LAPORAN PRAKTIKUM

KIMIA FARMASI INSTRUMENTAL DAN BIOKIMIA

(FA3113)

PERCOBAAN V
KINETIKA ENZIM

Tanggal Percobaan : Kamis , 19 Oktober 2017

Tanggal Pengumpulan : Kamis , 26 Oktober 2017

Oleh
Meyliana Taslim
10715033
Kelompok L-6
Shift Kamis

Asisten:
Sarinilayana Harefa ( 10714065 )

LABORATORIUM FARMAKOKIMIA
PROGRAM STUDI SAINS DAN TEKNOLOGI FARMASI
SEKOLAH FARMASI
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2017
 I. Tujuan

1. Menentukan kecepatan maksimum dan konstanta Michaels-Menten enzim

GOD-PAP dalam percobaan dengan enzimatik.
II. Cara Kerja
Ke dalam tabung reaksi dimasukkan enzim GOD-PAP sebanyak 1 ml,
lalu diinkubasi pada suhu 37C selama 15 menit

Ditambahkan 2 ml aquadest dan glukosa 10 l

Dikocok hingga homogen, lalu dicek absorbansinya

Diinkubasi kembali pada suhu 37C selama 5 menit

Dicek absorbansinya

Langkah-langkah diatas diulang untuk volume glukosa

yang berbeda yaitu 20,30,50 dan 60 l

Dibuat grafik untuk memperoleh nilai vmax dan km

III. Perhitungan dan Pengolahan data

Tabung reaksi 1
Massa glukosa = 1 mg/mL x 0,01 mL = 0,01 mg
Volume = 3,01 mL
[S] = 3,32 x 10-3 mg/mL

Tabung reaksi 2
Massa glukosa = 1 mg/mL x 0,02 mL = 0,02 mg
Volume = 3,02 mL
[S] = 6,62 x 10-3 mg/mL

Tabung reaksi 3
Massa glukosa = 1 mg/mL x 0,03 mL = 0,03 mg
Volume = 3,03 mL
[S] = 9,9 x 10-3 mg/mL

Tabung reaksi 4
Massa glukosa = 1 mg/mL x 0,04 mL = 0,04 mg
 Volume = 3,04 mL
[S] = 0,0132 mg/mL

Tabung reaksi 5
Massa glukosa = 1 mg/mL x 0,05 mL = 0,05 mg
Volume = 3,05 mL
[S] = 0,0164 mg/mL

Tabung reaksi 6
Massa glukosa = 1 mg/mL x 0,06 mL = 0,06 mg
Volume = 3,06 mL
[S] = 0,0196 mg/mL

Tabung Volume Glukosa Absorbansi awal (A) Absorbansi akhir (A) Perbedaan absorbansi
Reaksi Standar (L) t = 0 menit t = 5 menit = absorbansi akhir-
awal (A)
1 10 0,05 0,094 0,044
2 20 0,095 0,222 0,127
3 30 0,100 0,234 0,134
4 40 0,113 0,352 0,239
5 50 0,116 0,389 0,273
6 60 0,131 0,393 0,262

Untuk perhitungan v0 digunakan persamaan:

2 1
0 =
5

V [S] 1/ V 1/ [S]
0.0088 0.00332 113.6364 301.2048
0.0254 0.00662 39.37008 151.0574
0.0268 0.00990 37.31343 101.0101
0.478 0.01320 20.9205 75.75758
0.0546 0.01640 18.31502 60.97561
0.0524 0.01960 19.08397 51.02041
 Grafik Katalisasi Enzim GOD PAP
terhadap Glukosa
350
1/V (konsentrasi/menit)

300 y = 2,5281x + 18,739

R = 0,9654
250
200
150
100
50
0
0 20 40 60 80 100 120
1/[S] (mL/mg)

