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DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE PROTENAS POR EL MTODO DE

KJELDAHL
El mtodo Kjeldahl se utiliza en qumica orgnica para la determinacin del contenido
de nitrgeno en muestras orgnicas lo cual es de gran inters en mbitos de tanta
transcendencia hoy en da como son el alimentario y el medioambiental.
APLICACIONES
Desde 1883 en que John Kjeldahl present sus trabajos, su mtodo ha ganado una gran
aceptacin y se aplica en una amplia variedad de trabajos para los anlisis de alimentos,
bebidas, piensos, grano, carnes, aguas residuales, suelos para cultivos y otros. Hoy por
hoy es el mtodo ms usado para el anlisis de protenas y se efecta mediante la
determinacin de nitrgeno orgnico. Esto es as porque los diferentes tipos de
protenas coinciden todas ellas en una proporcin similar de dicho nitrgeno orgnico.
En la mayora de los casos de utiliza el factor de clculo siguiente:

CONTENIDO DE PROTENAS = CONTENIDO DE NITRGENO ORGNICO X 6.25

En esta tcnica se digieren las protenas y otros compuestos orgnicos de los alimentos
en una mezcla con cido sulfrico en presencia de catalizadores. El nitrgeno orgnico
total se convierte en sulfato de amonio mediante la digestin. La mezcla resultante se
neutraliza con una base y se destila. El destilado se recoge en una solucin de cido
brico. Los aniones de borato as formado se titulan con HCL estandarizado para
determinar el nitrgeno contenido en la muestra.
En general, el mtodo Kjeldahl tiene la ventaja de poderse ejecutar mediante equipos
no muy sofisticados y puede ser realizado por tcnicos poco experimentados.
VENTAJAS DEL MTODO
Apropiado para varios tipos de pro ductos.
Alta confiabilidad.
Usado como mtodo de referencia.
DESVENTAJAS DEL MTODO
Interfieren compuestos nitrogenados no proteicos.
Uso de catalizadores txicos o caros.
Eleccin del factor de conversin.
Como consecuencia de su estructura a base de aminocidos individuales, el contenido
en nitrgeno de las protenas vara slo entre unos lmites muy estrechos (15 a 18%; en
promedio 16%). Para la determinacin analtica del contenido en protena total, se
determina por lo general el contenido de nitrgeno (N) tras eliminar la materia orgnica
con cido sulfrico (mtodo de Kjeldahl), calculndose finalmente el contenido de
protena con ayuda de un factor (en general f = 6,25). Se asume que el SO3 que se
forma durante el tratamiento a altas temperaturas se adiciona como cido de Lewis al
grupo NH del enlace peptdico (base de Lewis) de la protena, formndose el
correspondiente cido amidosulfnico, el que posteriormente se transforma en sulfato
amnico por degradacin. El sulfato amnico se determina a continuacin, tras
liberacin del NH3 y destilacin, por medio de una valoracin cido-base.
Como en el tratamiento Kjeldahl de alimentos no se determinan slo protenas o
aminocidos libres, sino tambin cidos nucleicos y sales de amonio y tambin
nitrgeno ligado de compuestos orgnicos o vitaminas, el nitrgeno ligado orgnico se
expresa como nitrgeno total calculado como protena o como protena total (N x f).
No obstante, como por lo general los alimentos slo contienen cantidades traza de
compuestos aromticos nitrogenados y de vitaminas, el error as cometido se considera
despreciable.
FUNDAMENTO: La sustancia a investigar se somete a un tratamiento oxidativo con
cido sulfrico concentrado en presencia de una mezcla catalizadora (las sales/xidos
metlicos sirven para el transporte de oxgeno con formacin intermedia de oxgeno
naciente; el sulfato potsico sirve para elevar el punto de ebullicin, alcanzndose
temperaturas de 300-400C durante la digestin). Del sulfato amnico formado se libera
el amonaco por tratamiento alcalino y ste se transporta con ayuda de una destilacin
en corriente de vapor a un recipiente con cido brico y se realiza una titulacin con una
solucin valorada de cido sulfrico. El contenido en protena de la muestra se calcula
teniendo en cuenta el contenido medio en nitrgeno de la protena en cuestin.
MATERIALES Y REACTIVOS

1 balon de Kjeldahl con capacidad de 500 ml.


