin
es la produccidon de una amina ( o diamina) y dixido de carbono. Tal es el caso de la
produccidon de la enzima lisina descarboxilasa la cual al actuar sobre la lisina produce una
diamina llamada cadaverina.
En el medio LIA se puede detectar la produccin de la lisina descarboxilasa ya que se
produce una reaccin coloreada por un cambio en el pH del medio, que contiene como
indicador prpura de bromocresol. Un cambio del color original del medio (morado) hacia
amarillo en el fondo indica una reaccidon cida por la fermentacin de una pequea
cantidad de glucosa en el medio. Si el microorganismo produce lisina descarboxilasa, la
accin de esta enzima sobre la lisina dar lugar a la cadaverina, la cual provocar un
cambio de pH hacia la alcalinidad dando un color morado que sobrepasa la acidez debida a
la glucosa. As pues, un fondo amarillo indica que no se produce lisina descarboxilasa y un
color morado que si es producida.

Prueba del citrato de Simmons

Ciertas bacterias tienen la capacidad de utilizar el citrato como nica fuente de carbono en
una serie de reacciones como sigue:

CITRATO OXALACETATO + ACETATO

OXALACETATO PIRUVATO + CO

2 PIRUVATO ACETATO + LACTATO + CO

Los cidos orgnicos son posteriormente utilizados dando como producto final carbonatos
y bicarbonatos alcalinos. El pH alcalino as logrado hace que el indicador de pH en el
medio, el azul de bromotimol vire de su color verde original a un azul intenso.

Prueba de la ureasa

La hidrlisis de la urea es catalizada en algunos microorganismos por una enzima


especfica, la ureasa, dando lugar a dos molculas de amonio, agua y dixido de carbono.

Todo esto da lugar a un cambio en el pH, lo que causa que cambie el color original del
medio (amarillo) a un color rojo bugambilia por el indicador rojo de fenol. De acuerdo a la
degradacin de la urea el color ser ms o menos intenso.

(NH2)2C=O + 2H2O---> CO2+2NH3+H2O (NH4)2CO3

Medio MIO (Movilidad, Indol y Ornitina)

Este medio como su nombre lo indica sirve para observar la movilidad, la produccon de
indol y descarboxilacin de la ornitina.

La movilidad se detectar por la presencia de turbidez alrededor del punto de inoculacin.

El indol se formar si la bacteria tiene la capacidad de producir la enzima triptofanasa que


desdoblar el aminocido triptfano en indol, cido pirvico y amonio. El indol es incoloro
pero al reaccionar con el reactivo de Kovacs (p-dimetil-aminobenzaldehido) que se
adiciona despus de que creci la bacteria, dar un color rojo violeta.
Por lo que respecta a la descarboxilacon de la ornitina como el medio tiene prpura de
bromocresol y una pequea cantidad de glucosa cuando esta se fermenta se produce un
color amarillo en el fondo (ornitina descarboxilasa negativa), sin embargo al
descarboxilarse la ornitina se produce putresina la cual es alcalina y sobrepasa la acidez
dada por la fermentacin de las glucosa resultando en un color morado en el fondo

MATERIAL Y EQUIPO

Aguja bacteriolgica

Mechero de Bunsen

Gradilla

Medios de cultivo (4 tubos cada uno)

Agar de hierro y triple azcar (TSI)

Agar de hierro y lisina (LIA)

Agar Citrato de Simmons

Agar Urea segn Christensen

Medio de MIO

TCNICA

1. Marque perfectamente cada uno de sus tubos, usando una serie de TSI, LIA, Urea,
Citrato y MIO

2. Inocule una serie para cada cepa como sigue:

MEDIO FORMA DE INOCULAR

TSI Superficie - picadura

LIA Superficie - picadura

Citrato de Simmons Superficie

Agar Urea Superficie

MIO Picadura

3. Tape los tubos procurando no apretar demasiado los tapones

4. Incube a 35 C por 24 hrs.

5. Lea e interprete los resultados de acuerdo a las tablas de identificacin


PRESENTACON DE RESULTADOS

1. Anote las observaciones de cada tubo (antes y despus de inocular), utilizando los
colores apropiados.

2. Anote los resultados de cada prueba usando las abreviaturas correctas. En caso de no
corresponder a la bacteria que se le dio con el resultado de sus pruebas bioqumicas,
especifique de que bacteria se trata.
PRCTICA # 6

CONTROL BACTERIANO POR MEDIO DE AGENTES FSICOS Y QUMICOS

OBJETIVO
Observar el efecto de algunos agentes fsicos y qumicos utilizados como germicidas para
el control de los microorganismos.
GENERALIDADES

Muchas prcticas de la vida cotidiana como la potabilizacin del agua, la pasteurizacin de


la leche o la refrigeracin de los alimentos, tienen por objeto controlar a las poblaciones
microbianas. Este control tiene varias razones como prevenir la transmisin de
enfermedades, evitar la contaminacin de algunos productos y evitar la contaminacin
(alimentaria, ambiental, etc.)

