Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
PROTEIN REKOMBINAN
6.1 PENDAHULUAN
Protein adalah bahan yang paling penting dari semua bahan yang membentuk organisme
hidup. Protein terkandung dalam setiap sel hidup pada semua organisme, tanpa pengecualian,
dan di dalam sel, protein berada dalam jumlah yang sangat banyak dengan berbagai bentuk
atau jenis. Semua karakteristik dari organisme ditentukan oleh aktivitas protein.
6.3 DEFINISI
Rekombinan protein adalah suatu bentuk manipulasi dari protein, yang dihasilkan dalam
berbagai cara untuk menghasilkan sejumlah besar protein, memodifikasi urutan gen dan
memproduksi produk komersial yang bermanfaat. Pembentukan protein rekombinan
dilakukan melalui perantara khusus yang dikenal sebagai vector. Teknologi rekombinan
adalah proses yang terlibat dalam pembentukan protein rekombinan.
69
6.3.1 Rekombinasi
Rekombinasi adalah suatu proses dimana suatu progeny (keturunan) dikembangkan menjadi
kombinasi gen-gen yang berbeda dari gen-gen kedua orang tua nya, yang menghasilkan satu
set DNA baru.
Ditunjukkan pada gambar 6.1 adalah proses dari rekombinasi protein, diadaptasi dari
artikel dari Pusat Informasi Nasional Bioteknologi (NCBI).
Istilah protein digunakan karena protein adalah struktur yang mendukung DNA dan
merupakan blok bangunan materi hidup. Digunakan istilah DNA rekombinan untuk
menggambarkan urutan DNA baru yang telah dihasilkan dari rekombinasi gen dari kedua
orang tuanya. Proses rekombinan tersebut menjadi landasan terhadap kejadian evolusi dari
makhluk hidup.
70
dari babi, dimana mirip dengan manusia tetapi tidak persis sama, sekarang dapat memiliki
insulin dari manusia yang pada saat ini telah dapat diproduksi oleh bakteri. Penderita
hemophilia dapat menggunakan faktor pembekuan yang telah diproduksi dalam susu
kambing. Sementara ilmu pengetahuan yang kompleks, dapat diuraikan ke dalam konsep
yang lebih sederhana.
71
basa-basa panjang tetapi urutan dari Ts, Cs, As dan Gs yang membuat kita mempunyai
perbedaan satu dengan yang lainnya.
72
ekspresi bakteri tidak cocok jika modifikasi pasca-translasi diperlukan untuk menghasilkan
produk rekombinan yang dapat berfungsi penuh.
Lokasi produk dalam host akan mempengaruhi pilihan metode untuk isolasi dan
pemurnian dari produk. Sebagai contoh, sebuah host bakteri dapat mensekresikan protein ke
dalam media pertumbuhan, mentransportnya ke dalam ruang periplasmik atau menyimpannya
sebagai badan inklusi yang tidak dapat larut dalam sitoplasma.
Pathogenic
Mammalian cells Same biological activity as native proteins Cells can be difficult and expensive to grow
Mammalian expression vectors available Cells grow slowly
Can be grown in large scale cultures Manipulated cells can be genetically unstable
Low productivity as compared to micro-organisms
Yeasts Lacks detectable endotoxins Gene expression less easily controlled
Generally Regarded As Safe (GRAS) Glycosylation not identical to mammalian systems
Fermentation relatively inexpensive
Facilitates glycosylation and formation of
disulphide bonds
Only 0.5% native proteins are secreted so
isolation of secreted product is simplified
Well established large scale production and
downstream processing
Cultured insect cells Many processing mechanisms similar to Lack of information on glycosylation mechanisms
Baculovirus vector eukaryotic cells
Safe, since few arthropods are adequate hosts Product not always fully functional
for baculovirus
Baculovirus vector received FDA approval for Few differences in functional and antigenic properties
a clinical trial between product and native protein
Virus stops host protein amplification. High
level expression of product
73
Tabel 6.1. (Lanjutan) Keuntungan dan kerugian pemilihan host
Host Advantages Disadvantages
Well established systems for
Fungi High level of expression not yet achieved
fermentation
e.g.Aspergillus sp. of filamentous fungi
Growth inexpensive Genetics not well characterized
A.niger is GRAS No cloning vectors available
Can secrete large quantities of product into growth
media, source of many industrial enzymes
Plants Low transformation efficiency
Long generation time
Table 6.2. Memberikan tinjauan beberapa fitur amplifikasi fusi protein yang dapat
mempengaruhi pilihan terakhir dari vektor.
