PROTOCOLO DE VALIDACION DE EFICACIA ANTIMICROBIANA

DE CONSERVANTES

1. OBJETIVO

2. ALCANCE

3. RESPONSABILIDADES

4. EQUIPOS Y MATERIALES A UTILIZAR

5. METODOLOGA DE VALIDACIN
1. OBJETIVO:

Demostrar mediante evidencia documentada que la metodologa para evaluar la eficacia

antimicrobiana de los conservantes presentes en productos farmacuticos, est totalmente
bajo control y proporciona de forma consistente y reproducible resultados que cumplen las
especificaciones establecidas.

2. ALCANCE:

Este protocolo se utilizar para la validacin de la eficacia antimicrobiana en ungentos

oftalmicos

3. RESPONSABILIDAD:

3.1. Analista de Microbiologa, es responsable de Disear, planificar, desarrollar, registrar

datos y de preparar el reporte de validacin, adjuntando toda la documentacin
pertinente.
3.2. Jefe de Control de Calidad, es responsable de vigilar la correcta ejecucin de la
validacin
3.3. Jefe de Validaciones, es el responsable de mantener vigente la calificacin de los
equipos y calibracin de los instrumentos de medicin utilizados en la validacin.
3.4. Jefe de Aseguramiento de la Calidad es el encargado de la coordinacin de las
actividades que genere la validacin, as como de colaborar en la revisin de la
documentacin propia del proceso de validacin.
3.5. El Director Tcnico es responsable de la aprobacin del Reporte Final de la Validacin
y de darlo a conocer a los involucrados.
4. EQUIPOS Y MATERIALES A UTILIZAR

4.1. Equipos

FECHA
NOMBRE MARCA CDIGO
CALIBRACIN
Cabina de bioseguridad
Balanza Analtica
Bao Mara
Estufa de Incubacin
Autoclave
Refrigeradora de 2-8C
Espectrofotmetro

4.2. Materiales de vidrio y accesorios

FECHA
NOMBRE MARCA CDIGO
CALIBRACIN

4.3. Material de referencia, producto y activos

FECHA
NOMBRE MARCA LOTE/PROTOCOLO
VENCIMIENTO

4.4. Medios de Cultivo, reactivos y excipientes

FECHA
NOMBRE MARCA LOTE
VENCIMIENTO
5. METODOLOGA DE VALIDACIN:

5.1. Consideraciones Generales

a) Debe establecerse la capacidad promotora del crecimiento de los medios usados en
este procedimiento.
b) Se debe disponer de un mtodo de recuento de microorganismos validado

5.2. Referencias:

Validacin de Mtodos Analticos AEFI 2001: Adaptado de Eficacia de la

conservacin antimicrobiana. Pag. 187
USP 39: Adaptado de <51> Prueba de eficacia antimicrobiana. Pag. 119-122.
JP XIV: Adaptado de <12> Conservantes Pruebas de efectividad. Pag. 1321-
1323.

5.3. Preparacin de la cepa de prueba

5.3.1.
Usar suspensiones estandarizadas de cepas de prueba o preparar segn se indica a
continuacin. Las tcnicas de mantenimiento de cultivos de lote de siembra
(sistemas de lote de siembra) se usan para que los microorganismos viables
empleados para inoculacin correspondan a no ms de cinco pasajes desde el lote
de siembra maestro original. Cultivar por separado cada cepa bacteriana y fngica
de prueba (ver la Tabla 2).

Usar los cultivos de los siguientes microorganismos:Candida albicans (ATCC N

10231 ), Aspergiflus brasiliensis (ATCC N 16404), Escherichia coli (ATCC N
8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC N 9027) y Staphylococcus aureus
(ATCC N 6538). Los microorganismos viables empleados en el procedimiento
deben formar parte de un cultivo de crecimiento reciente (p.ej., en fase logartmica
de crecimiento) a excepcin de las esporas A. brasiliensis. Se describen las
condiciones de cultivo para el inculo (ver la Tabla 2) donde los medios adecuados
son el Agar Digerido de Casena y Soja o Medio de Agar Sabouraud Dextrosa.

Para cosechar los cultivos bacterianos y de C. albicans, emplear solucin salina

SR estril, lavar la superficie de crecimiento y recogerlo en un recipiente
adecuado. Para cosechar las esporas de A. brasiliensis, usar solucin salina SR
estril que contenga 0,05% de polisorbato 80. La suspensin de esporas debe
tratarse aspticamente (p.ej., filtracin a travs de lana de vidrio estril) para
eliminar hitas. Todas las suspensiones microbianas deben prepararse para
garantizar que no se produce un traslado de medio de crecimiento residual del
inculo (p.ej., centrifugacin seguida de resuspensin en un lquido de suspensin
estril apropiado).

Como alternativa, los organismos del cultivo madre pueden crecer en un medio
lquido adecuado (es decir, Caldo Digerido de Casena y Soja o Caldo Sabouraud
Dextrosa) y las clulas se pueden cosechar mediante centrifugacin, luego lavar y
 resuspender en lquido de suspensin estril apropiado. Las suspensiones
microbianas que se usan para inoculaciones deben ajustarse para obtener un
recuento microbiano de aproximadamente 1 x 108 ufc/ml. Usar las suspensiones
bacterianas y de levaduras dentro de las 2 horas o dentro de las 24 horas, si se
almacenan entre 2 y 8. Se puede preparar una suspensin de esporas estable y
mantenerla a 2-8 hasta 7 das. [NOTE-El clculo estimado de la concentracin
del inculo se puede obtener mediante procedimientos turbidimtricos para los
microorganismos de desafo y luego confirmarse mediante un recuento en placa.]