Una variedad de agentes fsicos y qumicos son tiles para provocar la muerte bacteriana o
para prevenir su multiplicacin. Entre estos encontramos las radiaciones ultravioleta, la
temperatura, los agentes desinfectantes y otros.

RADIACIN ULTRAVIOLETA
La mayora de los microorganismos mueren bajo grandes dosis de radiacin
electromagntica, especialmente en la zona ultravioleta (UV), ondas ultrasnicas de muy
alta frecuencia y con pequeas dosis de radiacin ionizante, como los rayos gamma y rayos
catdicos. La muerte se presenta por los daos causados al DNA y la variacin en la
resistencia, normalmente reflejada en las diferentes facultades de las clulas para reparar
el DNA daado por la radiacin.

TEMPERATURA
Muchas clulas son sensibles al calor hmedo, despus de la exposicin por algunos
minutos a una temperatura ms elevada que su mxima de crecimiento. La proporcin de
clulas muertas depende del tiempo de exposicin y la temperatura.

El calor mata causando la desnaturalizacin de las macromolculas como las


protenas, la muerte bacteriana es proporcional al grado de coagulacin provocado por el
calor hmedo.

La destruccin efectiva por temperaturas bajas rara vez ocurre. La causa del dao
celular durante el congelamiento no es muy conocida, pero se sabe que la concentracin
de solutos durante el congelamiento rompe las membranas y causa la lisis durante el
deshielo.
DESINFECTANTES
Los desinfectantes son generalmente agentes qumicos que matan a las bacterias y otros
microorganismos. Dentro de estos tenemos:

1. cidos y lcalis> Tanto los cidos y lcalis son muy bactericidas dado su grado de
disociacin. Entre estos se puede mencionar KOH, NaOH, HNO3 y H2SO4.

2. Agentes oxidantes. Entre stos tenemos el cloro, el perxido de hidrgeno, perborato de


Sodio, Permanganato de Potasio y Cloruro de Calcio. Los cuales actan oxidando las
molculas esenciales de la clula.

3. Compuestos orgnicos. Como los derivados del alquitrn de hulla, el cresol, tricresol,
alcanfor, creosota, cido fnico y el fenol que es el de uso ms comn. Actan
precipitando las protenas. Esta accin guarda relacin con la destruccin de la estructura
de la membrana y sus funciones.

4. Detergentes. stos se dividen en tres grupos

a) compuestos aninicos como las sales sdicas y potsicas de cidos grasos de peso
molecular elevado sulfatos de alquilo y los jabones.

b) compuestos catinicos como los compuestos de amonio cuaternario y el cloruro de


benzalconio.

c) compuestos no inicos que incluyen polisteres y steres de poliglicerol.

Los jabones no pueden considerarse antispticos o desinfectantes efectivos puesto que


solo son agentes que eliminan las bacterias mecnicamente de la piel por emulsin de
secreciones lipoides en las cuales estn incluidos los microorganismos.

Los otros grupos de desinfectantes se consideran bactericidas porque destruyen la


integridad de la membrana por alteracin de la interaccin entre las protenas y lpidos.
Los detergentes catinicos son los ms eficaces debido a la interaccin de la molcula del
detergente (carga positiva) con la superficie de la membrana bacteriana (carga neta
negativa)

ACCIN OLIGODINMICA
Accin oligodinmica es la propiedad antibacteriana que presentan ciertos metales
pesados en cantidades de partes por milln (ppm), lo cual se debe a la formacin de sales
pobremente disociables con los grupos sulfhidrilos de las protenas.
EFECTO DE LA TEMPERATURA
El efecto de la temperatura en la eliminacin de bacterias se ilustrar con un ejercicio en el
cual se calentarn los tubos con una suspensin de la bacteria a estudiar por diferentes
tiempos, evaluando despus el efecto por conteo de clulas vivas.

MATERIAL Y EQUIPO

Asa bacteriolgica

2 mecheros Bunsen

1 vaso de precipitado de 250 ml

Tela de asbesto

15 tubos de 13 x 100 con tapn de rosca, estriles

3 tubos de con10 ml solucin salina estril

3 pipetas de 5 ml estriles

1 asa calibrada de 0.001 ml

15 placas de agar de soya y tripticasena

Cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli (24 hrs incubacin), Bacillis subtilis (48
hrs de incubacin).