2 matraz de Erlenmeyer de 10 de 125 ml.
1 mechero de Bunsen.
2 pinzas (nueces).
1 soporte universal
1 pipeta de 10 ml.
1 frasco gotero de 25 ml.
2 botellas de plstico de capacidad 500 ml.
1 piseta grande con agua destilada.
1 bureta.
3 tamaras de ebullicin.
1 par de guantes.
1 pinzas largas.
1 embudo de cristal.
1 papel filtro
MUESTRA VEGETAL

Lechuga de mar Ulva lactuca


REACTIVOS

Sulfato de cobre (0,6gr)


Sulfato de potasio (7,5gr)
Acido sulfrico 12.5 ml (96%)
Acido sulfrico 0.25N-12,5 ml
NaOH 50 ml (40%)
NaOH 0,25 N
Fenolftaleina
Vaselina (para lubricar los instrumentos)
PROCEDIMIENTO
Antes de iniciar con el mtodo de Kjeldahl.
1. Pesar 0,50 gr de la muestra seca y triturada de la Ulva lactuca
2. Colocar la muestra en un cartucho pequeo de papel filtro
I. DIGESTIN:
Colocamos el cartucho con la muestra de alga (de acuerdo al contenido estimado de
nitrgeno) de 0,5gr con una precisin de 1 mg, en un baln Kjeldahl de 500 ml.
Agregamos sulfato de sobre (CuSO4) 0,6gr y Sulfato de potasio (K2SO4) 7,5gr como
catalizadores, y 12,5 ml de H2SO4 (96%). Todo el material debe estar sumergido en el
cido para que no haya prdidas de nitrgeno. Conectar el baln al soporte universal y
debajo colocamos el mechero de Bunsen; luego calentar enrgicamente hasta
completar la digestin de la materia orgnica (no se observan partculas carbonosas sin
oxidar y el lquido queda translcido y de color dbilmente verdoso o azul-verdoso). La
digestin demanda entre 1 y 2 hs. Enfriar y agregar cuidadosamente al menos 100ml
de agua hirviendo con 3 tamaras de ebullicin.

IMPORTANTE: el baln de Kjeldahl debe estar


en una posicin de 45 en todo momento desde
que contiene los reactantes hasta finalizar la
digestin.

II. DESTILACIN:
Presentar el baln con la muestra digerida a un refrigerante por medio de una trampa
adecuada. Preparar un erlenmeyer con 12,5 ml de H2SO4 0,25N (sobre el cual se va a
recoger el NH3 destilado), y colocarlo a la salida del refrigerante cuidando que el
extremo del mismo quede sumergido en la solucin cida. Antes de conectar
completamente el baln se va agregando con cuidado la cantidad necesaria de solucin
de NaOH 40% como para neutralizar el cido sulfrico, primero sin agitar para que se
ubique en el fondo, y una vez agregado todo, conectar bien el baln, agitar para lograr
la mezcla (el medio se hace fuertemente alcalino que se detecta por formacin de un
precipitado pardo oscuro, dispersado por efecto de la ebullicin) y simultneamente se
comienza el calentamiento a ebullicin del contenido del baln. Se sigue destilando
hasta llegar a aproximadamente 200 ml en el erlenmeyer colector (los primeros 150 ml
de destilado contienen generalmente la totalidad del NH3). Una vez alcanzado dicho
volumen, se retira el erlenmeyer enjuagando dentro del mismo el extremo del
refrigerante , para no perder nitrgeno y luego se apaga el calentamiento.
III. VALORACIN:
El destilado se valora con solucin de NaOH 0.25 N, hasta lograr el viraje del indicador
fenolftalena al color inicial rosado.

Clculos:
Protena total % = VMuestra x NAcido x 14 x F x 100 / 1000x gr de muestra

Siendo VMuestra ml de NaOH gastados en la valoracin de la muestra


NAciodo normalidad del NaOH
F factor de conversin de nitrgeno a protena(6,25)
gmuestra peso en g de la muestra
Reemplazando:
Proteina total % = 8.7 x 0.25 x 14 x 6.25 x 100
0.5 x 10000

Proteina total = 38.06 %


DETERMINACIN DE GRASAS POR EL MTODO DE SOXHLET
El extractor Soxhlet o simplemente Soxhlet (en honor a su inventor Franz vonSoxhlet) es
un tipo de material de vidrio utilizado para la extraccin de compuestos, generalmente de
naturaleza lipdica, contenidos en un slido, a travs de un disolvente afn.

La extraccin con Soxhlet presenta las siguientes ventajas:

La muestra est en contacto repetidas veces con porciones frescas de disolvente.