Advantages Disadvantages
Fusion proteins
Cell compartments can be targeted Tag may interfere with protein structure and
affect folding and biological activity
Provide a marker for expression Cleavage site is not always 100% specific if tag
needs to be removed
Simple purification using affinity chromatography
under denaturing or non-denaturing conditions
Easy detection
74
Refolding achievable on a chromatography column
Ideal for secreted proteins as the product is easily
isolated from the growth media
Non- fusion proteins
No cleavage steps necessary Purification and detection not as simple
Problems with solubility may be difficult to overcome,
reducing potential yield
75
6.4.8 Pilihan tag fusi
Dua tag yang paling sering digunakan adalah glutathione S-transferase (GST tag) dan 6 x
residu histidine (His)6 tag. Adapun pemilihan dari host dan vector, keputusan untuk
menggunakan baik GST atau (His)6 tag harus dibuat sesuai dengan kebutuhan aplikasi
spesifik
Tabel 6.5. Menyoroti beberapa fitur kunci dari tag yang harus dipertimbangkan.
GST tag (His)6 tag
Can be used in any expression system Can be used in any expression system
Purification procedure gives high yields of pure
Purification procedure gives high yields of pure product
product
Selection of purification products available for any
Selection of purification products available for any scale
scale
pGEX6P PreScission protease vectors enable cleavage Small tag may not need to be removed e.g. tag is
and poorly
purification in a single step immunogenic so fusion partner can be used directly as
an antigen in antibody production
Site-specific proteases enable cleavage of tag if
Site-specific proteases enable cleavage of tag if required
required.
N.B. Enterokinase sites that enable tag cleavage
without leaving behind extra amino acids are
preferable
GST tag easily detected using an enzyme assay or (His)6 tag easily detected using an immunoassay
an immunoassay
Simple purification. Very mild elution conditions Simple purification, but elution conditions are not as
minimize risk of damage to functionality and mild as for GST fusion proteins. Purification can be
antigenicity of target protein performed under denaturing conditions if required.
N.B. Neutral pH but imidazole may cause
precipitation
Desalting to remove imidazole may be necessary
GST tag can help stabilize folding of recombinant
proteins (His)6 - dihydrofolate reductase tag stabilizes small
peptides during expression
Fusion proteins form dimers Small tag is less likely to interfere with structure and
function of fusion partner
Mass determination by mass spectrometry not always
accurate for some (His)6 fusion proteins*
76
6.4.9 Penanganan badan inklusi
Amplifikasi sering dapat dikendalikan sehingga protein rekombinan terakumulasi dalam
ruang intraseluler atau disekresikan ke dalam ruang periplasmik. Sedangkan sekresi
menguntungkan dari segi protein folding, kelarutan dan oksidasi sistein, hasilnya umumnya
jauh lebih tinggi bila menggunakan ekspresi intraseluler.
Namun demikian, protein rekombinan yang terakumulasi intrasel sering diatur dalam
bentuk badan inklusi, agregat terlarut dari protein yang berkurang aktivitas biologisnya. Jadi,
sementara kehadiran badan inklusi dapat membuat langkah awal dari isolasi menjadi sangat
sederhana, isolasi protein dari badan inklusi sering menyebabkan kesulitan dengan lipat-
ulang dari protein, mengembalikan reformasi yang benar dari ikatan disulfide dan dengan
demikian terjadi pemulihan penuh aktivitas biologis.
Tabel 6.6. Merangkum keuntungan dan kerugian dari bekerja dengan produk rekombinan
yang dinyatakan sebagai badan inklusi.
Advantages Disadvantages
High expression levels can reduce fermentation costs Re-folding shifts difficulties and costs downstream
Cytoplasmic proteins are easily washed away Minor contaminants are often hydrophobic, poorly
soluble membrane proteins and cell wall fragments
Major contaminants are oligomers and misfolded Can be difficult to separate multiple forms of the
or proteolyzed forms of the protein same protein
pL promoter with T induction often yields protein If the protein does not fold well, another expression
where other systems fail system will be needed
6.5 APLIKASI
Proses rekombinan protein digunakan untuk berbagai tujuan penelitian secara komersial,
medis dan ilmiah. Dapat juga digunakan pada peternakan secara komersial untuk melawan
penyakit pada ternak serta tanaman.
Rekombinan protein mempunyai peran besar dalam penciptaan bahan terapeutik yang
dapat memodifikasi dan memperbaiki kesalahan genetik, menghancurkan sel-sel kanker,
mengobati gangguan system kekebalan tubuh, dan masih banyak fungsi-fungsi lainnya.
77
Sebagai contoh, Erythropoietin, sebuah protein hormone yang diproduksi dengan teknologi
rekombinan dapat digunakan dalam merawat pasien dengan kekurangan/defisiensi eritrosit,
yang merupakan penyebab umum dari komplikasi ginjal.
