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1. Resumen
1. Introduccin
El mtodo de tincin diferencial ms importante usado en bacteriologa es la tincin
de Gram, llamada as en honor al Dr. Hans Christian Gram. Este mtodo divide las
bacterias en dos grandes grupos, las Gram-negativas y las Gram-positivas.
La tincin diferencial requiere el uso de al menos 3 reactivos qumicos que se
aplican en secuencia a un frotis fijado por calor. El primer reactivo es llamado
tincin primaria o colorante primario. Su funcin es impartir color a todas las
clulas. Con el objetivo de establecer un contraste de color, el segundo reactivo
usado es un agente decolorante, el cual puede decolorar la clula completa o solo
parte de ella. El reactivo final, el colorante de contraste, le da a las clulas
decoloradas un color que contrasta con el del colorante primario.
2. Objetivos
Reconocer los microorganismos Gram positivos y negativos,
aligual de la aplicabilidad clnica de la tincin.
Los colorantes ms utilizados: azul de metileno, cristal violeta, safranina, son catinicos
y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados negativamente, como
los cidos nucleicos y los polisacaridos cidos (las envueltas externas de los
microorganismos estn por lo general cargadas negativamente).
Segn su naturaleza:
Naturales: Rojos Amarillo (de insectos, plantas, frutos, etc).
Artificiales: Azul de Metileno
Por su afinidad:
cidos: Eosena
Bsicos: Azul de Metileno
Neutros: Ni cido ni bsico, reacciona en ambos. Ejemplo: Para tejidos de sangre -
Wright
TINCIN DIFERENCIAL DE GRAM.
Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de
cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para
quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las gram positivas
como las gram negativas, estn teidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una
solucin de yodo-yoduro potsico. El ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente
hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua
con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas gram positivas como las gram negativas se
encuentran en la misma situacin. Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una
mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta.
Algunos organismos (gram positivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos)
lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su
resistencia a la decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el
caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y
disuelve la membrana exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana
citoplsmica a la que se une peptidoglicano).
5.8 MORDIENTE
Yodo o lugol. El yodo, aparte de matar bacterias, incrementa
la afinidad del colorante primario con la clula, formando
complejos insolubles con este. El complejo cristal violeta-
yodo sirve para intensificar el color del tenido.
3. Materiales
6.1 MUESTRAS
Asa de siembra
Portaobjetos
Microscopio ptico
Mechero de alcohol
Fsforos
4. Mtodos
1. Cristal Violeta:
Alcohol bsico // Bacteria cida
Procedimiento:
Se extrae colonia del cultivo con asa de siembra
(extendiendo)
1 par de gotas en colonia
Esperar 2 minutos.
Lavar el exceso de colorante (a chorro lento).
Se le aplica calor.
Se evala en microscopio.
2. Lugol: Mordiente
Para que quede cristal violeta dentro de la bacteria porque
no tiene ncleo.
Procedimiento:
Ioduro de Potasio.
Se le aade 2 gotas.
Esperar 2 minutos.
Lavar.
Procedimiento:
Agregar safranina por 30 segundos. (Pinta clulas
transparentes, no se lo debe dejar por mucho tiempo
porque ingresar a clula).
Lavar la muestra con agua.
Secar muestra
Evaluar en el microscopio.
5. Resultados
TINCIONES O COLORACIN
MEDIO DE CULTIVO
EXTRACCIN DE 1 COLONIA DE BACTERIAS
ASA ESTRIL CON FLAMA
SE EXTIENDE MUESTRA SOBRE PORTAOBJETOS SE FIJA
BACTERIAS CON MECHERO
MEDIO
DE CULTIVO EXTRACCIN DE 1 COLONIA DE BACTERIAS
ASA ESTRIL CON FLAMA
SE FIJA BACTERIAS EN MECHERO DE ALCOHOL
SE EXTIENDE MUESTRA SOBRE PORTAOBJETOS
SE
GRAM
NEGATIVAS,
COLORACIN ROJA
dISCUSIN
El cristal violeta es bsico (se une a componentes celulares de carga negativa). Atraviesa la
envuelta celular y se acumula en el citoplasma. Para facilitar la diferenciacin se mezcla
lugol con cristal violeta: el complejo cristal-violeta-lugol precipita. As el lugol dificulta la
salida del cristal violeta de ambos tipos de clulas, pero es ms fcil de extraerlo de las
Gram negativas que de las Gram positivas. (David Saceda Corralo, 2015).
Cuando se aade etanol a una mezcla de clulas Gram positivas y Gram negativas teidas
con cristal violeta, las clulas Gram positivas quedan teidas de violeta: no puede atravesar
la gruesa capa de murena (pueden hacerlo si se prolonga excesivamente el contacto con el
alcohol). La pared de las bacterias Gram negativas debe su rigidez a una capa de murena
ms delgada, a travs de la cual el alcohol extrae el cristal violeta de estas clulas. Su
citoplasma queda incoloro y puede teirse de color rosa con el colorante de contraste: la
safranina. (David Saceda Corralo, 2015).
LUEGO DEL PERIODO DE INCUBACION UBO DESARRROLO PURO DE
PEQUEAS COLONIAS
LA TENSION REBELO LOS BACILIOS COCUS NEGATIVOS
1. Conclusin
Bacterias Gram positivas: Corresponden a las bacterias que mantienen la coloracin del
cristal violeta despus del alcohol acetona, lo que les da un color violeta/morado.
Bacterias Gram negativas: Corresponden a las bacterias que pierden la coloracin del
cristal violeta despus del alcohol acetona y se tien con el colorante de contraste
(safranina), lo que les da un color rosceo/rojizo.
El tamao de las bacterias dificulta su visin al microscopio, por eso latincin de estas en la
microbiologa es un apartado sumamente trascendente.
La tcnica de tincin tiene como finalidad crear un contraste entre la clula y elmedio que
la rodea, y una de las ms importantes, tanto por su aplicacinclnica para hacer una
identificacin preliminar de la bacteria causal de lainfeccin y por su practicidad, es la
tincin de Gram. Es por eso que estatcnica se vuelve fundamental en el estudio de la
microbiologa
2. Bibliografa
David Saceda Corralo, 2015. En: TINCIN GRAM. Recuperado de:
http://www.webconsultas.com/categoria/autores/david-saceda-licenciado-en-medicina-por-
la-universidad-de-alcala-de-henares