INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA

EN INGENIERA Y TECNOLOGAS AVANZADAS

UPIITA

BIOSENSOR DE CELDA MICROFLUDICA PARA

ESPECTROSCOPIA DE RESONANCIA DE PLASMONES
SUPERFICIALES

Para obtener el Ttulo de

Trabajo Terminal

Ingeniero en Binica

Presentan los alumnos:

Benitez Murrieta Norma Josselyne

Snchez Meza Angel

Asesores:
Dra. Yesenia Eleonor Gonzlez Navarro

Dr. Norberto Hernndez Como

M x i c o D. F., a 1 de Junio del 2017

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA
EN INGENIERA Y TECNOLOGAS AVANZADAS

UPIITA

BIOSENSOR DE CELDA MICROFLUDICA PARA

ESPECTROSCOPIA DE RESONANCIA DE PLASMONES
SUPERFICIALES

Trabajo Terminal
Para obtener el Ttulo de

Ingeniero en Binica
Presentan los alumnos:
Benitez Murrieta Norma Josselyne

Snchez Meza Angel

Sinodales

Dra. Yesenia Eleonor Gonzlez Dr. Norberto Hernndez Como

Navarro
Asesor

Dra. Lilia Martnez Prez Enrique Arturo Garca Tovar

Presidente
Asesor Secretario

M x i c o D. F., a 1 de Junio del 2017

1
ndice General

ndice General ............................................................................................................................. 2

ndice de Figuras ......................................................................................................................... 4
ndice de Grficas ....................................................................................................................... 6
ndice de Tablas........................................................................................................................... 6
Resumen. ...................................................................................................................................... 7
Abstract ........................................................................................................................................ 8
Glosario ........................................................................................................................................ 9
Captulo 1. Objetivos ................................................................................................................ 10
1.1 Objetivo General. .............................................................................................................. 10
1.2 Objetivos Especficos. ....................................................................................................... 10
Captulo 2. Introduccin. .......................................................................................................... 11
2.1 Antecedentes ..................................................................................................................... 12
2.2 Estado del Arte .................................................................................................................. 13
Captulo 3. Planteamiento del Problema................................................................................. 15
Captulo 4. Justificacin. .......................................................................................................... 16
4.1 Solucin Propuesta. ........................................................................................................... 17
Captulo 5. Marco terico ......................................................................................................... 18
5.1 Biosensores ....................................................................................................................... 18
5.1.1 Caractersticas de los biosensores .............................................................................. 18
5.1.2 Clasificacin de los biosensores ................................................................................. 19
5.1.3 Aplicaciones de los biosensores ................................................................................. 20
5.2 Tcnica de resonancia de plasmones superficiales............................................................ 21
5.2.1 Plasmn y plasmones superficiales ............................................................................ 21
5.2.3 Biosensor por Resonancia de Plasmones Superficiales.............................................. 21
5.3 Bases fsico-matemticas de la tcnica de Resonancia de Plasmones Superficiales ......... 23
5.3.1 Principio fsico del fenmeno de plasmones superficiales en una interfase............... 23
5.4 Anlisis el proceso de inmovilizacin de las protenas basado en la adsorcin molecular.
................................................................................................................................................. 26
5.5 Anlisis de la interaccin especfica del receptor biolgico con el analito ....................... 28
Captulo 6. Metodologa............................................................................................................ 30
6.1 Vidrio ptico .................................................................................................................... 30
6.2 Importancia de la pelcula delgada de metal en la tcnica de SPR ................................... 30
6.3 Tecnologa microfludica en el diseo del biosensor ........................................................ 32
6.4 Material de la celda microfludica ..................................................................................... 33

2
 6.4.1 PDMS (polydimethylsiloxane) ................................................................................... 33
6.4.2 PMMA (polymethylmethacrylate) ............................................................................. 33
6.4.3 Comparacin de PDMS y PMMA.............................................................................. 34
6.5 Deposito de Oro y Cromo sobre vidrio optico .................................................................. 35
6.5.1 Evaporacin trmica en vaco .................................................................................... 36
6.5.2 Evaporacin por calentamiento resistivo ................................................................... 37
6.5.3 Evaporacin por haz de electrones ............................................................................. 39
6.5.4 Pulverizacin Catdica o Sputtering .......................................................................... 39
6.5.5 Comparacin de tcnicas de depsito de metales para pelculas delgadas................. 41
6.6 Tcnicas de fabricacin de celda de flujo ......................................................................... 43
6.6.1 Fotolitografa .................................................................................................................. 43
6.6.1.1 Fotoresina positiva y negativa para fotolitografa ................................................... 44
6.6.1.2 Proceso de creacin de microcanales por fotolitografa .......................................... 45
6.6.2 Molde para estructura de celda de flujo ......................................................................... 46
6.7 Fabricacin de la celda microfludica de PDMS ............................................................... 46
Captulo 7. Desarrollo experimental........................................................................................ 48
7.1 Diseo del biosensor para ser compatible con el equipo de medicin de SPR. ................ 48
7.1.1 NanoSPR 6, Modelo 321 ............................................................................................ 48
7.1.2 Chip sensor comercial ................................................................................................ 49
7.2 Diseo de Celda de Flujo .................................................................................................. 49
7.3 Impresin 3D de molde para celda de flujo ...................................................................... 52
7.4 Creacin de microcanales mediante fotolitografa ............................................................ 53
7.5 Fabricacin de celda de flujo con PDMS .......................................................................... 61
7.6 Unin de celda de flujo de PDMS y superficie sensora .................................................... 64
7.7 Diagramas que resumen los procesos de fabricacin ........................................................ 67
7.7 Prueba y calibracin de chip sensor con diferentes concentraciones de sucrosa .............. 69
7.7.1 Ajuste de la celda microfludica en el equipo NanoSPR/321..................................... 69
7.7.2 Verificacin de conexin al equipo de computo ........................................................ 71
7.8 Calibracin de la celda microfludica................................................................................ 72
Captulo 8. Anlisis e interpretacin de resultados ................................................................ 74
Captulo 9. Conclusiones........................................................................................................... 88
Captulo 10. Recomendaciones y/o Sugerencias para investigaciones futuras. ................... 90
Bibliografa ................................................................................................................................ 91
Anexos A. Obtencin del vector de resonancia de plasmones superficiales ......................... 95
Anexos B. Software WinSpall 3.02 .......................................................................................... 97

3
ndice de Figuras
Figura 1. a) Campos elctricos generados en la interfase de metal-dielctrico ......................................... 22
Figura 2. Principio de deteccin de un sensor por SPR, el ngulo y la intensidad del lser reflejado cambia
si la molcula de inters se enlaza en el anticuerpo inmovilizado [16]. ..................................................... 22
Figura 3. Medicin del ngulo de SPR por barrido del ngulo de incidencia. ............................................. 23
Figura 4. Vector de onda de un fotn incidente desde un dielctrico junto con vector de propagacin de
un plasmn superficial entre la interfase del dielctrico y un metal [13]. .................................................. 24
Figura 5. Representacin esquemtica de la configuracin de Krestschemann, mostrando la excitacin de
la SPR por medio de un haz de electrones [14]. .......................................................................................... 25
Figura 6. Vector de onda de un fotn incidente desde un junto con vector de propagacin de un plasmn
superficial que se propagan entre el metal y el dielctrico de ndice de refraccin menor al del prisma
[13]. ............................................................................................................................................................ 25
Figura 7. Enzimas inmovilizadas en un soporte fsico. A) Por absorcin, la regin positiva de la protena
interacta con el soporte negativo [16]. ................................................................................................... 27
Figura 8. Esquema de una SAM sobre un sustrato, orientada 30, A) Grupo terminal funcional: Distintos
grupos qumicos que determina las propiedades superficiales para la inmovilizacin de los anticuerpos,
B)Cadena hidrocarbonada que regula el espesor, es una barrera fsica y altera la conductividad
electrnica, C) Ligando con alta afinidad por el sustrato y que estabiliza la superficie. D) Sustrato [11]. . 28
Figura 9. Unin de receptor biolgico con el analito por medio de enlaces no covalentes [21]................. 29
Figura 10. Angulo de SPR en relacin con la Reflectividad [13].................................................................. 31
Figura 11. Vidrio ptico con pelcula de Cr y Au. ........................................................................................ 36
Figura 12. . Deposicin a partir de evaporacin trmica [38]. ................................................................... 37
Figura 13. . Soportes de calentamiento resistivo: a) Filamento, b) Banda metlica y c) Crisol [38]. .......... 38
Figura 14. . Evaporacin por haz de electrones [39]. ................................................................................. 39
Figura 15 . Proceso de pulverizacin catdica [38]. ................................................................................... 40
Figura 16. . Patrn generado a partir de la fotolitografa en fotoresina positiva y negativa [43]. ............ 44
Figura 17. Molde donde se verter el PDMS para formar la celda de flujo ................................................ 46
Figura 18. A) Componentes PDMS, b), Mezcla de componentes, c) Vertido de PDMS en moldes, d)
Horneado de PDMS .................................................................................................................................... 47
Figura 19. Equipo de medicin de resonancia de plasmones superficiales NanoSPR 6/321. ..................... 48
Figura 20. . Componentes de Chip sensor comercial (Vidrio ptico, empaque de silicn, celda de flujo). . 49
Figura 21. Dimensiones fsicas de la celda comercial ................................................................................. 49
Figura 22. Volumen de muestra biolgica de chip sensor comercial. ........................................................ 50
Figura 23. Prototipo de Chip Sensor. .......................................................................................................... 50
Figura 24. Velocidad de flujo de agua dentro del Chip sensor comercial. .................................................. 51
Figura 25. Simulacin de velocidades agua dentro del prototipo de chip sensor. ...................................... 51
Figura 26. Dimensiones fsicas del molde de la celda prototipo ................................................................. 52
Figura 27. A) Preparacin de piezas del molde para impresin 3D. B) Impresin del molde de celda. .... 52
Figura 28. . Material (PLA) para impresin 3D. .......................................................................................... 53
Figura 29. Oblea de Silicio. ....................................................................................................................... 53
Figura 30. Limpieza de oblea ..................................................................................................................... 54
Figura 31. Lmpara de luz UV con ozono (UV Ozone Cleaner ProCleaner). ........................................ 54
Figura 32. a) Colocacin de la resina negativa SU-8, b) Configuracin de equipo Brewer Science 200x. .. 55
Figura 33. Colocacin de la oblea sobre la placa de temperatura regulable a 95C por 45 min. ............... 56
Figura 34. a) Imagen de microcanales en papel adhesivo, b) Dibujo acotado de los microcanales ........... 56
Figura 35. a) Superposicin de la mscara sobre a oblea con la resina, b) Exposicin de radiacin UV de la
resina negativa con la mscara para grabado de microcanales. ............................................................... 57

