PROTOCOLO PREPARACIN GEL DE AGAROSA.

Preparar cuba de electroforesis y cuna del gel.

A los extremos abiertos de la cuna cubrirlos con cinta de

enmascarar 3M Rocket, cuidando de un trozo a lo largo de la cinta
sobresalga de la base de la cuna (0,5 cm). Frotar la base y el
costado de la cuna en contacto con la cinta para asegurar que toda
la superficie este pegada.

Colocar el peine en la parte superior de la cuna.

Colocar la cuna as preparada dentro de la cuba.

PREPARACIN DE LA AGAROSA.

Pesar agarosa suficiente para un volumen de 150 mL y una

concentracin de 0,8 %. (unos 1,2 g).

Colocar la agarosa en un erle de 250 mL, agregar los 150 mL de

buffer de corrida 1X (TBE), marcar hasta donde llega el buffer.

Llevar al microondas y fundir la agarosa. Controlar el nivel de

lquido, si est por debajo de la marca realizada, completar hasta
all con H2O demonizada.

Dejar enfriar. Agregar antes de volcar 75 uL de Bromuro de etidio,

agitar suavemente para mezclar. A partir de aqu la manipulacin
del gel debe hacerse con guantes, ya que el BrEt es mutagnico.

Volcar dentro de la cuna y dejar gelificar.

Una vez gelificado, sacar con cuidado las cintas de los bordes.

Llenar la cuba con el buffer de corrida 1X, colocar all la cuna con el
gel, recin entonces con cuidado sacarle el peine.
PREPARACIN DE LA MUESTRA

Resuspender las muestras de ADN con 50 uL de buffer Tris 0,01M

pH 7,5. pipetear bien sobre las paredes, darles un spin down en la
microcentrifuga.

Preparar un eppendorf nuevo para cada muestra, rotular.

Colocar en el 15 uL de muestra resuspendida, agregar 3 uL de
buffer de carga 6X (15 uL + 3 uL = 18 uL tot.) para que as quede el
buffer 1X de concentracin.

Nuevo spin down.

Sembrar en orden los 18 uL de muestra en la ltima calle sembrar

marcador supercoiled.

Colocar la tapa de la cuba, controlando que los bornes negativo y

positivo coinciden (rojo/rojo y negro/negro).

Conectar la cuba a la fuente de poder.

Voltaje de corrida, se calcula segn una formula emprica.
Para evitar que la resistencia del gel eleve la temperatura y termine
fundiendo la agarosa, el lmite de voltaje estar dado por la formula:

Voltaje total= 5Volts/cm x distancia lineal entre los bornes de la

cuba.
(por ejemplo, si esa longitud es de 28 cm, entonces el voltaje
mximo ser de ~140-150 voltios, esta cifra es indicativa, no debe
correrse a ms de ese voltaje, pero puede correrse a voltajes
menores).

Activar la corrida y dejar correr una hora.

Sacar el gel de la cuba llevarlo al transiluminador, colocarlo all y

prender la luz UV despus de bajar la tapa acrlica, identificar las
bandas que pudieran aparecer.