Ada bidang medis yang disebut farmakologi rekombinan, dimana rekombinan protein
digunakan untuk memproduksi pengobatan DNA yang diturunkan seperti interleukins; yang
mengatur sel T, hormon pertumbuhan; digunakan untuk merangsang pertumbuhan,
eritropoietin; yang merangsang produksi sel darah merah dalam sumsum tulang, dan insulin;
digunakan untuk mengobati diabetes tipe 1. Protein rekombinan juga dapat digunakan di
laboratorium sains untuk penelitian stem cell dan penelitian kloning.
Di masa depan bioteknologi dapat menimbulkan peningkatan perkembangan dari
organ manusia di laboratorium dan produksi dari tanaman yang dapat menghasilkan pestisida
sendiri. Meskipun masih banyak perdebatan etis dan pertanyaan, teknologi rekombinan
memiliki potensi untuk merevolusi produksi pangan, perawatan kesehatan dan proses
penuaan.
Protein Rekombinan di mulai dari pertama kali saat Insulin diproduksi oleh E. coli
oleh Herbert Boyer di San Fransisco Amerika dibawah perusahaan Genentech Inc 1978.
Peristiwa ini begitu mengagetkan dunia karena dengan keberhasilan produksi protein
rekombinan tersebut merubah sebagian besar peta industri di dunia.
Bayangkan sebelum dapat diproduksi oleh E. coli insulin didapatkan dengan cara
membantai sekian ribu sapi dan babi, proses penjagalannya pun harus khusus demi menjamin
kualitas insulin yang akan disolasi dari hewan ternak tersebut. Dengan keberhasilannya
diproduksi pada E. coli maka ini akan mengurangi biaya produksi Insulin menjadi jauh
dibawah prediksi sebelumnya.
Escherichia coli adalah mikroorganisme yang paling terkait dengan berbagai bidang
bioteknologi karena bakteri inilah organisme pertama yang dipelajari secara lengkap baik dari
sisi metabolismenya, fisiologinya, regulasi genetikanya bahkan sampai sequence genomnya.
Bukan hanya karena kemudahannya untuk di manipulasi akibat lengkapnya informasi tentang
E.Coli melainkan juga karena kemudahannya untuk di kulturkan dan cepatnya proses
pertumbuhannya berlangsung dibandingkan dengan berbagai macam organisme yang lain.
Oleh karena itu E. Coli mendapatkan kehormatan menjadi organisme model yang cukup
penting dalam dunia protein rekombinan.
Proses regulasi gen yang telah lengkap dipelajari dan telah banyak dimanipulasi telah
menyebabkan E. coli menjadi organisme model yang paling banyak mempunyai variasi
pilihan untuk dijadikan host dalam proses produksi protein rekombinan
78
6.6 INSULIN REKOMBINAN
Para peneliti membuat insulin manusia rekombinan dengan struktur yang identik
denganinsulin manusia menggunakan vektor bakteri E. coli yang telah dilemahkan.
Gambar 6.3. Bakteri Escherichia coli yang digunakan sebagai hospes pembuatan protein
rekombinan
6.6.1 Bakteri Gram negatif, E. coli, penghuni alami saluran pencernaan manusia
Sejak Banting dan Best menemukan hormon insulin pada tahun 1921, pasien diabetes
mellitus yang mengalami peningkatan kadar gula darah disebabkan gangguan produksi
insulin, telah diterapi dengan menggunakan insulin yang berasal dari kelenjar pankreas
hewan.
Meskipun insulin sapi dan babi mirip dengan insulin manusia, namun komposisinya
sedikit berbeda. Akibatnya, sejumlah sistem kekebalan tubuh pasien menghasilkan antibodi
terhadap insulin babi dan sapi yang berusaha menetralkan dan mengakibatkan respon
inflamasi pada tempat injeksi. Selain itu efek samping dari insulin sapi dan babi ini adalah
kekhawatiran adanya komplikasi jangka panjang dari injeksi zat asing yang rutin.
Faktor-faktor ini menyebabkan peneliti mempertimbangkan untuk membuat Humulin dengan
memasukkan gen insulin ke dalam vektor yang cocok, yaitu sel bakteri E. coli, untuk
memproduksi insulin yang secara kimia identik dan dapat secara alami diproduksi. Hal ini
telah dicapai dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan.
79
6.6.2 Struktur insulin
Secara kimia, insulin adalah protein kecil sederhana yang terdiri dari 51 asam amino, 30 di
antaranya merupakan satu rantai polipeptida, dan 21 lainnya yang membentuk rantai kedua.
Kedua rantai dihubungkan oleh ikatan disulfida.
Kode genetik untuk insulin ditemukan dalam DNA di bagian atas lengan pendek dari
kromosom kesebelas yang berisi 153 basa nitrogen (63 dalam rantai A dan 90 dalam rantai
B). DNA yang membentuk kromosom, terdiri dari dua heliks terjalin yang dibentuk dari
rantai nukleotida, masing-masing terdiri dari gula deoksiribosa, fosfat dan nitrogen. Ada
empat basa nitrogen yang berbeda yaitu adenin, timin, sitosin dan guanin. Sintesis protein
tertentu seperti insulin ditentukan oleh urutan dasar tersebut yang diulang.