5.1. Promocin de Crecimiento

Los medios usados en este procedimiento deben ser capaces de permitir el crecimiento
microbiano. Analizar cada partida de medio listo para usar y cada partida de medio
preparado a partir de medio deshidratado o de los ingredientes descritos.

Para medios slidos, los recuentos obtenidos deben ser al menos 50% del valor
calculado para un inculo estandarizado.

Para un inculo recientemente preparado, se produce un crecimiento de

microorganismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio
analizada y aprobada previamente.

5.2. Prueba de Aptitud del Mtodo

Preparar una dilucin 10-1 (en volumen) agregando 1 mL del producto a 9 mL de
solucin salina u otro diluyente neutralizante. Continuar este patrn de dilucin hasta
niveles de dilucin 10-2 y 10-3. Agregar un nmero apropiado de organismos de
desafo a cada tubo de producto diluido, mezclar y sembrar en placa un volumen
adecuado de cada dilucin para obtener (idealmente entre 8 y 80 ufc). Esta siembra en
placa debe realizarse como mnimo por duplicado (aunque un nmero mayor de
repeticiones puede ser til para minimizar la variabilidad en la estimacin del recuento
en placa). Se realiza un control positivo de este procedimiento al introducir los mismos
inculos en solucin salina y transferir volmenes similares de solucin salina a placas
de agar. Un patrn de recuperacin adecuado es aqul que proporciona al menos 50%
del recuento de esta solucin salina de control (promediado).

Si el producto diluido presenta propiedades antimicrobianas, quizs deban incorporarse

neutralizadores especficos a los diluyentes o a los medios de recuperacin. Para ms
informacin, ver Validacin de Recuperacin Microbiana en Artculos Farmacopeicos
(1227).

La capacidad del procedimiento para medir la eficacia de los conservantes puede verse
comprometida si la aptitud del mtodo requiere una dilucin significativa (10-2 10-
3), ya que esto afectar la recuperacin medida (p.ej., puede ser difcil medir una
reduccin logartmica de 3 unidades para un inculo de 1QL106). Si no se encuentra
un agente neutralizador o mtodo adecuado y la aptitud del mtodo requiere una
dilucin significativa, se puede usar un nivel ms alto de inculo (p.ej., 107-1 os) de
manera que se pueda medir una reduccin logartmica de 3 unidades. El promedio de
 la recuperacin informada no puede ser menos de 1 ufc/placa (o 100 ufc/mL si se
realiza el recuento en placa de 1 mL por duplicado a una dilucin de 1 0-2).
La filtracin por membrana se puede usar para filtrar volmenes ms grandes de
diluciones para contrarrestar esta dificultad o para asistir en la neutralizacin de las
propiedades antimicrobianas.

5.3. Anlisis del producto

5.3.1.1. Preparacin del inculo

El procedimiento puede realizarse ya sea en cinco envases originales, si hay

suficiente volumen de producto disponible en cada envase y si el envase del
producto puede ser penetrado aspticamente (es decir, aguja y jeringa a travs de
un tapn de goma elastomrico), o en cinco recipientes bacteriolgicos estriles
con tapa [inerte con respecto a los agentes antimicrobianos] de tamao adecuado
a los que se ha transferido un volumen suficiente de producto. Inocular cada
envase o recipiente, segn corresponda, con uno de los inculos preparados y
normalizados, y mezclar. El volumen de suspensin del inculo empleado est
entre 0,5% y 1,0% del volumen del producto para minimizar los efectos
potenciales en el producto. La concentracin de microorganismos de prueba
agregados al producto (Categora 1; 2 3) es tal que la concentracin final de la
preparacin de prueba despus de la inoculacin est comprendida entre 1 x 105
y 1 x 1 Q6 ufc/mL del producto. En los productos de la Categora 4 (anticidos),
la concentracin final de la preparacin de prueba despus de la inoculacin est
comprendida entre 1 x 103 y 1 x 104 ufc/mL del producto.

La concentracin inicial de microorganismos viables en cada preparacin de

prueba se calcula a partir de la concentracin de microorganismos en cada
inculo normalizado determinada mediante el mtodo de recuento en placa.
Incubar los envases o recipientes inoculados a 22,5 2,5. Tomar muestras de
cada uno de ellos en los intervalos apropiados (especificados en la Tabla 3).
Registrar todos los cambios de apariencia observados en estos intervalos.
Determinar mediante el procedimiento de recuento en placa el nmero de ufc
presentes en cada preparacin de prueba en los intervalos correspondientes (ver
Procedimientos Generales en Pruebas de Recuento Microbiano (61 )). El
recuento en placa se realizar usando un mnimo de placas por duplicado, con el
nmero de ufc promediado antes de la determinacin de ufc/mL deducido. Si se
usa filtracin por membrana, usar filtros de membrana por duplicado para cada
estimacin. Usando las concentraciones calculadas de ufc/rnL presentes al inicio
de la prueba, calcular el cambio en valores log10 de la concentracin de ufc/mL
para cada microorganismo en los intervalos de prueba aplicables, y expresar los
cambios en la concentracin en trminos de reducciones logartmicas. La
reduccin logartmica se define como la diferencia entre el valor de la
concentracin inicial de ufc/mL en la suspensin, en unidades log1QI y el valor
de ufc/mL, en unidades log1QI de los sobrevivientes al tiempo correspondiente..