4
Figura 36. a) Revelador de resina negativa SU-8, b) Revelado de la resina. .............................................. 57
Figura 37. Limpieza con alcohol isoproplico. ............................................................................................. 58
Figura 38. Oblea con reveles de microcanales............................................................................................ 58
Figura 39. a) Equipo de Medicin Veeco Dektak 150, b) Medicin de la altura de los microcanales con el
perfilometro, c) Obtencin de datos de la altura de los microcanales en el equipo de cmputo. .............. 59
Figura 40. PDMS y elastmero de silicona.................................................................................................. 62
Figura 41. Mezcla de PDMS con agente de curacin. ................................................................................. 62
Figura 42. Cmara de vaco con mezcla de PDMS en su interior. ............................................................... 63
Figura 43. Vaciado de PDMS. ..................................................................................................................... 63
Figura 44. Tapa para moldear los 4 conductos de entrada y salida. .......................................................... 63
Figura 45. Secado de la celda de flujo. ....................................................................................................... 64
Figura 46. Celda de flujo de PDMS. ............................................................................................................ 64
Figura 47. Exposicin de radiacin de luz UV con ozono de la celda de flujo y vidrio. ............................... 65
Figura 48. Prototipo de celda Final. ............................................................................................................ 65
Figura 49. Vista lateral del prototipo final de la celda. .............................................................................. 66
Figura 50. Vista superior del prototipo final de la celda, en la imagen se alcanzan a percibir los
microcanales............................................................................................................................................... 66
Figura 51. Vista inferior de la celda microfludica, como la pelcula de Au y Cr son muy delgadas, la luz
alcanza a atravesar. ................................................................................................................................... 66
Figura 52. Equipo de medicin de SPR. ....................................................................................................... 69
Figura 53. Configuracin final de nuestro prototipo de chip sensor para el dispositivo Nano SPR/ 321 1)
Prisma de retroflexin trapezoidal con un ngulo de 65, 2) Fluido de inmersin ptico (n = 1.6100), 3)
Chip sensor de oro (vidrio/Cr/Au), 4) Celda microfludica de PDMS. .......................................................... 69
Figura 54. a) Prisma de retroflexin trapezoidal, b) Ajuste del prisma en el equipo de NanoSPR/321 ...... 70
Figura 55 a) Aceite de inmersin (n=1.61), b) Colocacin de aceite de inmersin sobre el prisma ............ 70
Figura 56. Ajuste de la celda microfludica sobre el aceite de inmersin. .................................................. 70
Figura 57. a) Equipo de pruebas de SPR constituido por una computadora y el equipo de medicin, b)
Colocacin de nuestra celda en el quipo NanoSPR/321. ............................................................................ 71
Figura 58. Vista superior de la celda microfludica en el equipo de SPR. .................................................... 71
Figura 59. Se observa la luz lser que incide en el prisma lo cual indica que est en funcionamiento. ..... 72
Figura 60. a) Mensaje de verificacin de conexin y bienvenida, b) Pantalla inicial donde se mostrara ms
adelante los datos de la prueba ................................................................................................................. 72
Figura 61. . Curva de SPR para el agua. ...................................................................................................... 72
Figura 62. Para la calibracin de la celda se obtiene la curva de SPR con agua. ....................................... 73
Figura 63. Se introducen diferentes concentraciones de sucrosa y se obtiene su respectiva curva de SPR.
.................................................................................................................................................................... 73
Figura 64. Pantalla de inicio WinSpall 3.02 ................................................................................................ 74
Figura 65. Ubicacin para cargar datos. .................................................................................................... 75
Figura 66. Ingreso de parmetros para simulacin de la curva del efecto de SPR. .................................... 76
Figura 67. Parmetros de simulacin. a) Tipo de prisma, longitud de onda y luz polarizada, b) Lmites del
ngulo y c) Caractersticas de las capas del sistema. ................................................................................. 78
Figura 68. Men para ajuste de curvas. ..................................................................................................... 79
Figura 69. Ajuste iterativo de curvas. ......................................................................................................... 80
Figura 70. Ajuste manual de curvas. .......................................................................................................... 80
Figura 71. Evaluacin de datos cargados y simulacin de curva. ............................................................... 81
Figura 72. Evaluacin de valores de la curva de SPR con agua como dielctrico y la curva simulada. ...... 81
Figura 73. Evaluacin de valores del ngulo de SPR y reflectividad para la solucin de sucrosa a una
concentracin de 0.04g/ml. ........................................................................................................................ 83

5
ndice de Grficas
Grfica 1. . Relacin de espesor respecto a la velocidad de giro recomendada de acuerdo al tipo de resina
SU-08 3000 a una temperatura de 21C [48]. ............................................................................................ 55
Grfica 2. Representacin de los datos obtenidos del espesor del microcanal por el perfilmetro
(143.3103 m de espesor y 2.549 mm de ancho). ...................................................................................... 60
Grfica 3. Representacin de los datos obtenidos del espesor del microcanal por el perfilmetro (82.4824
m de espesor y 2.678 mm de ancho). ....................................................................................................... 60
Grfica 4. Representacin de los datos obtenidos del espesor del microcanal por el perfilmetro (99.0941
m de espesor y 1.905 mm de ancho). ....................................................................................................... 61
Grfica 5. Representacin de los datos obtenidos del espesor del microcanal por el perfilmetro
(106.1784 m de espesor y 1.891 mm de ancho). ...................................................................................... 61
Grfica 6. Curva de resonancia de plasmones superficiales con agua dentro del microcanal. ................. 75
Grfica 7. Simulacin de curva de SPR con agua como dielctrico dentro del microcanal. ....................... 78
Grfica 8. Curva de simulacin de SPR con agua destilada como dielctrico junto con curva de valores
medidos en el equipo de NanoSPR 6/321 con los valores mnimos de reflectividad. ................................. 81
Grfica 9. Curva de simulacin de SPR con agua destilada como dielctrico ajustada a los valores
medidos en el equipo de NanoSPR 6/321. .................................................................................................. 82
Grfica 10. Curva de SPR de la solucin de sucrosa a una concentracin de 0.04 g/ml. ............................ 83
Grfica 11. Ajuste de curva de SPR de la solucin de sucrosa a una concentracin de 0.04 g/ml con la
simulacin de la curva de SPR con agua destilada. .................................................................................... 84
Grfica 12. Curvas del efecto de SPR a diferentes concentraciones de sucrosa, a) C=0.08 g/ml, b) C=0.12
g/ml, c) C=0.16 g/ml, d) C=0.20 g/ml. ........................................................................................................ 85
Grfica 13. Curvas de SPR a diferentes concentraciones de sucrosa con sus valores mnimos de
reflectividad marcados. .............................................................................................................................. 86
Grfica 14. Relacin de la estimacin del ndice de refraccin y el ngulo de SPR. ................................... 87
Grfica 15. Relacin de la concentracin de sucrosa y la estimacin de los ndices de refraccin. ........... 87

ndice de Tablas
Tabla 1. Comparacin entre materiales, PDMS y PMMA. .......................................................................... 35
Tabla 2. Energa de exposicin de luz UV de acuerdo al espesor deseado de resina.................................. 57
Tabla 3. Valores de ndice de refraccin en base a espesores de las capas de los metales dados por el
fabricante. .................................................................................................................................................. 76
Tabla 4. Valores de ndice de refraccin en base a espesores de las capas de los metales dados por el
fabricante. .................................................................................................................................................. 82
Tabla 5. Datos de las curvas de SPR. .......................................................................................................... 86

6
Resumen.

El reconocimiento de molculas por resonancia de plasmones superficiales (SPR) es una

herramienta de transduccin ptica que por su velocidad de deteccin, especificidad,
sensibilidad y posibilidad de anlisis en tiempo real se ha estudiado en los ltimos aos y
se ha aplicado en diferentes reas de investigacin como por ejemplo en la deteccin de
molculas contaminantes en el aire o en bebidas como el vino, deteccin de enfermedades
por biomolculas especficas, etc.

Este proyecto aborda el desarrollo de un prototipo de chip sensor de celda microfludica

de dos canales compatible con el equipo de medicin NanoSPR 6/321 para espectroscopia
de resonancia de plasmones superficiales que ser usado para investigaciones en la
deteccin de analitos.

El desarrollo del prototipo incluye una investigacin de la tcnica de resonancia de

plasmones superficiales, as como de materiales para la fabricacin de la celda
microfludica mediante la tcnica de fotolitografa para el diseo de los microcanales y el
curado del polmero para su estructura, adems de la placa sensora que consta de depsito
de metales sobre vidrio ptico por evaporacin trmica.

7
Abstract

Recognition of molecules by surface plasmon resonance (SPR) is an optical

transduction tool that, due to its speed of detection, specificity, sensitivity and
possibility of real-time analysis, has been studied in the last years and has been applied
in different research areas, such as example in the detection of contaminating molecules
in the air or in beverages such as wine, detection of diseases by specific biomolecules,
etc.

This project addresses the development of a prototype two-channel microfluidic cell

sensor that is compatible with the NanoSPR 6/321 measurement equipment for surface
plasmon resonance spectroscopy that is used for investigations in the detection of analyte.

The development of the prototype includes an investigation of the SPR technique, as well
as materials for microfluidic cells manufacturing using the photolithography technique
for microchannels design and curing polymer for its structure, besides the sensor plate
that consists of depositing metals on the optical glass by thermal evaporation.

8
Glosario

Alcanotiol: Cadenas de hidrocarbururos con un grupo tiol (compuesto por un grupo

funcional con un tomo de azufre y uno de hidrogeno SH) en un extremo de la cadena
que es muy afin a los sustratos metlicos.

Analito. Componente de inters, ya sea un elemento, compuesto o ion, de una muestra

que es cuantificable.

Espectrometra. Estudio de la interaccin entre la radiacin electromagntica y la

materia, con absorcin o emisin de energa radiante.

PLA: La Polilactida (PLA) es un termo-plstico biodegradable que se hace a partir de

recursos renovables como el maiz, raices de tapioca, fculas y almidones

Reflectividad: Relacin de la cantidad de energa reflejada respecto a la energa incidente

sobre una superficie.

Sucrosa: Tambin conocida como sacarosa, es la denominacin qumica del azcar, la

cual es un disacrido de glucosa y fructuosa.

Tcnicas de microfabricacin: Procedimientos para el desarrollo de prototipos a nivel

micromtrico.

9
Captulo 1. Objetivos

1.1 Objetivo General.

Disear y fabricar un biosensor para espectroscopia de resonancia de plasmn superficial

mediante tcnicas de microfabricacin en salas limpias.

1.2 Objetivos Especficos.

Analizar el proceso de inmovilizacin de protenas basado en la adsorcin

molecular y la interaccin entre receptor biolgico y muestra biolgica.

Obtener las bases fisicomatemticas de la tcnica de resonancia de plasmones

superficiales.

Analizar y seleccionar los materiales para la fabricacin del biosensor.

Analizar y seleccionar las tcnicas de microfabricacin para la creacin del

biosensor.

Realizar el diseo del biosensor para ser compatible con un equipo de medicin
de resonancia de plasmones superficiales.

Fabricar un biosensor mediante tcnicas de microfabricacin.

10
Captulo 2. Introduccin.

Un biosensor es un dispositivo al que se le incorpora una sustancia biolgica para poder

medir de manera selectiva determinadas sustancias en cierto medio. Los biosensores
tienen un conjunto nico de caractersticas, debido a la utilizacin de los receptores
biolgicos que los diferencian de otros enfoques de deteccin [1].

Debido a que los biosensores se basan en componentes biolgicos, pueden tener la

estabilidad o la degradacin dependiente del tiempo de funcionamiento; es decir, el
receptor biolgico puede perder actividad con el tiempo, son normalmente de un solo uso
y tienen una gama operativa limitada, en trminos de factores tales como la temperatura,
pH, o la humedad, en el que operarn de forma fiable; la preparacin de muestras
biolgicas es a menudo necesaria antes de la presentacin al sensor; el ensuciamiento del
sensor puede ser un problema importante puesto que algunos compuestos pueden
interferir con las lecturas de los sensores, en general, los biosensores exhiben muy alta
sensibilidad y especificidad [2].

Los biosensores pueden clasificarse de distintas maneras, la clasificacin ms aceptada

es de acuerdo al tipo de transductor utilizado, como es ptico, electroqumico,
piezoelctrico y trmico [3].

Una gran variedad de mtodos pticos se han utilizado en biosensores, sin embargo, los
dispositivos basados en la espectroscopia de fluorescencia, resonancia de plasmn
superficial, interferometra y espectroscopia de modos guiados en estructuras de gua de
ondas pticas (rejilla de acoplador y el espejo resonante), son los ms comunes [4].

La resonancia de plasmones superficiales es una herramienta ptica que usa la excitacin

de plasmones superficiales [5]. Se conocen como plasmones superficiales a las
oscilaciones colectivas de electrones restringidos en pequeos volmenes metlicos [6].

El fenmeno de SPR se presenta al excitar los plasmones superficiales por medio de un

haz de electrones, este incide en la interfase de una pelcula delgada de metal y un
dielctrico. La interfase responde a ligeros cambios en el ndice de refraccin debido al
cambio de concentracin de molculas de inters. La variacin del ndice de refraccin
se ve reflejada en el ngulo de SPR, que es el ngulo de incidencia del haz de electrones

11
en el cual la frecuencia de radiacin del haz coincide con la frecuencia de resonancia de
los plasmones.

Se aborda el disea de un prototipo de chip sensor para espectroscopia de resonancia de

plasmones superficiales al cual se le implementa un receptor biolgico para constituir un
biosensor que est inspirado en el reconocimiento especfico de la membrana celular y
que ser utilizado para investigaciones en la deteccin de biomolculas especficas de
enfermedades.

En este escrito se describe el proceso de investigacin y anlisis para el desarrollo del

prototipo, que incluye el proceso de inmovilizacin de biomolculas as como la
interaccin del receptor biolgico con la muestra biolgica, adems de la tcnica de SPR
y los materiales de fabricacin para su posterior diseo y construccin. Se planea
comprobar la funcionalidad del prototipo en el Centro de Investigacin y Desarrollo en
Electroqumica, S.C. Quertaro (CIDETEQ) con el equipo de medicin NanoSPR 6/321
mediante una solucin de sucrosa a diferentes concentraciones.