La extraccin se realiza con el disolvente caliente, as se favorece lasolubilidad de los
analitos.
No es necesaria la filtracin despus de la extraccin.
La metodologa empleada es muy simple.
Es un mtodo que no depende de la matriz.
Se obtienen excelentes recuperaciones, existiendo gran variedad de mtodosoficiales
cuya etapa de preparacin de muestra se basa en la extraccin conSoxhlet.
Por otra parte, las desventajas ms significativas de este mtodo de extraccin son:

El tiempo requerido para la extraccin normalmente est entre 6-24 horas.


La cantidad de disolvente orgnico (50-300 ml).
La descomposicin trmica de los analitos termolbiles, ya que la temperaturadel
disolvente orgnico est prxima a su punto de ebullicin.
No es posible la agitacin del sistema, la cual podra acelerar el proceso de extraccin.
Es necesaria una etapa final de evaporacin del disolvente para la concentracin de los
analitos.
Esta tcnica no es fcilmente automatizable.
Descripcin
El condensador est provisto de una chaqueta de 100 mm de longitud, con espigas para la
entrada y salida del agua de enfriamiento. El extractor tiene una capacidad, hasta la parte
superior del sifn, de 10 mL; el dimetro interior del extractor es de 20 mm y su longitud de
90 mm. El matraz es de 500 mL capacidad.
Est conformado por un cilindro de vidrio vertical de aproximadamente un pie de alto y una
pulgada y media de dimetro. La columna est dividida en una cmara superior y otra
inferior. La superior o cmara de muestra sostiene un slido o polvo del cual se
extraern compuestos. La cmara de disolvente, exactamente abajo, contiene una reserva
de disolvente orgnico, ter o alcohol.
Dos tubos vacos, o brazos, corren a lo largo a un lado de la columna para conectar las dos
cmaras. El brazo de vapor corre en lnea recta desde la parte superior de la cmara del
disolvente a la parte superior de la cmara del slido. El otro brazo, para el retorno de
disolvente, describe dos U sobrepuestas, que llevan desde la cmara de la muestra el
disolvente hasta la cmara de disolvente. El soxhlet funciona cclicamente, para extraer las
concentraciones necesarias de algn determinado compuesto.
ste funciona de la siguiente forma: Cuando se evapora, el disolvente sube hasta el rea
donde es condensado; aqu, al caer y regresar a la cmara de disolvente, va separando los
compuestos hasta que se llega a una concentracin deseada. Esto puede ocasionar
problemas con algunos compuestos, que con los ciclos llevan a la ruptura del baln, como
lo es en la extraccin del mbar.
Referencias:

1. buzo / agitador / granallas o esferas.


2. baln.
3. brazo para ascenso del vapor.
4. cartucho de extraccin o cartucho Soxhlet.
5. muestra (residuo).
6. entrada del sifn.
7. descarga del sifn.
8. adaptador.
9. refrigerante (condensador).
10. entrada de agua de refrigeracin.
11. salida de agua de refrigeracin.

MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales:

1 extractor soxhlet
1 soporte universal
1 aro mediano con nuez
1 plancha de calentamiento
1 embudo de decantacin de 250 ml
1 matraz redondo de 500 ml
1 refrigerante a reflujo dotado de sus 2 gomas para conexin a red de agua y desage.
Un vidrio de reloj
Balanza analtica
Tijera
Engrampado
Una esptula
Papel de filtro
Reactivos:

ter de petrleo1L (60-80).