1 1 1
= +
0 []

y = 2.5281x + 18.739
R = 0.9654

1
= 18,739

Vmax = 0,05336 mg mL -1 menit-1

= 2.5281

Km = 2,5281 x 0,05336

Km = 0,135 mg/mL
IV. Pembahasan
Enzim adalah senyawa protein yang mengkatalisis reaksi-reaksi biokimia.
Enzim dapat mengaktifkan, mengkatalisis dan mengendalikan reaksi kimia untuk
mempertahankan organisme. Sebagai katalis, enzim mempercepat reaksi dengan
menurunkan energi aktivasi tanpa mempengaruhi kesetimbangan reaksi. Energi
aktivasi adalah energi minimum yang dibutuhkan hingga suatu reaksi dapat terjadi.
Enzim mampu mengkatalisis suatu reaksi hingga 1020 lebih cepat dibandingkan reaksi
tanpa katalis. Enzim memiliki sifat-sifat tertentu yaitu memiliki spesifitas yang tinggi,
bersifat stereoselektif (dapat membedakan isomer geometris dan optis substrat) dan
memiliki laju reaksi tinggi.
Enzim mempunyai kemampuan katalisis yang spesifik, dimana substrat akan
menempel pada bagian yang sangat spesifik dari enzim. Bagian spesifik ini disebut
tapak aktif atau sisi aktif enzim. Kerja enzim dapat dipengaruhi beberapa faktor yaitu:
1. Konsentrasi substrat
Jika konsentrasi substrat meningkat maka kecepatan reaksi juga
meningkat. Pada suatu titik tertentu, penambahan konsentrasi substrat
tidak lagi mempengaruhi kecepatan reaksi, hal ini dikarenakan semua
enzim yang ada telah berikatan dengan substrat.
2. Suhu
Kerja enzim akan maksimal pada suhu yang optimum. Setiap enzim
memiliki suhu optimum yang berbeda-beda. Dimana sebagian besar
enzim dalam tubuh manusia memiliki suhu optimum sekitar 350C -
370C. Dengan meningkatnya suhu, kecepatan suatu reaksi juga
meningkat tetapi pada suhu yang terlalu tinggi, enzim akan terdenaturasi
sedangkan pada suhu yang terlalu rendah, enzim menjadi tidak aktif.
3. pH
Setiap enzim mempunyai nilai pH optimum yang bervariasi, bergantung
asam amino penyusunnya yang memiliki titik isoelektrik berbeda pula.
Contoh enzim yang aktif di pH asam adalah enzim pepsin yang terdapat
pada lambung sedangkan untuk enzim yang aktif di pH basa adalah
enzim tripsin. Pada pH di atas atau di bawah titik isoelektriknya, terjadi
peningkatan gaya elektrostatik intramolekul protein sehingga terjadi
perubahan konformasi struktur. Gaya tolakan ini dapat menyebabkan
 struktur protein mengembang sehingga tapak aktif enzim tidak dapat
mengikat substrat dengan optimal.
4. Inhibitor
Inhibitor adalah suatu molekul yang dapat menghambat aktivitas enzim.
Inhibitor mempunyai kemampuan untuk menyerang sisi aktif enzim
sehingga enzim tidak dapat berikatan dengan substrat sehingga fungsi
enzim sebagai katalis tidak akan berfungsi dengan baik. Ada 2 jenis
yaitu:
Inhibitor kompetitif
Innhibitor kompetitif menghambat aktivitas enzim dengan cara
berkompetisi dengan substrat untuk menempati tempat
melekatnya substrat pada enzim. Tempat melekatnya substrat ini
disebut dengan sisi aktif enzim.