2.1 Antecedentes

El trmino biosensor aparece en la literatura cientfica a finales de los aos 70, aunque el
concepto bsico e incluso la comercializacin comenzaron antes. El primer biosensor fue
un analizador de glucosa desarrollado por Clark y Lyons en 1962 y fue comercializado a
partir de 1975 por Yellow Springs Instrument Company. Este biosensor se denomin
enzyme electrode y consista en una enzima glucosa oxidasa acoplada a un electrodo
para oxgeno. La enzima oxida la glucosa y como consecuencia produce un descenso
proporcional de la concentracin de oxgeno en la muestra, que es detectado por el
electrodo [7].

Otro nuevo tipo de biosensores, basados en principios pticos, fue desarrollado alrededor
de 1980 por Lowe y sus colaboradores, denominado sensor optoelectrnico. El
componente biolgico inmovilizado es una enzima ligada a un cromforo (entendindose
ste como un grupo funcional de la molcula responsable de la absorcin [8]), que a su
vez est ligado a una membrana [1].

12
El biosensor mediante la resonancia de plasmn superficial se demostr por primera vez
para los biosensores en 1983 [4]. Rufus Ritichie descubri estas ondas en los aos
cincuenta del pasado siglo. Cualquier superficie metlica (plana, esfrica, cilndrica o de
cualquier otra forma) posee plasmones superficiales [9].

2.2 Estado del Arte

El ensayo por inmunoadsorcin ligado a enzimas (ELISA, acrnimo del ingls

EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay) y el ensayo de Reaccin en Cadena de
Polimerasa (PCR, acrnimo del ingls Plymerase Chain Reaction) han ido aumentando
su popularidad entre los mtodos para detectar la presencia de patgenos debido a su
velocidad y confiabilidad. ELISA y PCR requieren de 10 a 28 horas y 4 a 6 horas
respectivamente ya que las muestras a analizar requieren de procesos de preparacin,
mientras que el tiempo de anlisis para los biosensores pticos es alrededor de 2 horas en
condiciones ideales. Por otra parte la sensibilidad de los biosensores pticos es mejor que
la de ELISA y comparable a la mayora de los mtodos de PCR [1].

El biosensor ptico basado en la tcnica SPR ha ganado atencin por su: alta sensibilidad
debido a que el ngulo de SPR vara proporcionalmente a pequeos cambios en el orden
de 10-4 [10] del ndice de refraccin; alta especificidad ya que el ndice de refraccin se
modifica en relacin a la cantidad de molculas detectadas en la interfase; y posibilidad
de anlisis en tiempo real por su velocidad de deteccin [1].

Los biosensores tipo SPR se pueden utilizar para una caracterizacin diversa de los
anticuerpos modificados. Se han utilizado para la produccin y caracterizacin del
anticuerpo del hygromycin B y se concluy que fue ms rpido y exacto que los ensayos
inmunoqumicos adems este permiti el rpido desarrollo de los mtodos de anlisis del
hygromycin B en muestras biolgicas. Se detect la enterotoxina staphylococcal B en
leche y en general en varios patgenos y agentes en la prueba y anlisis de alimentos
como salmonelas y Listeria. Tambin se han utilizado con xito para la deteccin de
drogas, micotoxinas, pesticidas y monitoreo del proceso de destilacin [1].

Existen compaas que desarrollan biosensores como es: Pharmacia BIACore, la cual
ofrece biosensores pticos, especialmente mediante la tcnica de resonancia de
plasmones superficiales; Quantech Biosensors, Quantech Ltd. enfoca su trabajo en el

13
diagnstico mdico mientras que su subsidiaria HTS Biosystems, Inc. persigue el
desarrollo de sistemas de deteccin para el mercado de las investigaciones cientficas y
los bioprocesos; Biosensor Applications desarrolla biosensores en sentido general,
incluyendo sensores para bioprocesos y XanTec se basa al igual que Pharmacia BIACore
en la resonancia de plasmones superficiales para la deteccin de las interacciones
biomoleculares [1].

14
Captulo 3. Planteamiento del Problema.

Los biosensores cuya transduccin es por el mtodo de resonancia de plasmones

superficiales siguen siendo estudiados debido a su velocidad de deteccin, especificidad,
sensibilidad y posibilidad de anlisis en tiempo real por lo que son utilizados en la
investigacin para deteccin de enfermedades.

Actualmente se realiza una investigacin en el CIDETEQ de deteccin de antgeno

prosttico por resonancia de plasmones superficiales con el equipo de medicin NanoSPR
6/321 y con el chip sensor que se adquiere directamente con los proveedores del equipo.
El diseo actual del chip sensor consta de 3 componentes que se deben acoplar
minuciosamente en el equipo de medicin y ste no optimiza la cantidad de muestra
biolgica para su anlisis siendo que el efecto de SPR se presenta a nivel molecular en la
superficie del chip.

Un nuevo diseo del chip sensor integrando la tecnologa microfludica aportara una
alternativa para mejorar el aprovechamiento de la muestra, ya que la cantidad necesaria
en un microcanal sea mucho menor en comparacin a la utilizada en la celda
comercializada, adems permitira agilizar las pruebas de deteccin al unificar los
componentes para un ajuste ms sencillo del chip en el equipo.

15
Captulo 4. Justificacin.

Una membrana celular tiene un sistema especfico de reconocimiento por el cual puede
realizar sus funciones biolgicas, en particular son de gran inters los procesos y sistemas
asociados con las membranas celulares tales como la capacidad de barrera, transporte
activo y pasivo, canales, receptores, motores moleculares, cadena transportadora de
electrones y procesos de adhesin y fusin [11].

Dicha especificidad ha inspirado la creacin de biosensores que consisten en bio-

reconocimiento de molculas especficas, las cuales se inmovilizan en la superficie de
transductores fisicoqumicos. Las interacciones especficas entre el analito y la capa de
bio-reconocimiento producen un cambio fisicoqumico que es detectado y medido
mediante el transductor. Los transductores varan de acuerdo al parmetro elegido para
las medidas, pudiendo ser electroqumicos (potenciomtricos o amperomtricos), pticos,
mecnicos o por cambios trmicos o de masa [11].

La deteccin de enfermedades por biosensores mediante resonancia con plasmones

superficiales, siendo este un transductor ptico, se ha estudiado desde 1983 y ha sido una
herramienta til en el reconocimiento de biomolculas [4]. La velocidad de deteccin, la
especificidad, sensibilidad y posibilidad de anlisis en tiempo real, ha causado que se le
reconozca como una valiosa herramienta para investigar las interacciones biolgicas entre
antgenos y anticuerpos [1].

La celda microfludica aplicada en la deteccin por resonancia con plasmones

superficiales ha sido implementada en algunos trabajos de investigacin debido a su
operacin en micro escala [5]. Adems al utilizar este dispositivo a esta escala, la cantidad
de muestra necesaria para que se realice la deteccin en el biosensor es mnima y la
sensibilidad del dispositivo para realizar la prueba aumentara.

La deteccin de enfermedades mediante un biosensor por resonancia con plasmones

superficiales es investigada en los laboratorios del CIDETEQ, por lo cual en este trabajo
se propone una alternativa de diseo y de materiales de un chip sensor con celda
microfludica que plantea agilizar las pruebas de deteccin y que contribuir a
investigaciones de reconocimiento de biomolculas conformando un biosensor.

16
4.1 Solucin Propuesta.

Disear y fabricar un prototipo de chip sensor (celda de flujo) compatible con el sistema
de medicin de transduccin ptica NanoSPR 6/321 que el CIDETEQ utiliza en
investigaciones de biosensores para deteccin de enfermedades.

Este chip sensor ser construido en colaboracin con el Centro de Nanociencias y Micro
y Nanotecnologas (CNMN), ya que el centro cuenta con la infraestructura necesaria para
el desarrollo del mismo, con el fin de proporcionar una alternativa que pueda mejorar el
desarrollo de las investigaciones.

17
Captulo 5. Marco terico

5.1 Biosensores

Un biosensor se define como un dispositivo de anlisis que incorpora un elemento de

reconocimiento biolgico asociado a un sistema de transduccin que permite procesar la
seal producida por la interaccin entre el elemento de reconocimiento y el analito [7].

Existen diferentes tipos de elementos de reconocimiento biolgico o bioreceptores que se

pueden inmovilizar sobre transductores electroqumicos [3]:

Anticuerpos
cidos nucleicos
Microorganismos
Tejidos orgnicos
Enzimas

Los enzimas son los elementos ms comnmente utilizados para la fabricacin de

biosensores debido a su bajo coste, disponibilidad en el mercado y fcil manipulacin.

5.1.1 Caractersticas de los biosensores

Los biosensores tienen un conjunto nico de caractersticas, debido a la utilizacin de los

receptores biolgicos que los diferencian de otros enfoques de deteccin [2].

Debido a que los biosensores se basan en componentes biolgicos, pueden tener

la estabilidad o la degradacin dependiente del tiempo de funcionamiento; es
decir, las enzimas o anticuerpos pueden perder actividad con el tiempo. Las
condiciones de almacenamiento y el mtodo de fabricacin pueden influir
significativamente en la vida til operativa.

Los biosensores son normalmente para un solo uso. Por lo general son adecuados
para aplicaciones de punto de cuidado, pero en la actualidad no son adecuados
para el seguimiento a largo plazo cuando se requieren mediciones continuas, tales
como el seguimiento de las bacterias en el agua.

18
 Los biosensores a menudo tienen una gama operativa limitada, en trminos de
factores tales como la temperatura, pH, o la humedad, en el que operarn de forma
fiable.

La preparacin de muestras biolgicas antes de la presentacin al sensor, es a

menudo necesario y esto puede aumentar la complejidad del sistema de sensores,
as como el tiempo de la muestra de respuesta.

El ensuciamiento del sensor puede ser un problema importante, en particular con

muestras biolgicas, como en el caso de depsitos de protenas. Estos problemas
pueden resolverse en parte mediante el uso de micro y sistemas nanofludicos,
tales como micro-dilisis, para preparar la muestra antes de la presentacin al
sensor.

Algunos compuestos pueden interferir con las lecturas de los sensores, en

particular los transductores bioqumicos, como en el caso de la interferencia del
paracetamol en las mediciones de glucosa.

En general, los biosensores exhiben muy alta sensibilidad y especificidad.

5.1.2 Clasificacin de los biosensores

La clasificacin de los sensores y biosensores se puede realizar atendiendo a diferentes

criterios, como son el tipo de receptor utilizado, la metodologa empleada para
inmovilizar este receptor o el tipo de transductor utilizado, siendo sta la ms aceptada
[3].

La clasificacin de sensores qumicos y biosensores segn el transductor utilizado es [3]:

pticos. Transforman los cambios producidos en una seal ptica por la

interaccin de un analito con el receptor.

Electroqumicos. La seal transformada es debida a una interaccin

electroqumica entre el analito y el electrodo.

Piezoelctricos. Dispositivos que transforman un cambio de masa que se da sobre

el electrodo modificado con materiales con propiedades piezoelectrnicas.

19
 Trmicos. Dispositivos capaces de medir cambio de calor sobre la superficie del
electrodo

5.1.3 Aplicaciones de los biosensores

Principales aplicaciones de los biosensores [2]:

Cuidado de la salud
Manejo de enfermedades crnicas, como la monitorizacin de la glucosa en la
diabetes
El diagnstico y la deteccin de las pruebas de embarazo en el hogar; estmago
lceras Helicobacter pylori:
Bioqumica, por ejemplo, pruebas de colesterol
Pruebas de infeccin bacteriana
Evaluacin de la enfermedad aguda, como para cnceres, como el de prstata

Biotecnologa
Fermentacin del vino
cido ctrico
Fabricacin de cerveza
Produccin de enzimas
Produccin biofarmacutica

Calidad de la comida
Deteccin de contaminantes qumicos
Deteccin de toxinas
Deteccin de patgenos
Deteccin hormonas

Seguridad personal / aplicacin de la ley /empleo

Pruebas de alcohol
Prueba de drogas

Monitoreo ambiental
Contaminacin, como las pruebas de coliformes fecales en el agua
Agricultura

20
 Pesticidas en el agua, tales como los organofosfatos
Metales pesados
Hormonas

Seguridad
Deteccin de agentes de guerra y qumicos

5.2 Tcnica de resonancia de plasmones superficiales

5.2.1 Plasmn y plasmones superficiales

La idea de plasmn se debe a que en los metales hay electrones que no estn ligados al
ncleo atmico y pueden moverse libremente dentro del material formando en conjunto
un plasma [12]. Los plasmones son las oscilaciones en conjunto de los electrones libres o
de conduccin de un metal que son excitados al hacer incidir radiacin electromagntica
[13].