TCNICA

1. Prepare una suspensin ligera de cada bacteria (con la misma turbidez todas).
2. Deposite 1 ml de cada suspensin en 5 tubos para cada bacteria, los cuales irn
marcados con el tiempo de calentamiento (sin calentamiento, 5, 10, 15 y 20 minutos
respectivamente).
3. Caliente los tubos en un bao de agua de ebullicin constante por los tiempos
indicados 5, 10, 15 y 20 minutos y deje un tubo de cada bacteria sin calentar.
4. Despus del calentamiento siembre con el asa calibrada una asada de cada suspensin
en las cajas marcadas para cada bacteria con el tiempo de exposicin (5 cajas para
cada bacteria).
5. Incube por 24 horas y cuente cuantas colonias crecen en cada placa para poder
estimar el efecto del tiempo de exposicin en cada caso.
PRESENTACIN DE RESULTADOS

1. Elabore una curva con el nmero de bacterias por ml (y) vs el tiempo de exposicin (x).
2. Concluya cual es el tiempo mnimo de exposicin para eliminar al 50% de cada una de
las bacterias estudiadas.

ACCIN DE LOS METALES, CLORO, LCALIS Y CIDOS

Para demostrar el efecto de los metales sobre los microorganismos se utilizarn soluciones
de los compuestos en cuestin que se aplicaran sobre el medio para que se difundan.
Midiendo posteriormente el halo de inhibicin producido por cada una.

MATERIAL Y EQUIPO

Asa bacteriolgica

Mechero Bunsen

2 cajas de Petri estriles

2 tubos con 20 ml de agar nutritivo fundido

Cepas de Sarcina lutea, Pseudomonas aeruginosa

Cajas Petri con discos de papel filtro impregnados con las siguientes soluciones:

- Solucin de Cloruro de Plata 0.4%

- Cloruro mercrico 0.4%

- Acido sulfrico 10%

- Hidrxido de Sodio al 10%

- Cloro 6%

- Fenol al 5%

- Benzal

Pinzas para sensidiscos


TCNICA

1. Inocular con cada cepa un tubo de agar nutritivo fundido y enfriado alrededor de 45 por
separado.

2. Verter en una caja Petri estril y dejar solidificar sobre una superficie nivelada.

3. Colocar un disco impregnado con cada solucin en forma equidistante sobre las placas.

4. Dejar reposar 5 minutos para que se absorban las soluciones.

5. Incubar a 35 C por 24 hrs y observar la formacin de halos de inhibicin de crecimiento.

PRESENTACION DE RESULTADOS

1. Mide los halos de inhibicin de crecimiento.

2. Menciona qu solucin es ms eficaz.


PRCTICA # 7

OBSERVACIN EN FRESCO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS BUCALES

OBJETIVO

El alumno aplicar los conocimientos obtenidos en el curso para identificar los


microorganismos que habitan en la microbiota bucal.

GENERALIDADES

La identificacin de bacterias es un trabajo un tanto detectivesco en el cual se deben


reunir todas las caractersticas que se puedan obtener en el laboratorio como morfologa
colonial en medios selectivos o de uso general, morfologa microscpica y coloracin de
Gram, etc.

La composicin de la microbiota bucal vara desde el nacimiento y durante toda la


vida influenciada por el desarrollo de la biopelcula dental, primero por la adherencia
microbiana mediada por distintos mecanismos; a la adhesin de los primeros
colonizadores le siguen fenmenos de coagregacin, lo que constituye el denominado
"mosaico de microorganismos", el cual vara de acuerdo con las propiedades biolgicas y
fsicas del sitio.
El conocimiento de la ecologa de la cavidad bucal permite determinar el proceso
que involucra, fundamentalmente, la etiopatogenia de la caries dental y por consecuencia,
su prevencin: tambin contribuye a identificar las complicaciones sistmicas por la
microbiota bucal.

MATERIAL Y EQUIPO
3 portaobjetos
1 cubreobjetos
1 tubo de ensaye de 13 X 100 con tapn de rosca con solucin salina estril
1 placa agar nutritivo
1 placa agar EMB
1 placa agar sal y manitol
1 placa agar Mac Conkey
Hisopos estriles
Puente de tincin
Cristal violeta
Yodo de Gram o lugol
Etanol al 95% o alcohol acetona
Safranina
Aceite de inmersin
Mechero
Microscopios
TCNICA
1. Tomar una muestra de alrededor de los dientes incluyendo las encas con un hisopo
estril, sembrar en las placas de agar nutritivo, EMB, MacConkey y sal y manitol. Incubar a
36 C por 24 horas. Anotar resultados y observaciones.
2. Con el otro hisopo tomar nuevamente muestra y realizar 2 extendidos e introducir el
hisopo en el tubo con sol. salina estril.
3. Los extendidos secarlos con ayuda del mechero y proceder a teir como indica la tcnica
de Gram.
4. Observar al microscopio con objetivo de 100 X.
5. Tomar una muestra con el hisopo en solucin salina, colocarla en el portaobjetos y
cubrir. Observar en 40 X.

PRESENTACIN DE RESULTADOS
1. Investigar los microorganismos de la microbiota bucal, as como las caractersticas
morfolgicas en cada medio y microscpicas tintoreales.
2. Anotar resultados y observaciones de las extensiones y de crecimiento en las placas de
agar, obtenidas en la prctica.
3. Anotar los gneros que crecieron en cada placa.