Inhibitor non kompetitif

Inhibitor ini kerjanya tidak berkompetisi dengan substrat tetapi
inhibitor ini berikatan dengan sisi selain sisi aktif enzim. Ikatan
ini mengubah sisi aktif enzim sehingga tidak dapat berikatan
dengan substrat.
 Mekanisme kerja enzim dalam meningkatkan kecepatan suatu reaksi adalah
membentuk kompleks substrat-enzim untuk menurunkan energi aktivasi. Enzim dan
substrat akan membentuk kompleks yang kemudian terbentuk produk sehingga enzim
akan berada dalam keadaan bebasnya lagi. Enzim bebas ini akan berikatan dengan
substrat baru untuk membentuk kompleks kembali. Ada 2 teori yaitu:
a. Teori gembok dan kunci ( Lock and Key )
Teori ini menyatakan bahwa substrat hanya akan menempel pada sisi
aktif enzim jika bentuknya cocok dan bersifat komplementer seperti
halnya pasangan kunci dan anak kunci. Model ini tidak
memperhitungkan fleksibilitas konformasi, oleh karena itu model ini
tidak dipakai.
b. Teori Induced Fit
Teori ini menyatakan bahwa bagian dari sisi aktif enzim mempunyai
bentuk yang fleksibel. Saat substrat memasuki sisi aktif enzim makan
sisi aktif enzim akan menyesuaikan bentuk dengan substrat. Substrat
tetap mampu berikatan dengan sisi aktif enzim walaupun bentuk kedua
nya berbeda. Pengikatan substrat akan menginduksi perubahan
konformasi enzim sehingga dihasilkan pasangan komplementer, dimana
hal ini terjadi setelah substrat terikat pada sisi aktif enzim.
Kofaktor adalah komponen non protein yang berupa senyawa non anorganik
yang dibutuhkan enzim untuk menjalankan aktivitas katalisisnya. Contoh kofaktor
adalah ion Fe2+, Mg2+ , Mn2+ dan Zn2+. Koenzim adalah kofaktor yang berupa senyawa
organik non protein seperti vitamin. Gugus prostetik adalah koenzim atau ion logam
yang terikat kuat secara kovalen dengan protein enzim. Apoenzim adalah bagian
protein tidak aktif yang terpisah dari suatu enzim. Holoenzim adalah enzim yang
memiliki struktur lengkap yakni berikatan dengan kofaktor maupun koenzimnya dan
aktif bekerja. Zimogen adalah senyawa inaktif yang berubah menjadi enzim saat
diaktivasi oleh enzim lain.
Menurut Michaelis-Menten, kinetika enzim menjelaskan hubungan antara
konsentrasi substrat dengan kecepatan awal reaksi. Enzim berikatan dengan substrat
membentuk kompleks enzim-substrat yang kemudian akan terurai menjadi produk dan
melepaskan enzim. Semakin besar konsentrasi substrat maka kecepatan reaksi juga
semakin meningkat. Tetapi, persamaan Michaelis-Menten tidak berlaku untuk enzim
alosterik. Enzim alosterik merupakan enzim yang memiliki beberapa sisi aktif yang
saling berkaitan dan kooperatif. Hal ini mengakibatkan enzim alosterik memiliki
bergantung pada substrat dan menghasilkan sifat katalis yang lebih bervariasi dalam
memberikan respon terhadap perubahan yang terjadi.

.[]
Persamaan Michaelis-Menten adalah: Vo = Dari kurva Michaelis-
+[]

Menten dapat dilihat bahwa saat vo = Vmax maka nilai Km akan senilai dengan
konsentrasi substrat pada titik tertentu. Hal ini dapat dibuktikan sebagai berikut:

1 . []
=
2 + []
+ [] = 2 []

= []

Setiap enzim mempunyai sifat yang spesifik terhadap substrat yang disebut sifat
spesifitas enzim yang dinyatakan sebagai nilai tetapan Michaelis-Menten (Km). Km
adalah konsentrasi substrat saat kecepatan reaksi bernilai setengah dari kecepatan
maksimumnya. Jika nilai Km besar maka menandakan bahwa enzim dan substrat
berikatan tetapi tidak kuat karena enzim mempunyai afinitas yang rendah terhadap
substrat dan sebaliknya jika nilai Km kecil maka menandakan bahwa enzim dan
substrat berikatan sangat kuat dan kompleks enzim-substrat terbentuk dengan baik
karena enzim mempunyai afinitas yang tinggi terhadap substrat. Penentuan nilai Km
dan Vmax dapat dihitung melalui persamaan Lineawave-Burk yaitu:
1 1 1
= . +
[]

Persamaan Lineawave-Burk memberikan nilai Km sama dengan konsentrasi

substrat pada titik tertentu ketika Vo = Vmax. Hal ini dapat dibuktikan sebagai
berikut:

1 1 1
1 = . [] +

2

2 1
= .( + 1)
[]

2 = 1. ( + 1)
[]

2= + 1
[]

1=
[]

= []