Al hacer incidir una frecuencia de radiacin que coincide con la frecuencia de resonancia
de los plasmones se produce un fenmeno de absorcin que en pelculas delgadas de
metales depende del espesor y en partculas nanomtricas de metal del tamao y forma
del material [12]. Este fenmeno se conoce como resonancia de plasmones.

La resonancia de plasmones superficiales son oscilaciones de densidad de carga

superficial propagada a travs de la interface entre un metal y un dielctrico que son
excitadas por medio de un haz de electrones o fotones incidente en el medio metlico de
la interfase. Esta excitacin de plasmones provoca un descenso en la reflectividad ya que
la radiacin electromagntica es absorbida por los electrones libres [14].

5.2.3 Biosensor por Resonancia de Plasmones Superficiales

El biosensor por resonancia de plasmones superficiales es un dispositivo ptico

refractomtrico que permite la deteccin mediante el cambio en el ndice de refraccin en
la proximidad de la interfase de un metal y un dielctrico. Las distribuciones de carga en
el metal y en el dielctrico decaen exponencialmente (Figura 1), por lo que el fenmeno
de SPR es muy sensible a los cambios del ndice de refraccin de sus alrededores, este es
el principio de deteccin [14].

21
 Figura 1. a) Campos elctricos generados en la interfase de metal-dielctrico

Los biosensores por el fenmeno de SPR consiste en inmovilizar un elemento receptor en

la proximidad de la superficie de la capa metlica, cuando el analito encuentra al receptor
y se une al elemento de reconocimiento se produce un incremento del ndice de refraccin
local en la superficie, al cambiar el ndice de refraccin ste produce un cambio en la
constante del pasmn superficial y altera las caractersticas de la luz acoplada como el
ngulo y la longitud de la luz reflejada (Figura 2), con esto se puede obtener informacin
de los cambios en el ndice de refraccin del medio adyacente a la superficie metlica
[15].

Figura 2. Principio de deteccin de un sensor por SPR, el ngulo y la intensidad del lser reflejado cambia si la
molcula de inters se enlaza en el anticuerpo inmovilizado [16].

La resonancia de los plasmones superficiales se puede observar midiendo la intensidad

reflejada del haz de electrones que se hace incidir sobre la interfase, o bien, con la
reflectividad, esto en funcin del ngulo de incidencia de la radiacin electromagntica
[13]. Al medir la intensidad del haz reflejado en funcin de su ngulo de incidencia, se
observar un mnimo de reflectividad que es el ngulo al cual se presenta la resonancia
de plasmones superficiales, denominado ngulo de SPR [14].

22
El mtodo para obtener el ngulo de SPR se puede realizar haciendo un barrido del ngulo
de incidencia midiendo la reflectividad para obtener la posicin del mnimo de
reflectividad (Figura 3).

Figura 3. Medicin del ngulo de SPR por barrido del ngulo de incidencia.

5.3 Bases fsico-matemticas de la tcnica de Resonancia de Plasmones Superficiales

5.3.1 Principio fsico del fenmeno de plasmones superficiales en una interfase

El fenmeno de resonancia de plasmones superficiales puede realizarse haciendo incidir

un haz de electrones en la interfase sobre el metal y el dielctrico [14]. Dicho fenmeno
slo se presenta si el campo elctrico tiene una componente normal a la superficie tal que
puede inducir una carga superficial [13]. Cabe mencionar que se da en frecuencias de la
regin del espectro visible e infrarrojo, aunque generalmente los plasmones se generan
en la regin visible [14].

La luz S-polarizada, (cuando el campo elctrico est polarizado en direccin

perpendicular al plano de incidencia, tambin denominada onda TE), se propaga en
direccin x por lo que tiene un campo elctrico E= (0; Ey; 0), componentes del campo
paralelas a la direccin y, siendo sta incapaz de excitar plasmones superficiales. Por otro
lado, tenemos a luz P-polarizada (cuando el campo elctrico est polarizado en direccin
paralela al plano de incidencia, tambin denominada onda TM), la cual se propaga en
direccin y, tiene un campo elctrico E= (Ex; 0; 0), permitiendo as la excitacin de
plasmones superficiales [13].

23
Teniendo en cuenta que el haz de electrones viene de un medio dielctrico y adems se
ignoran materiales magnticos considerando =1, el vector de onda de un fotn libre
se puede representar como

= (1)

donde es la frecuencia angulas, es la velocidad de la luz en el vaco y la

permitividad del dielctrico.

Por otra parte el vector de onda de un plasmn superficial que representa la dispersin
de los plasmones superficiales en una interfase metal-dielctrico, viene dado por:

=
+ (2)

donde es la permitividad en el metal y es la permitividad en el dielctrico (el

desarrollo del vector se encuentra en el Anexo A).

El vector de onda del fotn va a ser menor que el vector de onda de un plasmn superficial
que se propaga en la interfase entre el mismo medio y el metal.

En la Figura 4 se puede observar un esquema que representa el vector en x del haz del
fotn junto con el vector de propagacin del plasmn superficial .

Figura 4. Vector de onda de un fotn incidente desde un dielctrico junto con vector de propagacin de un
plasmn superficial entre la interfase del dielctrico y un metal [13].

Debido a que el vector de onda del fotn es siempre menor que el de los plasmones
superficiales, ser imposible que los fotones lleguen a excitar a los plasmones, por lo que
se ocupa la configuracin de Kretschmann (Figura 5) para su acoplamiento en el sistema
[13]. El acoplamiento consiste en hacer incidir en primera instancia el haz de fotones

24
sobre un prisma dielctrico con un ndice de refraccin mayor que el dielctrico de la
interfase.

Figura 5. Representacin esquemtica de la configuracin de Krestschemann, mostrando la excitacin de la SPR

por medio de un haz de electrones [14].

La componente en x del vector de onda del haz del fotn que pasa por el prisma se puede
representar con la siguiente ecuacin:

= sin (3)

donde es el ndice de refraccin del prisma, que como se mencion anteriormente

debe ser mayor que el ndice de refraccin del dielctrico > , y es el ngulo
al que incide el haz de electrones, que permite con el ngulo adecuado excitar a los
plasmones superficiales, denominado ngulo de SPR ( ) (Figura 6).

Figura 6. Vector de onda de un fotn incidente desde un junto con vector de propagacin de un plasmn
superficial que se propagan entre el metal y el dielctrico de ndice de refraccin menor al del prisma [13].

Por lo tanto tenemos que la condicin para que se d el fenmeno de SPR es cuando:

25

=
+ =
sin = (4)

y de la condicin de resonancia (17) se puede obtener la ecuacin para calcular el ngulo

de SPR en funcin de las permitividades de sistema prisma-metal-dielctrico:

= sin1 ( (5)
+ )

Una manera de observar el efecto de SPR es obteniendo la reflectividad en funcin del

ngulo de incidencia, donde se ver un mnimo en la reflectividad cuando el ngulo de
incidencia es en el cual los plasmones superficiales son excitados [13].

5.4 Anlisis el proceso de inmovilizacin de las protenas basado en la adsorcin

molecular.

En la construccin de un biosensor, la inmovilizacin de las molculas receptoras es un

punto clave, estas deben estar fsicamente confinadas o localizadas en una cierta regin
definida en el espacio, manteniendo la estabilidad y actividad del enlace biolgico del
receptor [13] [16].

Las molculas receptoras pueden inmovilizarse de forma temporal o permanente

dependiendo el proceso qumico para el que se utilice. Si es temporal pueden reutilizarse
en diversos procesos qumicos y por tanto permitir la recuperacin y reutilizacin de la
biomasa al terminar el proceso.

La inmovilizacin en superficies de Au es usualmente realizada por la adsorcin fsica de

la molcula o por la unin covalente a la superficie siendo esta modificada previamente.

La inmovilizacin por enlace covalente es un mtodo irreversible donde no se pueden

reutilizar las molculas inmovilizadas, la ventaja de este mtodo es la resistencia de la
actividad de la molcula a los cambios del medio como temperatura o PH, adems las
molculas pueden orientarse especficamente, tambin existen desventajas como la
posible modificacin del sitio activo debido a impedimentos histricos, el control
especifico de la densidad de grupos activos en la superficie que condiciona el nmero de
uniones molecula-soporte y su geometra (Figura 7) [16].

La inmovilizacin por adsorcin es un mtodo reversible en donde se pueden desprender

las molculas inmovilizadas en condiciones no extremas, son detenidas por interacciones

26
inicas o fuerzas dbiles (puentes de hidrogeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones
hidrofbicas), la adsorcin mantiene intacta la actividad de la molcula al no afectar su
conformacin, es un mtodo rpido y simple [17]. Sin embargo las molculas podran
liberarse fcilmente al sufrir cambios en su medio como PH y temperatura [16], por lo
que se produce con facilidad la prdida del anticuerpo inmovilizado y la orientacin al
azar del mismo, estos factores afectan finalmente la sensibilidad del sensor [17].

Figura 7. Enzimas inmovilizadas en un soporte fsico. A) Por absorcin, la regin positiva de la protena interacta
con el soporte negativo [16].

Las Self Assembled Monolayers (SAMs) permiten acoplar un sustrato inorgnico al

diseo orgnico funcional que se expondr al medio circundante, razn por la cual son
utilizadas en los biosensores al servir de nexo entre el conductor metlico que se utilizara
para translucir las seales y las molculas de reconocimiento, aunque tambin son
utilizadas en micro y nanofabricacin, electrnica molecular, etc.all-001. Las SAMs
permiten superar los problemas de la fisisorcin al permitir orientar los anticuerpos e
inmovilizarlos de forma covalente.

La autoorganizacin se realiza por reacciones dbiles y reversibles en un proceso

espontaneo. La formacin de monocapas autoensambladas es llevada a cabo por
molculas con estructura qumica especfica, estas estructuras estn cerca del equilibrio
termodinmico razn por la cual tienden a reparar sus defectos, sus arreglos son estables
y ordenadosall-001.

Las SAMs de alcanotioles sobre oro son las ms estudiadas debido a la simplicidad de
preparacin, los alcanotioles son adsorbidos por la superficie por fisiorcin y
Quimiosorcin. Los alcanotioles se ordenan con un angulo de inclinacin de 30 y
contienen un grupo reactivo en un extremo que permite la inmovilizacin del anticuerpo
al unirse covalentemente a la SAM (Figura 8). La SAM protege a las biomolculas

27
inmovilizadas de la desnaturalizacin. La densidad de puntos de unin del anticuerpo a
la SAM es controlada por el uso de SAMs mixtas que contienen alcanotioles con grupos
funcionales reactivos e inertes [17].

Figura 8. Esquema de una SAM sobre un sustrato, orientada 30, A) Grupo terminal funcional: Distintos grupos
qumicos que determina las propiedades superficiales para la inmovilizacin de los anticuerpos, B)Cadena
hidrocarbonada que regula el espesor, es una barrera fsica y altera la conductividad electrnica, C) Ligando con
alta afinidad por el sustrato y que estabiliza la superficie. D) Sustrato [11].

5.5 Anlisis de la interaccin especfica del receptor biolgico con el analito

Los receptores son componentes de clulas que tienen la capacidad de identificar una
molcula en especial [18].Para el caso que se va a estudiar, se usar un receptor biolgico
especfico que detectar el antgeno desarrollado a causa de la aparicin de tumores
malignos. Dichos receptores biolgicos puede ser una molcula, una sustancia o un
proceso que se altera cualitativa o cuantitativamente como resultado de la presencia de
otra molcula [19].

Los receptores generalmente se encuentran asociados a membranas celulares encargados

de reconocer el ligando en forma selectiva, por lo que se establece que los receptores
ocupan un espacio fsico y poseen una estructura que tiene que ver con su funcionamiento
[18].

Los receptores biolgicos en contacto con un analito interactan por complementariedad

espacial y no por uniones covalentes. La unin especfica del receptor y el analito se da
principalmente por puentes de hidrogeno, interacciones hidrofbicas, fuerzas
electrostticas y fuerzas de van der Waals (Figura 9), que por lo general solo son efectivas
en distancias cortas. Todos estos son uniones dbiles no covalentes, aunque algunas de
las asociaciones pueden ser bastante fuertes [20].