Muestra vegetal

Lechuga de mar Ulva lactuca

PROCEDIMIENTO

1. Obtenida la lechuga de mar se procede a secar y moler hasta que este finamente
pulverizado (ver imagen), luego se procede a pesar.
2. Se arma un cartucho de papel filtro y se engrampa como se muestra en la imagen 2.
3. El alga pesada se coloca en un cartucho y se cubre con algodn.
4. Se monta el equipo soxhlet, pero sin reflujo (ver imagen).
5. El cartucho se coloca en la pieza media del dispositivo de extraccin Soxhlet o
compartimento de muestra.
6. Se llena por la parte de arriba del soxhlet con una cantidad suficiente de disolvente ter
de petrleo.
7. Se procede entonces a completar el montaje del dispositivo de extraccin.
8. La parte superior del reflujo se tapona con desecante (sulfato sdico anhidrido) envuelto
en algodn para evitar la entrada y condensacin de vapor de agua.
9. Tras el montaje se pone en marcha la cocinilla y se regula el caudal de agua del reflujo.
10. El ter, una vez que alcanza su temperatura de ebullicin, se evapora y llega al
refrigerante condensndose y cayendo en el compartimento del cartucho de muestra.
11. Durante el proceso de extraccin hacemos prueba de grasas: con una pipeta extraemos
ter de petrleo y dejamos caer unas gotas a un portaobjeto, si al evaporarse el ter de
petrleo a temperatura ambiente se observa que queda un residuo grasoso nos da a
entender que an no culmina la extraccin de grasas. Si por el contrario se evapora
completamente daremos por finalizado.
12. Cuando el ter deja de hervir, se quita el Soxhlet con cuidado y se extrae el cartucho.
13. Se vuelve a colocar el dispositivo para calentar el matraz redondo y, cuando est el
Soxhlet bastante lleno, pero antes de que sifone, se procede de forma anloga a
anteriormente para recolectar el ter de la parte intermedia en un recipiente
debidamente etiquetado.Repetir este proceso una segunda vez hasta que la cantidad
de ter en el matraz redondo sea muy poca.
14. Apagar la cocinilla y dejar que enfre el baln y luego pesarlo para comparar el peso que
tubo antes de iniciar la extraccin.
ATENCIN:

El ter es un disolvente muy voltil y muy inflamable. Adems, tiene efectos


narcticos, por lo que se debe manejar obligatoriamente debajo de la campana con el
motor del extractor en marcha. El montaje completo se ubicar en la campana. El
Soxhlet es una pieza delicada por lo que se manipular con especial cuidado, sin hacer
fuerza en los tubos finos de vidrio.
Un reflujo no se deja nunca slo en el laboratorio, debido a la peligrosidad de los
disolventes. Tambin pueden ocurrir, por ejemplo, subidas de presin del agua de la
red y que se suelten los tubos. Por lo tanto, tendr que haber siempre una persona a
cargo del reflujo (se puede encargar de los dos reflujos a la vez).

RESULTADOS

1. Peso del cartucho: 4.14 gramos.


2. Pesar una porcin de lechuga de mar previamente secada: 15.36 gramos.
3. Cartucho ms muestra de lechuga de mar seca: 19.5 gramos.
4. Baln ms tmara: 250.13 gramos.
5. Baln ms tmara ms grasas: 250.27 gramos.

Hallamos el peso de la grasa

- Baln + tmara : 250.13 gr


- Baln + tmara + grasas: 250.27 gramos

250.27gr 25.13gr = 0.14 gr en muestra seca


Porcentaje de grasa

- Muestra (cartucho, grapas y algodn): 20.23gr

20.23gr 5.08gr 0.14gr = 15.01gr de peso de la


grasa sin humedad

15.36 --------------100%

0.14---------------X%

X%= 0.9114%

Supuesto de grasa

15.36gr 15.01gr = 0.35 gr

Porcentaje de humedad

12.3%-----------------------100gr

X%----------------------15.36gr

X% = 1.889%

Peso sin humedad

15.36 0.14 = 15.22

15.22 15.01 = 0.21

- 15.36 x 1.889(1/100) = 0.24 gr

15.35 0.29 = 15.07


Montaje del quipo de extraccin de Cartucho colocado en la pieza media
Soxhlet. del dispositivo de extraccin Soxhlet.

Equipo de extraccin Soxhlet en Cartucho dejando secar


funcionamiento.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:
1. Planta piloto de ciencia y tecnologa de los alimentos. Anlisis de protenas.
Universidad de Zaragoza. Disponible en:
http://ppcta.unizar.es/Videos%20y%20otros/Documentos/PRACTICAS_ANALIS
IS/PRACTICA%204%20%20Determinacion%20de%20Proteinas.pdf
2. Eva Garca M.,Isael Fernandez S. Determinacin de las protenas de un
alimento por el mtodo Kjeldahl.Universidad politcnica de Valencia. Disponible
en:
https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/16338/Determinaci%C3%B3n%20
de%20proteinas.pdf?sequence=1
3. Roxana V., Anlisis del contenido de protenas en un alimento. 2016.
Disponible en:
http://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/124179/mod_resource/conte
nt/3/QA-2016-PROTEINAS-METODOS.pdf
4. http://www.qb.uson.mx/PISSA/frames/hojas/ETER%20DE%20PETROLEO.pdf
5. http://avalon.utadeo.edu.co/comunidades/estudiantes/ciencias_basicas/analitica_inst
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6. http://www.ispch.cl/lab_amb/met_analitico/doc/ambiente%20pdf/GrasSoxhlet.pdf
7. https://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/TAQ/curso0405/TAQP5_0405.p
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