Kurva dari persamaan Lineawave-Burk menghasilkan garis linier sedangkan

persamaan Michaelis-Menten menghasilkan kurva yang berbentuk hiperbolik, sehingga
penentuan nilai Km dan Vmax menjadi kurang akurat. Oleh karena itu digunakan
persamaan Lineawave-Burk dalam penentuan nilai Km dan Vmax.
 Pada percobaan, digunakan kit GOD-PAP. Kit GOD-PAP terdiri dari reagen
dan glukosa standard. Reagennya terdiri dari glukosa oksidase, peroksidase 4-
aminoantipirine dan p-hidroksibenzoat. Prinsipnya adalah glukosa akan dikatalisis oleh
enzim glukosa peroksidase membentuk asam glukoronat dan H2O2. H2O2 yang
diperoleh akan bereaksi dengan 4-amintoantipirine dan p-hidroksibenzoat dengan
bantuan katalisis oleh enzim peroksidase membentuk quinonemine yang berwarna
merah. Skema reaksi pembentukan quinonimine adalah sebagai berikut:

Glukosa oksidase
Glukosa + O2 + H2O asam glukoronat + H2O2

Peroksidase
2 H2O2 + 4-aminoantipirine + p-hidroksibenzoat quinonimine

Glukosa harus diubah terlebih dahulu menjadi gugus yang memiliki kromofor
agar dapat dikur absorbansinya dengan spektrofotometri UV-Vis. Pengukuran
dilakukan sebanyak 2 kali karena kinetikanya yang diukur. Pada percobaan ini, enzim
GOD-PAP sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu diinkubasi pada
suhu 37C selama 15 menit.

Inkubasi dilakukan agar enzim bersifat aktif sebelum pencampuran dengan

glukosa. Selanjutnya ke dalam tabung ditambahkan glukosa standar 10 l dan aquadest
2 ml. Larutan dalam tabung dikocok agar homogen lalu diukur absorbansinya
menggunakan fotometer pada panjang gelombang 510 nm. Digunakan fotometer
karena ia memiliki parameter absorbansi. Nilai absorbansi ini digunakan untuk
mementukan absorbansi sebelum enzim bekerja.

Selanjutnya larutan diinkubasi pada suhu 37C selama 15 menit agar enzim
dapat bekerja pada suhu optimumnya, selanjutnya absorbansi larutan diukur kembali
 untuk memperoleh absorbansi sampel ketika t=0 menit dan t=5 menit. Langkah diatas
diulang dengan 5 variasi volume glukosa standar lainnya yaitu 20,30,40,50 dan 60 l.

Data absorbansi pada saat t=0 dan t=5 dapat dihitung selisihnya yang mewakili
perubahan konsentrasi selama 5 menit inkubasi. Hal ini berdasarkan hukum Lambert
Beer dimana konsentrasi senilai dengan absorbansi. Selanjutnya dibuat kurva antara
1/V dan 1/[S] sesuai dengan persamaan Lineweaver-Burk dan diperoleh persamaan
regresi linear y = 2.5281x + 18.739 dengan nilai r2 yaitu 0.9654 sehingga didapatkan
nilai Km sebesar 0.135 mg/ml dan Vmax sebesar 0.05336 mg/ml menit. Nilai r2 yang
didapat tidak terlalu jauh dari 1, hal ini disebabkan oleh kesalahan pemipetan dengan
mikro pipet dan pipet volume oleh praktikan.

V. Kesimpulan
1. Nilai Km sebesar 0.135 mg/ml dan Vmax sebesar 0.05336 mg/ml menit dari substrat
dengan menggunakan enzim GOD-PAP.

VI. Daftar Pustaka

Aryulina, Diah. 2004. Biologi Jilid 3. Jakarta : Erlangga, halaman 33-39

Campbell, N.A. 1940. Biology 5th Edition. New York : Addison Wesley Longman,
Inc, halaman 101-103

Gray, Stephen.P, John.A.B. 1983. Kinetic Assay of Human Pepsin with Albumin-
Bromphenol as Substrate. New York : Chemistry Lab, Inc, halaman 447-451

Sumardjo, Damin. 2009. Pengantar Kimia : Buku Panduan Kuliah Mahasiswa

Kedokteran dan Program Strata I Fakultas Bioeksakta. Jakarta: Buku
Kedokteran EGC, halaman 390-395