28
 Figura 9. Unin de receptor biolgico con el analito por medio de enlaces no covalentes [21].

La reaccin entre un receptor biolgico y el analito se caracteriza por su especificidad,

rapidez, espontaneidad y reversibilidad. La unin dada por la especificidad es muy precisa
y permite distinguir entre diferentes compuestos con diferencias mnimas, mientras que
la rapidez es la velocidad de reaccin de las etapas del proceso de unin de los
compuestos. Por otro lado la espontaneidad se refiere a que la reaccin no requiere energa
adicional para poder efectuarse y, dado que la reaccin no se debe a fuerzas covalentes,
la reaccin es reversible y por lo tanto se ve afectada por factores como la temperatura,
la proporcin de los compuestos, el pH y la fuerza inica [21].

Muchos de los receptores biolgicos son multivalentes, es decir, tienen ms de un sitio

de unin por cada molcula. De esta manera, mltiples interacciones aumentan la fuerza
de unin entre dos superficies. Un beneficio de la multivalencia es que las interacciones
de unin no covalentes son reversibles: el analito pasa parte del tiempo unido al receptor
y parte del tiempo separado. Cuando est involucrado en ms de un sitio de unin, es
menos probable que todos los sitios receptores estn simultneamente sin uniones por lo
que el receptor libera el analito [22].

El trmino avidez se usa para describir la fuerza general de las interacciones de unin
colectivas que ocurren durante una unin multivalente [4]. Esta fuerza depende de las
afinidades individuales de cada uno de los determinantes del analito, teniendo como
entendido que la afinidad describe la unin del receptor biolgico a un solo componente
del analito. La avidez es quiz una medida ms informativa de toda la estabilidad o fuerza
de la unin entre el receptor biolgico y el analito [21].

29
Captulo 6. Metodologa

6.1 Vidrio ptico

Para comenzar la transduccin mediante SPR del biosensor un haz de luz atraviesa el
prisma y despus el vidrio ptico, estos acoplados mediante un aceite con el mismo ndice
de refraccin del prisma. Es importante tener en cuenta las caractersticas del vidrio ptico
ya que sobre este se depositan los metales que contendrn al receptor biolgico y es
crucial para la caracterizacin del biosensor.

Al hablar de vidrio ptico nos referimos a un grupo de vidrios con mejores calidades
pticas que los vidrios estndar como el vidrio de sosa y cal o el vidrio borosilicato. El
vidrio ptico es particularmente adecuado para ser utilizado en la fabricacin de
componentes pticos como lentes de precisin ya que su ndice de refraccin es fijo y no
vara como en el vidrio estndar [23].

EL ndice de refraccin del vidrio ptico puede ser desde 1.523 hasta 1.804 [24], para el
presente proyecto se utilizaran portaobjetos de vidrio de 20mm x 20mm x 1mm de espesor
y un ndice de refraccin de n = 1.6160. Con ayuda de una solucin ptica se iguala el
ndice de refraccin del prisma con el del vidrio ptico para evitar que la luz se desvi.
De igual manera el prisma de reflexin trapezoidal tiene un n=1.6160 para el
acoplamiento ptico.

6.2 Importancia de la pelcula delgada de metal en la tcnica de SPR

La resonancia de plasmones superficiales ocurre en los metales debido a la gran cantidad

de electrones libres, cuando se le hace incidir radiacin electromagntica se producen
exitaciones libres, llamadas plasmones, se pueden propagar en la interfase entre un metal
y un dielctrico dando lugar a un plasmon superficial [12].

La frecuencia de resonancia para lminas delgadas y metales a nivel nanometrico es

caracterstica de su tamao y forma debido al confinamiento.

En la construccin del biosensor de SPR se utiliza una lmina metlica de espesor

nanometrico, en la superficie metlica se confinan fuertemente los plasmones

30
superficiales, por lo que son muy sensibles a la presencia de molculas absorbidas en la
superficie [9].

El espesor de la capa de metal es muy importante para el valor mnimo de reflectividad,

el material de la lmina puede ser de plata, oro, cobre y aluminio.

Al utilizar plata u oro para la superficie el valor mnimo de reflectividad respecto al

ngulo de SPR es lo suficientemente agudo y cmodo para detectar, el espesor ptimo
para Au y Ag es de 50nm [17]. En la Figura 10 se muestra la relacin entre el ngulo en
el que se presenta la SPR y el valor minimo de reflectividad para cada grosor de superficie
de oro, se puede apreciar en la imagen que con un espesor de 50nm se obtiene el valor
minimo de reflectividad en comparacin con los dems espesores.

Figura 10. Angulo de SPR en relacin con la Reflectividad [13].

La curva de plata tiene un mnimo de reflectividad ms agudo que el del oro, adems con
superficies de Ag se obtiene gran amplificacin del campo superficial, por otra parte la
superficie de oro brinda mayor resolucin y sensibilidad. Ambas superficies de oro y plata
pueden reaccionar fcilmente con los grupos tiol para uniones estables, por lo que son
sustratos adecuados para la colocacin de monocapas auto-ensambladas (SAM). El oro
es ms estable ante solventes y soluciones utilizadas frecuentemente [17].

Para el oro el espesor ptimo es de 45nm a una longitud de onda de 790nm [17], aunque
se han realizado experimentos con diferentes longitudes de onda como 670nm con 50nm
de oro obteniendo buenos resultados [5].

31
El oro se deposita sobre una capa de cromo an ms delgada regularmente de 2nm a 5nm
[15] [5] que asegura la sujecin del oro en el sistema [25] . En este trabajo se propone
depositar una capa de 45nm de oro sobre una capa de cromo de 5nm, las capas son
compatibles con las longitudes de onda de 650nm y 850nm del equipo NanoSPR-06.

6.3 Tecnologa microfludica en el diseo del biosensor

Actualmente se desarrolla la tecnologa en sistemas Lab on a Chip que con base en el

desarrollo de la nanotecnologa, microelectrnica y microfluidica, plantea integrar
pruebas elaboradas en el menor espacio posible. Las principales ventajas del desarrollo
de dispositivos microfludica: son un bajo consumo de reactivos, muestras y energa en
un mnimo espacio.

Inspirados en la tecnologa Lab on a Chip, el diagnstico clnico pretende crear pruebas

de deteccin o control de padecimientos que sean confiables, descentralizadas, es decir
que no se necesite realizar la prueba en un laboratorio especializado (ejemplo: el
glucmetro en el control de la diabetes), adems se busca simplificar el anlisis al utilizar
la menor cantidad de recursos en la prueba, que la prueba sea menos contaminante, de
bajo costo y con posibilidad de produccin masiva [26].

La tcnica de SPR es un fenmeno muy sensitivo a las propiedades dielctricas de la

interfaz, por lo que es utilizado en Bimedica para el desarrollo de biosensores en la
deteccin de bimoleculas en la superficie. Los sensores que se basan en la tcnica de
SPR presentan un fenmeno esencialmente superficial por lo que se han realizado
sensores mediante la tcnica de SPR integrando el estudio de la microfludica.

Algunas ventajas de integrar la tecnologa microfludica en la tcnica de SPR son [27]:

Manejo de pequeos volmenes.
Aumento de la velocidad de reaccin.
Reconocimiento molecular ms eficiente.
Aumentar el rendimiento de la prueba al proporcionar un mejor suministro en el
flujo de la muestra, si en un mismo chip se realizan mltiples test con distintos
receptores inmovilizados.

32
6.4 Material de la celda microfludica

Para el diseo de la celda microfluidica donde circular la muestra biolgica, se plantea

utilizar moldeo con polmeros debido a la versatilidad para disear nuevos modelos, fcil
acceso y bajo costo en comparacin a dispositivos de vidrio o silicio [28]. A continuacin
se mencionan algunas propiedades polmeros utilizados para moldeo que se proponen
para ser usados en la construccin de nuestra celda microfluidica.

6.4.1 PDMS (polydimethylsiloxane)

Mediante la utilizacin del PDMS en teora es posible fabricar estructuras

nanomtricas, se han logrado fabricar dispositivos con una mayor resolucin de
100nm [28].
Sus propiedades sufren muy poca variacin con el transcurso del tiempo, es
considerado un material de buena durabilidad.
Tiene baja conductividad elctrica y baja permeabilidad al agua [29].
Presenta transparencia ptica hasta 300nm, es homogneo e isotrpico [29].
Se pueden disear dispositivos de topologa compleja incluso en donde esta puede
ser controlada eficazmente, para la creacin de estructuras se pueden utilizar
resinas con fotolitografa o moldeo de rplicas.

Se pueden generar defectos en los patrones formados debido a la adhesin, la gravedad y

las fuerzas capilares sin embargo el PDMS es un material muy utilizado en la fabricacin
de micro-estructuras debido a su buena resolucin [28].

La fabricacin de canales microfluidicos en el PDMS se puede realizar mediante

fotolitografa con resinas positivas y negativas, es un proceso bastante utilizado en la
creacin de estos canales [28]9.

6.4.2 PMMA (polymethylmethacrylate)

El PMMA se ha utilizado comnmente en la creacin de chips microfluidicos debido a

su costo accesible, transparencia, buenas propiedades pticas, mecnicas y qumicas,
biocompatibilidad, etc [30]. Algunas propiedades particulares son:

33
 Fuerte dependencia de la viscosidad con la temperatura, lo que permite solucionar
problemas de huecos en el moldeo al aumentar ligeramente la temperatura [31].
Es un plstico amorfo con una transparencia que no difiere mucho a la del vidrio
[29].
Se pueden fabricar dispositivos con dimensiones por debajo de los 30nm [32].
Es un material muy hidrfobo, por tanto difcil de mojar [33].
Genera EOF (fluido electroosmotico) estable al aplicar un campo elctrico en
microcanales.

6.4.3 Comparacin de PDMS y PMMA

El PDMS se deforma ms fcilmente que el PMMA al sufrir una presin, razn por la
cual puede ser utilizado en dispositivos mircrofluidicos como membranas activas pero no
puede circular sobre sus canales la mayora de solventes orgnicos [31].

El PMMA tiene ventaja sobre el PDMS en la realizacin de dispositivos ya que se pueden

usar diferentes mtodos de construccin dependiendo de la aplicacin, regulando la
temperatura o aadiendo alguna sustancia para mejorar cierta propiedad [31].

Para la creacin de dispositivos microfluidicos, la implementacin del PMMA es ms

compleja que la del PDMS debido a que se debe dar ciertos tratamientos fisicoqumicos,
trmicos y con diferentes sustancias [30], que si bien podran ofrecer algunas ventajas por
ejemplo de resolucin en los microcanales o cristalinidad, estas ventajas no seran
necesarias en el diseo de nuestra celda. El moldeo mediante PDMS para la construccin
de dispositivos microfluidicos es un proceso ms sencillo que no requiere se sustancias
extras para utilizarlo, al final requiere de un proceso de horneado por cierto tiempo [28].

Las propiedades que debe cumplir el material para la creacin de la celda microfluidica
son:

Bajo costo
Fcil acceso
Resolucin de al menos 100nm para canales microfluidicos (estas dimensiones
nos permiten comprobar a escala micromtrica el fenmeno de SPR)
Fabricacin o preparacin sencilla

34
Tabla 1. Comparacin entre materiales, PDMS y PMMA.

Caracterstica PDMS PMMA

Bajo costo $0.036 pesos por gramo $0.0276 pesos por gramo
[34] [35]

Fcil acceso Cumple Cumple

Resolucin mnima de Cumple Cumple

100m

Fabricacin o Cumple Fabricacin en moldeo ms

preparacin sencilla en compleja que el PDMS,
moldeo por procesos ms
especficos.

De la Tabla 1 se puede decir que ambos materiales cumplen con la resolucin necesaria
para la fabricacin de los microcanales, el PMMA es ms econmico que el PDMS pero
el PMMA requiere un proceso ms complejo de preparacin.

El PMMA se puede utilizar en la creacin de dispositivos microfluidicos mediante

mtodos de construccin especficos dependiendo la aplicacin [30], sin embargo la
fabricacin de la celda mediante PDMS utilizando litografa por resinas positivas y
negativas le da ventaja en nuestra eleccin ya que adems de cumplir con las dems
caractersticas es fcil de construir [28].

6.5 Deposito de Oro y Cromo sobre vidrio optico

La fabricacin del chip sensor se llevar a cabo mediante el depsito de pelculas delgadas
sobre vidrio ptico con una superficie plana de 20x20 mm. Se deposita una pelcula de
cromo (Cr) con un espesor de 5 nm y una de oro (Au) de 45 nm como se puede observar
en la Figura 11.

35
 Figura 11. Vidrio ptico con pelcula de Cr y Au.

La fabricacin de este tipo de dispositivos se puede realizar utilizando diversos mtodos

de deposicin de pelculas delgadas de metales y la tcnica a emplear va a depender de
los espesores, es por ello que se van a tomar como criterio generalizado valores de espesor
menores o iguales a 1 m como lminas delgadas [36].