80
Gambar 6.5. Skema pembuatan insulin rekombinan
Enzim restriksi secara alami diproduksi oleh bakteri. Enzim restriksi bertindak seperti
pisau bedah biologi, hanya mengenali rangkaian nukleotida tertentu, misal salah satunya
rangkaian kode untuk insulin. Hal tersebut memungkinkan peneliti untuk memutuskan
pasangan basa nitrogen tertentu dan menghapus bagian DNA yang berisi kode genetik dari
kromosom sebuah organisme sehingga dapat memproduksi insulin. Sedangkan DNA ligase
adalah suatu enzim yang berfungsi sebagai perekat genetik dan pengelas ujung nukleotida.
81
Langkah pertama pembuatan humulin adalah mensintesis rantai DNA yang membawa
sekuens nukleotida spesifik yang sesuai karakteristik rantai polipeptida A dan B dari insulin.
Urutan DNA yang diperlukan dapat ditentukan karena komposisi asam amino dari kedua
rantai telah dipetakan. Enam puluh tiga nukleotida yang diperlukan untuk mensintesis rantai
A dan sembilan puluh untuk rantai B, ditambah kodon pada akhir setiap rantai yang
menandakan pengakhiran sintesis protein.
Antikodon menggabungkan asam amino, metionin, kemudian ditempatkan di setiap
awal rantai yang memungkinkan pemindahan protein insulin dari asam amino sel bakteri itu.
Gen sintetik rantai A dan B kemudian secara terpisah dimasukkan ke dalam gen untuk
enzim bakteri, B-galaktosidase, yang dibawa dalam plasmid vektor tersebut. Pada tahap ini,
sangat penting untuk memastikan bahwa kodon gen sintetik kompatibel dengan B-
galaktosidase. Plasmid rekombinan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam sel E. coli.
82
6.8. Skema pembentukan insulin rekombinan pada kultur E. coli
Protein yang terbentuk, sebagian terdiri dari B-galaktosidase, bergabung ke salah satu
rantai insulin A atau B. Rantai insulin A dan rantai B kemudian diekstraksi dari fragmen B-
galaktosidase dan dimurnikan.
Gambar 6.9. Struktur beta galaktosidase rantai A dan rantai B yang telah dimurnikan
Gambar 6.10. ikatan disulfida yang terbentuk pada dua rantai protein insulin A dan B
83
6.6.4 Implikasi biologis dari rekayasa genetika Humulin rekombinan
Humulin merupakan protein hewani yang dibuat dari bakteri sedemikian rupa sehingga
strukturnya benar-benar identik dengan molekul alami. Hal ini akan mengurangi
kemungkinan komplikasi yang disebabkan produksi antibodi oleh tubuh manusia. Dalam
studi kimia dan farmakologi, insulin rekombinan DNA manusia yang diproduksi secara
komersil telah terbukti bisa dibedakan dari insulin pankreas manusia.
Awalnya, kesulitan utama yang dihadapi adalah kontaminasi produk akhir oleh sel
inang, sehingga meningkatkan resiko kontaminasi dalam kaldu fermentasi. Bahaya ini diatasi
dengan ditemukannya proses pemurnian. Ketika dilakukan tes pada produk akhir insulin,
termasuk teknik terbaik radio-immuno assay, tidak ada kotoran yang terdeteksi.
Seluruh prosedur, sekarang dilakukan dengan menggunakan sel ragi sebagai media
pertumbuhan, karena sel ragi dapat menghasilkan sebuah molekul insulin manusia yang
hampir lengkap dengan struktur tiga dimensi yang sempurna. Ini meminimalkan kebutuhan
untuk prosedur pemurnian kompleks dan mahal.
6.8. REFERENSI
1. Anonim, The Recombinant Protein Handbook, Protein Amplification and Simple Purification,
Edition AA, Amersham Pharmacia Biotech, page 6-8; 57
2. http://www.dnassequencing.com/category/recombinant-protein-images/
3. Kayser, O., dan Muller, R.H. (2004). Pharmaceutical Biotechnology; Drug Discovery and
Clinical Applications. Willey-VCH: German.
4. Production of Recombinant Protein, http://www.ehow.com/about_5366348_production-
recombinant-protein.html
5. Recombinant Protein Definition, http://www.ehow.com/about_5407160_recombinant-protein-
definition.html
6. Sudjadi. (2008). Bioteknologi Kesehatan. Kanisius: Yogyakarta. 151-178.
7. What Are Recombinant Proteins?, http://www.ehow.com/info_8131260_recombinant-
proteins.html
85