Entre las tcnicas para la deposicin de metales tenemos la evaporacin trmica, la cual
puede efectuarse por calentamiento resistivo o mediante bombardeo de electrones, as
como la pulverizacin catdica o sputtering por su designacin en ingls.

6.5.1 Evaporacin trmica en vaco

La evaporacin trmica hace referencia a mtodos en los que el material es depositado

en su fase de vapor mediante calentamiento o bombardeo con electrones. Este tipo de
mtodos se usan para la fabricacin de pelculas delgadas de diversos tipos de materiales,
fundamentalmente de carcter metlico [37]. El vapor generado, ya sea que se d por
ebullicin o sublimacin del material, se va colocando sobre un sustrato que hace que se
condense formando una pelcula slida sobre la superficie del mismo [36].

Este tipo de mtodos requiere de un vaco alto o ultra alto (con presiones menores a 10-12
Pa), esto con la finalidad de que el material evaporado llegue a la superficie del sustrato
sin sufrir colisiones en el camino, adems de evitar que la pelcula formada reaccione con
el gas circulante y evitar problemas asociados a la oxidacin a altas temperaturas [38].

Una de las ventajas que presenta la evaporacin como tcnica de deposicin es que puede
llevarse a cabo mediante un montaje sencillo con la posibilidad de evaporar materiales en
forma simple como polvo, hilo o pastillas, y cuando se trata de metales con bajo punto de
fusin, la evaporacin se puede efectuar con equipos de diseo relativamente sencillos y
de bajo coste.

36
El proceso de evaporacin se efecta con la presin residual de la cmara de vaco (Figura
12) del sistema, lo que hace que el recorrido libre de las partculas del material sea tal,
que es del orden de las dimensiones de la cmara y esto hace que las partculas evaporadas
describan una trayectoria casi rectilnea, sin colisiones con el gas, hasta alcanzar la
superficie donde se va a formar la pelcula, considerndose sta tcnica como un proceso
direccional donde solo la superficie que est a la vista desde la fuente de evaporacin
queda recubierta [37].

Figura 12. . Deposicin a partir de evaporacin trmica [38].

Para la formacin de las pelculas delgadas se deben considerar algunos factores para que
el producto final sea el mejor deseado como es el tipo de material, la presencia de
dopantes como impurezas o no, la temperatura del sustrato ya que ste es el responsable
de la desorcin y disociacin, as como la orientacin superficial [36]. De igual manera,
la temperatura a la cual es sometido el material a la hora de su evaporacin, ya que el
tamao de grano del material va a variar dependiendo las diferentes temperaturas a las
que se someta, esto sin modificar el espesor de la pelcula delgada [38].

La velocidad a la cual va ir creciendo la pelcula es del orden de entre 0.1 a 1 nm/s, lo que
ayuda a obtener recubrimientos en el orden de micrmetros e incluso nanometros [37],
lo cual para este trabajo es de suma importancia por los requerimientos de los espesores
de las pelculas de Cr y Au a utilizar.

6.5.2 Evaporacin por calentamiento resistivo

El proceso de evaporacin por calentamiento resistivo consiste en hacer pasar corriente

elctrica por un material, que suele ser metales refractarios de alto punto de fusin como
el tantalio (Ta), el molibdeno (Mo) y el tungsteno (W) [37]. En la figura 13 se puede ver:
a) Un filamento o hilo en forma de espiral que rodea el material a evaporar, por el cual se
hace pasar corriente elctrica hasta que el hilo alcanza la temperatura, donde es

37
conveniente que el material a evaporar, cuando alcance el punto de fusin, moje el metal
para evitar el desprendimiento. b) Una banda metlica generalmente usada para evaporar
material en forma de polvo, estando en el exterior de la campana de vaco la fuente de
alimentacin elctrica de bajo voltaje y alta corriente, evitndose las descargas elctricas
entre los hilos de contacto. c) Un crisol cermico calentado a travs de un arrollamiento
metlico por corriente elctrica o induccin de radio frecuencia, empleando materiales
como grafito, xidos y nitruros refractarios (almina, nitruro de boro, etc.), que son muy
inertes a las temperaturas de fusin de un gran nmero de materiales [39].

Figura 13. . Soportes de calentamiento resistivo: a) Filamento, b) Banda metlica y c) Crisol [38].

Cuando se van a evaporar metales voltiles y que subliman antes de fundir, es decir, que
la temperatura de evaporacin es inferior a la temperatura de fusin se opta por un sistema
ms simple de calentamiento, que consiste, ya sea en pasar corriente elctrica
directamente al material en caso de que se un metal, o bien, usar un horno auxiliar.

Considerando que se busca tener una pelcula delgada uniforme a lo largo de toda la
superficie, durante todo el proceso de evaporacin se rota el sustrato y as favorecer un
crecimiento y espesores uniforme [40].

Un inconveniente que se puede encontrar en este mtodo de depsito de metales es la

necesidad de calentar primero el contenedor que va a calentar el material teniendo una
prdida de eficiencia, adems, de que en algunos casos, el contenedor puede formar
aleaciones con el material, lo que produce impurezas en la pelcula formada [38].

Dentro de otras desventajas que se pueden mencionar al usar este proceso, tenemos que
no se puede controlar directamente la temperatura del material a evaporar, sino que se
controla la potencia aplicada al contenedor por lo que la cantidad de material evaporado
no es controlado durante el procedimiento, hacindolo an ms difcil cuando es por
largos periodos de tiempo [40].

38
6.5.3 Evaporacin por haz de electrones

La evaporacin por haz de electrones consiste en hacer incidir directamente en un

bombardeo de electrones sobre el material a ser evaporado para su calentamiento, el cual
est contenido generalmente en un crisol que es enfriado, de esta forma se logra un
calentamiento ms eficiente [38].

El haz de electrones es producido por un can de electrones generalmente en el orden

de KeV. Dicho can est formado por un filamento incandescente que es el ctodo, el
cual emite electrones por emisin termoinica acelerados hacia un nodo polarizado a
una alta tensin. El nodo puede ser el crisol donde se encuentra el material, o bien, un
disco perforado ubicado en sus proximidades, adems, frecuentemente se agrega un
campo magntico con la finalidad de controlar la trayectoria de los electrones y dirigirlos
hacia el crisol (Figura 14) [37].

Figura 14. . Evaporacin por haz de electrones [39].

Este mtodo permite focalizar el haz de electrones en un punto o haciendo un barrido

sobre la superficie, esta incidencia del haz libera una alta densidad de potencia, facilitando
la evaporacin de materiales de alto punto de fusin, adems, como se mencion
anteriormente, el crisol se va enfriando para evitar los problemas de contaminacin
asociados a la desgasificacin por calentamiento de las paredes de la cmara de vaco
[37].

6.5.4 Pulverizacin Catdica o Sputtering

La tcnica de pulverizacin catdica o sputtering consiste en el bombardeo intenso de un

material con los iones producidos en una descarga elctrica en forma de plasma. Cuando

39
la energa de los iones incidentes es suficientemente elevada, la interaccin con la
superficie del material hace que los tomos de la superficie sean arrancados, para pasar a
la fase de vapor.

El mtodo de sputtering consiste primero en la descarga elctrica entre dos electrodos en

una atmsfera de gas inerte, el material a bombardear ser el ctodo, despus se generar
una aceleracin de los iones positivos hacia el mismo y habr un bombardeo de la
superficie del substrato teniendo una transferencia del momento cintico y as una
pulverizacin del material [40].

En la figura 15 se presenta el esquema del sistema del proceso de sputtering, el electrodo

superior, el cual est conectado a la terminal negativa de la fuente de alimentacin, acta
como ctodo de la descarga elctrica, tambin denominado blanco de sputtering. El
ctodo est sometido al bombardeo de iones positivos de la descarga una vez que son
acelerados desde el plasma como consecuencia de la cada de potencial del plasma, dicho
bombardeo produce el efecto de pulverizacin del blanco, adems causa emisiones de
electrones secundarios que son acelerados hacia el plasma. Una vez en el plasma, estos
electrones tienen energa suficiente para producir nuevos iones mediante procesos de
ionizacin en cascada por impacto con los tomos del gas, compensando as la prdida de
carga producida por colisiones de las especies cargadas en las paredes de la cmara de
vaco u en los electrodos. Se dice entonces que la descarga es automantenida [37].

Figura 15 . Proceso de pulverizacin catdica [38].

El gas de la descarga suele ser argn, un gas inerte de masa elevada, mientras que para el
nodo se ocupa un material conductor, usualmente acero inoxidable, que est conectado
al potencial de tierra junto a la campana de vaco por razones de seguridad. Por lo ltimo,

40
los sustratos a recubrir estn colocados sobre el nodo, o bien, frente al ctodo sobre un
soporte auxiliar [37].

La velocidad del proceso depende de factores como: energa y masa de los iones
incidentes, nmero atmico y temperatura del blanco, ngulo de incidencia de los iones,
tipo de blanco (aleacin, compuesto, cristalino) [41].

Las partculas pulverizadas pueden alcanzar al substrato desde cualquier direccin

resolviendo problemas de direccionalidad y los de homogeneidad del espesor de la capa
depositada, adems de que la trayectoria de las partculas pulverizadas no es rectilnea
debido a que el recorrido libre medio es del orden de unos pocos milmetros. Por otro
lado, el gas inerte y la radiacin que proviene del plasma, tambin interaccionan con la
superficie de los substratos ocasionando efectos colaterales como es contaminar la capa
depositada en el substrato.

6.5.5 Comparacin de tcnicas de depsito de metales para pelculas delgadas

Las tcnicas de deposicin de materiales para formacin de pelculas delgadas se pueden

diferenciar, entre otras cosas, por el acabado de las lminas, costo, montaje del sistema,
velocidad de deposicin del material as como su control y de los parmetros fsicos y
qumicos que intervienen.

De las tcnicas antes citadas, la pulverizacin catdica se presenta como una de las
tcnicas ms avanzadas y con mejores caractersticas para efectuar el depsito de un gran
nmero de materiales, siendo este un proceso ms controlado en comparacin con la
evaporacin por calentamiento resistivo y por haz de electrones. Sin embargo, el
complejo sistema y componentes requeridos para efectuarlo lo hacen ms costoso. Entre
las ventajas ms destacadas de esta tcnica podemos mencionar que [37]:

No hay necesidad de calentar el blanco puesto que la temperatura para la

deposicin de las pelculas delgadas es baja.
Se pueden evaporar materiales de alto punto de fusin, as como de diferentes
tipos aparte de metales, como materiales conductores, aislantes de tipo cermico,
etc.
Para la deposicin de mezclas y aleaciones se mantiene la composicin del blanco.

41
 La pelcula depositada tiene buena adherencia debido a la alta energa de llegada
de los tomos pulverizados a la superficie del substrato.
La velocidad de deposicin es fcilmente controlada debido al control de
velocidad de erosin del blanco a travs de la potencia aplicada en la descarga.

Por otra parte tenemos la evaporacin trmica en vaco, donde se deriva la evaporacin
por calentamiento resistivo y la evaporacin por haz de electrones, que tienen como
ventaja la sencillez de su montaje para su realizacin, lo que las hace de menor coste en
comparacin con la pulverizacin catdica.

La evaporacin por calentamiento resistivo comparado con el mtodo de haz de

electrones es ms costosa ya que los elementos que conforman el sistema son ms
complejos, se requieren pasamuros especiales de alta tensin y sofisticados equipos
electrnicos de alimentacin y control de haz de electrones. A pesar de esto, es un proceso
adecuado para materiales que tienen un alto punto de fusin logrndose con una moderada
carga trmica en el sistema de vaco, adems de que permite un mayor control de
temperatura del crisol y con ello de la velocidad de evaporacin. Debido a ello, esta
tcnica es ampliamente utilizada en la tecnologa de capas delgadas [37].

Para este trabajo se ocupa la tcnica de evaporacin por haz de electrones para el depsito
de pelculas delgadas.

La razn por la cual se descarta la pulverizacin catdica, siendo que sta presenta ms
ventajas respecto al acabado de pelculas delgadas y control del procedimiento, es el costo
de los materiales y la complejidad del sistema.

En la evaporacin por bombardeo de electrones de igual manera se puede tener un control

de la velocidad de evaporacin de los metales debido a la manipulacin de la temperatura
y as obtener los espesores especificados para el chip sensor.

Ahora bien, uno de los principales inconvenientes de la evaporacin por calentamiento

resistivo es que solo se puede depositar un solo material a la vez con el equipo al que se
tiene acceso, lo que hara que a la hora de introducir el segundo material a la cmara de
vaco, en este caso el oro, se pueden agregar impurezas del exterior por la exposicin al
medio de la primera capa, que es el cromo, caso contrario en la evaporacin por haz de
electrones, ya que est mtodo nos permite colocar dentro del sistema los dos materiales

42
para su evaporacin y deposicin en orden y espesores sin afectar el montaje durante todo
el procedimiento.

6.6 Tcnicas de fabricacin de celda de flujo

La construccin de la celda de flujo consiste en fabricar los microcanales donde va a fluir

la muestra biolgica a analizar y el cuerpo de la celda.

La celda de flujo est constituida por PDMS, un tipo de polmero prctico de manejar
sobre moldes por su fcil desprendimiento y replica de mscaras o relieves a pequeas
escalas.

Con el PDMS se busca generar la estructura de la celda de tal forma que sta sea
compatible con el equipo de medicin de SPR, adems de replicar los microcanales por
medio de un molde a una resolucin de 100 micras, fabricado por el mtodo de
fotolitografa.

6.6.1 Fotolitografa

La Fotolitografa es una tcnica que permite transferir o copiar un diseo y plasmarlo en

alguna superficie plana de algn material, sustrato o resina, que sean sensibles a la fuente
de luz que se est utilizando [33]. En este trabajo, el proceso de fotolitografa se realiza
mediante una mscara que contiene el diseo de los microcanales.

La fotolitografa consiste en depositar una capa de fotoresina sobre el sustrato, que

normalmente se trata de una oblea de silicio. Sobre la fotoresina se proyecta luz
ultravioleta a travs de una mscara que contiene el patrn a grabar [28]. El diseo de la
mscara depende del tipo de fotoresina que se usa para el procedimiento, de las cuales
podemos encontrar de dos tipos, positiva y negativa.

Para la fotoresina positiva, la resina se expone a la luz UV donde el material que no va a

formar parte del molde debe ser removido. En este tipo de resina, la exposicin a la luz
UV cambia su estructura qumica ocasionando que el material se vuelva ms soluble en
el revelador. La resina expuesta es retirada por la solucin reveladora, por lo tanto, la
mscara contiene una copia exacta del patrn que debe permanecer en el sustrato [42].

43
En el caso de la fotoresina negativa el comportamiento es de manera opuesta. Cuando se
expone a la luz UV, la resina negativa permanece sobre la superficie del sustrato donde
est expuesta y la solucin reveladora elimina solamente las reas no expuestas. Por lo
tanto, las mscaras utilizadas para fotoresinas negativas contienen el negativo inverso del
patrn. La figura 16 muestra las diferencias de patrones generados por el uso de una
fotoresina positiva y negativa [42].

Figura 16. . Patrn generado a partir de la fotolitografa en fotoresina positiva y negativa [43].

6.6.1.1 Fotoresina positiva y negativa para fotolitografa

La resina o fotoresina es un polimero tipo epxico de radicales libres positivos o

negativos, creado exclusivamente para la manufactura de circuitos integrados, ideal para
la fabricacin de microcomponentes y otras aplicaciones de la microelectrnica [44] [43].

La principal diferencia entre la fotoresina positiva y negativa est en el espesor de la capa

que permite cada una de ellas para la fabricacin de moldes. La fotoresina positiva
permite realizar capas con espesores de aproximadamente desde 0.5 a 3.5 micras [44],
mientras que la fotoresina negativa permite espesores por capa de 0.5 a 200 micras [43].

Para el desarrollo de este trabajo se requiere que el molde tenga relieves de

aproximadamente 100 micras, por lo que se usa la resina negativa ya que nos da
resoluciones ms grandes en comparacin con la resina positiva, lo que nos permite llegar
al espesor deseado con un menor nmero de capas o inclusive en una sola capa.

44
6.6.1.2 Proceso de creacin de microcanales por fotolitografa

La mscara para la fundicin de la estructura PDMS se realizar mediante el proceso de

fotolitografa con fotoresina negativa, por lo que al verter el PDMS ste llena las regiones
abiertas que el molde haba dejado.

El proceso es el siguiente [45]:

1. La fotoresina negativa SU-8 se vierte sobre una oblea de sustrato. El Si es

ideal para este propsito. Las curvas de rotacin disponibles del proveedor son
tiles para estimar la velocidad de rotacin y el tiempo para aplanar la capa
uniforme de espesor.
2. Cualquier burbuja vista en la fotoresina debe ser retirado, preferiblemente por
la desgasificacin de la resina fotosensible antes de su uso. El calentamiento
de la resistencia de 50 a 60 C ser de ayuda.
3. Se precocina el SU-8 bajo un horneado suave hasta que el disolvente se
evapore en la preparacin para la exposicin. Aqu primero se prehornea el
SU-8 a 90 C en una placa caliente de Al pulida durante 75 minutos; subimos
la temperatura de 5 C para dar una mejor adhesin. En general, cuanta ms
gruesa es la pelcula, ms tiempo se tarda en completar la evaporacin del
disolvente; esto representa un lmite en el espesor mximo de la pelcula
hilada.
4. Montado el SU-8 cubierto con la mscara de la oblea encima de l, se expone
a la radiacin UV con una longitud de onda de 350-400 nm. De igual manera,
el proveedor proporcionar una estimacin de la energa en comparacin con
la exposicin grafica del espesor de la pelcula.
5. Para la realizacin de estructuras ms gruesas se pueden lograr mediante la
repeticin de los pasos 1 a 4 y luego continuar hacia adelante.
6. Se vuelve a colocar la oblea sobre la placa calienten para hornear las partes
expuestas a la radiacin UV de la SU-8 para su desarrollo. Aceleramos la
coccin hasta 15 minutos a 90C a 5C/min y la rampa de bajada despus de
este tiempo a la misma velocidad observando que durante la coccin se reduce
la aparicin de grietas.

45
El desarrollo de microcanales usando SU-8 es bsicamente sencillo, solo requiere
experimentos de prueba y error, despus de esto se tendr un molde terminado para su
uso en la colada para verter el PDMS.

6.6.2 Molde para estructura de celda de flujo

Para la creacin del cuerpo de la celda de flujo se disea un molde para generar la
estructura fsica que se ajuste al equipo de medicin. Este molde se realiza mediante
impresin 3D. En la figura 17 se muestra una propuesta de molde, que consta de 2 piezas.

Figura 17. Molde donde se verter el PDMS para formar la celda de flujo

El molde se disea tomando en cuenta la ranura de la celda que debe embonar en equipo
de medicin NanoSPR6/321.

6.7 Fabricacin de la celda microfludica de PDMS

La fabricacin de la celda de flujo consiste en la preparacin del PDMS, que se mezcla

con el agente curante Sylgard 184 en una proporcin 1:10 del polmero respecto al
elastmero. La mezcla genera burbujas por la agitacin, por lo que para retirarlas se
introduce en una cmara de vaco que extraer el aire generado. El PDMS se vierte en el
molde de la celda que anteriormente tiene que fijarse sobre el sustrato con los
microcanales para posteriormente hornear a una temperatura de 95C por 3 horas o a 60C
por un tiempo de al menos 15 horas (Figura 18).

46
a) b)

c) d)

Figura 18. A) Componentes PDMS, b), Mezcla de componentes, c) Vertido de PDMS en moldes, d) Horneado de
PDMS

47
Captulo 7. Desarrollo experimental

7.1 Diseo del biosensor para ser compatible con el equipo de medicin de SPR.

7.1.1 NanoSPR 6, Modelo 321

El equipo de medicin del biosensor NanoSPR6/321 (Figura 19), es un dispositivo de

espectrometra de resonancia de plasmones superficiales, el cual cuenta con dos canales
electroqumicos lo cual permite en dado caso, analizar dos compuestos de manera
independiente.

Figura 19. Equipo de medicin de resonancia de plasmones superficiales NanoSPR 6/321.

El equipo es generalmente utilizado en tcnicas de medicin en biosensores en tiempo

real, investigacin de tamaos de objetos nanomtricos o nanopartculas, estudios de
reacciones electroqumicas como la adsorcin, as como la caracterizacin de delgadas
pelculas orgnicas e inorgnicas y mediciones de ndice de refraccin [46].

El equipo de medicin NanoSPR6 es distribuido por la empresa NanoSPR la cual se

especializa en dispositivos y accesorios para resonancia de plasmones superficiales. El
equipo cuenta con dos canales pticos y uno electroqumico, el rango de medicin del
ndice de refraccin va de 1 a 1.5 con una sensibilidad de 0.0002, el escaneado mximo
angular es de 17, puede obtener una sola curva de medicin de resonancia en 3 segundos,
tiene termoestabilizacin hasta 60C, su fuente de luz proviene de un lser semiconductor
de GaAs con longitudes de onda de 650 nm a 2-3 mW, 650 nm a 7-8 mW o 850 nm a 2-
3 mW, las dimensiones totales de la unidad de medida son de 215x130x100 mm, el equipo
peso aproximadamente 2.2 kg, la conexin a la computadora en mediante cable USB y el
software de procesamiento y control de datos es compatible en sistemas operativos
windos XP, Vista, 7, 8 y 10 [47].

48
7.1.2 Chip sensor comercial

El chip sensor comercial est conformado por tres componentes, un vidrio ptico con
dimensiones de 20x20x1 mm, recubierto en una de las superficies de 20x20 por una capa
de Cr con un espesor de 5nm y sobre el Cromo una pelicula de Au de 45nm, sumando
as aproximadamente 50 nm, un empaque de silicn que cuenta con dos cpsulas y una
celda de flujo de acrlico que tiene canales de entrada y salida dirigidos a las cpsulas del
empaque de silicn (Figura 20).

Figura 20. . Componentes de Chip sensor comercial (Vidrio ptico, empaque de silicn, celda de flujo).

7.2 Diseo de Celda de Flujo

La funcin de la celda de flujo es dirigir la muestra biolgica hacia la superficie de oro

del chip sensor, es ah donde el analito a detectar se adhiere, esta adhesin la realiza un
receptor biolgico que anteriormente se inmoviliz sobre la superficie metlica.

Para el diseo de la celda de flujo primeramente se hizo un anlisis de las dimensiones

fsicas de la celda de flujo comercial (Figura 21), los canales de la celda y las cpsulas
del empaque forman el volumen de muestra biolgica que entra al dispositivo que es de
aproximadamente 45.55L, de los cuales corresponden 37.01L a la cpsula y 8.54 L a
los conductos de entrada y salida (Figura 22).

Figura 21. Dimensiones fsicas de la celda comercial

49
 Figura 22. Volumen de muestra biolgica de chip sensor comercial.

Una caracterstica del prototipo es el volumen de muestra a introducir en los

microcanales, este reduce a 18 L el volumen total de la muestra para la prueba, es decir
1.618 L corresponden al volumen en el microcanal y 16.418 L de los conductos de
entrada y salida del fluido. En la siguiente imagen se observa la proyeccin isomtrica,
vistas y medidas en mm de nuestro prototipo (Figura 23).

Figura 23. Prototipo de Chip Sensor.

Con la ayuda de SolidWorks y la herramienta FloXpress se realiz una simulacin de la

velocidad de flujo dentro de los canales y la microcelda. Sabiendo que la celda tiene un
volumen de 1.6 L se propuso una velocidad de 2 L/s.

A continuacin en la Figura 24 y en la Figura 25 se muestra la velocidad de flujo dentro

de la celda de cada uno los chips sensores, el comercial y el prototipo.

50
 Figura 24. Velocidad de flujo de agua dentro del Chip sensor comercial.

Figura 25. Simulacin de velocidades agua dentro del prototipo de chip sensor.

La velocidad mxima alcanzada para el caso de chip sensor comercial es de 0.008 m/s
mientras que para el prototipo es de 0.021 m/s. Se puede observar que en el prototipo se
alcanza una mayor velocidad de flujo dentro del canal, esto se debe a la cantidad de
volumen necesario para llenar cada celda, finalmente concluimos que no nos afecta el
aumento de la velocidad de flujo puesto que en el ensayo la solucin primero se introduce
dentro de la celda y se encuentra esttica para la prueba.

51
7.3 Impresin 3D de molde para celda de flujo

Se dise un molde compuesto de dos piezas para dar forma a la celda de flujo, en base
a las dimensiones especficas para ser ajustada en el equipo de medicin de resonancia de
plasmones superficiales NanoSPR/321.

Figura 26. Dimensiones fsicas del molde de la celda prototipo

El molde se fabric en la impresora 3D Proyectil FDM/20 (Figura 27a) que se apoya del
software Repetier Host para la preparacin de las piezas a imprimir. La impresin del
molde que se constituye de dos piezas (Figura 27b) se efectu en aproximadamente 2
horas.

a) b)

Figura 27. A) Preparacin de piezas del molde para impresin 3D. B) Impresin del molde de celda.

EL material utilizado para la impresin del molde es PLA (Figura 28) el cual se imprimi
a una temperatura de 210C con una velocidad de 60 mm/s.

52
 Figura 28. . Material (PLA) para impresin 3D.

7.4 Creacin de microcanales mediante fotolitografa

Para la fabricacin de los microcanales mediante fotolitografa se utiliz un cuarto de la

oblea de silicio como la que se muestra en la Figura 29 de 4 pulgadas de dimetro y calibre
de 525 m.

Figura 29. Oblea de Silicio.

Se realiza limpieza para preparar la oblea (Figura 30), que consiste en colocar la oblea en
una caja de petri y agregar acetona hasta que quede cubierta completamente, se coloca la
caja dentro de un equipo de limpieza ultrasonica y hacerlo vibrar durante 5 min. Este
proceso se repite con alcohol isoproplico y agua, al termino de la limpieza se sopletea
con aire comprimido para el secado de la oblea.

53
 Figura 30. Limpieza de oblea

Despues de la limpieza se coloca la oblea de silicio dentro de una lmpara de luz UV con
ozono (Figura 31), por un periodo de 5 min. para dejar un acabado hidroflico en la
superficie que ayuda a que la resina se distribuya uniformemente.

Figura 31. Lmpara de luz UV con ozono (UV Ozone Cleaner ProCleaner).

Continuando con el proceso de fotolitografa, se coloca la oblea en el electroaplicador

(Brewer Science 200x), donde se fija con vaco y se vierte 1.5 ml de resina negativa SU-
8 3050 por cada cuarto de oblea de 4 in. (Figura 32a). Se configura el equipo para que
gire a 500 rpm por 10s y 1000 rpm por 45s (Figura 32b), estas velocidades y tiempos son
considerados para obtener un espesor de 100 micras de la resina. Las velocidades de giro
y tiempos son basados en las recomendaciones de la resina SU-8 3050 que se encuentran
en las especificaciones del producto, sin embargo, de acuerdo a los resultados obtenidos
en las diferentes pruebas, las velocidades y tiempos que se ocuparon son los mencionados
anteriormente (Grfica 1).

54
 a) b)

Figura 32. a) Colocacin de la resina negativa SU-8, b) Configuracin de equipo Brewer Science 200x.

Grfica 1. . Relacin de espesor respecto a la velocidad de giro recomendada de acuerdo al tipo de resina SU-08
3000 a una temperatura de 21C [48].

Despues de girar la oblea en el electroaplicador, se retira de ste y se coloca sobre una

placa de temperatura regulable a 95C durante 45 minutos, como se muestra en la Figura
33. Al termino de los 45 min se deja enfriar por 3 minutos a temperatura ambiente.

55
 Figura 33. Colocacin de la oblea sobre la placa de temperatura regulable a 95C por 45 min.

En esta siguiente etapa se utiliz una mscara la cual est constituida por un vidrio de
10x10x1 mm y la imagen de los microcanales que se muestra en la Figura 34a. En la
Figura 34b se muestran las medidas especficas de los microcanales. La mscara se realiz
con un plotter cortador para serigrafa en un papel adhesivo, esta se adhiere al vidrio que
previamente se limpia con el mismo procedimiento que la oblea de silicio.

a) b)

Figura 34. a) Imagen de microcanales en papel adhesivo, b) Dibujo acotado de los microcanales

Para continuar, se sobrepone el vidrio con la imagen de los microcanales en la oblea de

silicio en la posicin donde quedarn grabados los relieves de los mismos. Se expone el
arreglo a radiacin UV (Figura 35), a una potencia de 20 mW por un lapso de 60 s (la
potencia y el tiempo de exposicin recomendado se toman de la hoja de especificaciones
de la resina negativa) (Tabla 2).

56
 a) b)

Figura 35. a) Superposicin de la mscara sobre a oblea con la resina, b) Exposicin de radiacin UV de la resina
negativa con la mscara para grabado de microcanales.

Tabla 2. Energa de exposicin de luz UV de acuerdo al espesor deseado de resina.

Al trmino de la explosin de radiacin UV, la oblea de silicio se lleva a la placa de

temperatura regulable a 65C por 60 s, despus se aumenta la temperatura a 95C y se
deja ah por 5 min, se retira la oblea de la placa y se deja enfriar al menos 3 min.

Para la etapa final de la fotolitografa, se sumerge la oblea de silicio en revelador para

resina negativa SU-8 (Figura 36a), agitando constantemente durante 15 min (Figura 36b).

a) b)

Figura 36. a) Revelador de resina negativa SU-8, b) Revelado de la resina.

Se retira la oblea del revelador y se roca alcohol isoproplico por 10 s (Figura 37). Si al
aplicar el alcohol se observa alguna sustancia blanca sobre la superficie de la oblea,

57
significa que el revelador no ha removido por completo la resina, por lo que se debe
sumergir nuevamente al revelador hasta que al rosear alcohol isoproplico no ocurra esto.

Figura 37. Limpieza con alcohol isoproplico.

Finalmente, se roca con revelador limpio por 10 s, se sumerge en alcohol isoproplico y

se seca con aire a presin (Figura 38).

Figura 38. Oblea con reveles de microcanales.

Para corroborar el espesor de los microcanales se utiliza el equipo Veeco Dektak 150
(Figura 39), que mide relieves a nivel micro. El espesor de los relieves de los microcanales
que obtuvimos es de aproximadamente 100 micras.

58
 a) b)

c)

Figura 39. a) Equipo de Medicin Veeco Dektak 150, b) Medicin de la altura de los microcanales con el
perfilometro, c) Obtencin de datos de la altura de los microcanales en el equipo de cmputo.

Como se mencion anteriormente, el espesor de 100 m se obtuvo al realizar diferentes

pruebas. Algunas de las pruebas que se realizaron para llegar al resultado esperado fueron:

De acuerdo a las especificaciones de la ficha tcnica del producto, se coloca 1.5

ml de resina negativa por cada cuarto de oblea de 4 in y se configura el equipo
para que gire a 500 rpm por 10s y 1000 rpm por 30s. Se obtiene en promedio un
espesor 143.3103 m con un ancho de 2.549 mm (Grfica 2).
Despus de los resultados anteriores, se propone aumentar el tiempo de giro para
obtener un menor espesor, colocando igualmente 1.5 ml de resina pero ahora
haciendo girar la oblea a 500 rpm por 10s y 1000 rpm por 60s obteniendo en
promedio un espesor de 82.4824 m y 2.678 mm de ancho (Grfica 3).

59
Grfica 2. Representacin de los datos obtenidos del espesor del microcanal por el perfilmetro (143.3103 m de
espesor y 2.549 mm de ancho).

Grfica 3. Representacin de los datos obtenidos del espesor del microcanal por el perfilmetro (82.4824 m de
espesor y 2.678 mm de ancho).

Basndose en los espesores obtenidos, se propone, para la misma cantidad de 1.5

ml de resina, una velocidad de giro a 500 rpm por 10s y 1000 rpm por 45s,
logrando obtener aproximadamente los 100 m deseados. Se obtuvo un
microcanal con un espesor promedio de 99.0941 m con 1.905 mm de ancho
(Grfica 4) y otro microcanal de 106.1784 m de espesor con 1.891 mm de ancho
(Grfica 5).

60
Grfica 4. Representacin de los datos obtenidos del espesor del microcanal por el perfilmetro (99.0941 m de
espesor y 1.905 mm de ancho).

Grfica 5. Representacin de los datos obtenidos del espesor del microcanal por el perfilmetro (106.1784 m de
espesor y 1.891 mm de ancho).

7.5 Fabricacin de celda de flujo con PDMS

El molde final para crear la celda de flujo est compuesto por la oblea con los relieves de
los microcanales y el molde del cuerpo, los cuales son fijados mediante cinta adhesiva
cuidando que selle correctamente para evitar fugas del PDMS, y poniendo atencin en
centrar el molde del cuerpo sobre la oblea.

61
Para la solidificacin del PDMS el cual se encuentra en estado lquido viscoso, se le
agrega el elastmero de silicona Sylgard 184 en una proporcin 10 a 1, es decir, para 10
ml de PDMS agregamos 1 ml del elastmero de silicona (Figura 40).

Figura 40. PDMS y elastmero de silicona.

Se mezclan perfectamente los compuestos hasta formar burbujas diminutas en toda la

mezcla (Figura 41).

Figura 41. Mezcla de PDMS con agente de curacin.

Ahora con la mezcla lista, se coloca dentro de una cmara de vaco para retirar las
burbujas generadas como se muestra en la Figura 42, hasta que ya no quede aire dentro
del polmero.

62
 Figura 42. Cmara de vaco con mezcla de PDMS en su interior.

A continuacin se realiza el vaciado del polmero dentro del molde final cuidando de no
generar ms burbujas (Figura 43).

Figura 43. Vaciado de PDMS.

Para crear los conductos de entrada y salida de la muestra biolgica hacia los
microcanales se construy una tapa que tiene un tubin de 1mm de diametro para moldear
cada uno de los 4 conductos de entrada/salida (Figura 44).

Figura 44. Tapa para moldear los 4 conductos de entrada y salida.

63
Se lleva con precaucin el molde al horno de secado por aproximadamente 12 horas a una
temperatura de 60C o bien, para un secado ms rpido a 95C por 2 horas (Figura 45).

Figura 45. Secado de la celda de flujo.

Se saca del horno el molde pasando el tiempo estimado y se retira la celda de flujo de
PDMS del molde. Se pueden observar los microcanales en el PDMS en la Figura 46.

Figura 46. Celda de flujo de PDMS.

7.6 Unin de celda de flujo de PDMS y superficie sensora

Una vez fabricada la celda de flujo, sta se adhiere a un vidrio previamente limpio usando
el procedimiento realizado para la oblea de silicio. El vidrio y la celda de flujo se colocan
dentro de la cmara de radiacin de luz UV con ozono (UV Ozone Cleaner ProCleaner
(Figura 47)) por un tiempo de 5 minutos.

64
 Figura 47. Exposicin de radiacin de luz UV con ozono de la celda de flujo y vidrio.

Inmediatamente despus de la exposicin a la radiacin, la superficie de los microcanales

se adhiere al vidrio previamente depositado con Cr y Au (Figura 48), presionando suave
y uniformemente evitando que se generen burbujas entre las superficies. Para completar
la celda se le ajustaron 4 tubos de acero inoxidable de 1mm de dimetro y 35mm de largo
en os conductos de entrada y salida de la muestra, esto para facilitar el manejo del fluido
en las pruebas. En la Figura 48 se tiene el prototipo final, as como en las Figuras 49, 50
y 51 una vista superior, lateral e inferior respectivamente.

Figura 48. Prototipo de celda Final.

65
 Figura 49. Vista lateral del prototipo final de la celda.

Figura 50. Vista superior del prototipo final de la celda, en la imagen se alcanzan a percibir los microcanales.

Figura 51. Vista inferior de la celda microfludica, como la pelcula de Au y Cr son muy delgadas, la luz alcanza a
atravesar.

66
7.7 Diagramas que resumen los procesos de fabricacin

FABRICACIN DE MICROCANALES MEDIANTE

FOTOLITOGRAFA CON RESINA SU-08 3050.

INICIO

Limpieza de la oblea de silicio

Sumergir la oblea en un recipiente con acetona

y colocarlo dentro de la mquina de limpieza
por ultrasonido durante 5 min, repetir este
proceso con alcohol isoproplico y agua.

Introduccin de la oblea de Si
dentro de la cmara de luz
UV/Ozono durante 5 minutos.

Sujecin de la oblea en el spinner,

colocando 1.5ml de resina SU-08 3050
sobre la oblea y para despus girar a
500 rpm por 10s y 1000 rpm por 45s.

Calentamiento de la oblea sobre la placa

reguladora de temperatura a 95C por 45min.
Al terminar dejar enfriar por 3 minutos.

Superposicin de la mscara con el patrn de los

microcanales sobre la resina y exposicin durante 1
min a radiacin UV con una potencia de 20mW.

Calentamiento de la oblea durante 60s a

65C en la placa trmica, despus a 95C
por 5 min y dejar enfriar por 3 min.

Revelado de la resina sumergiendo la oblea por

15 min y agitando constantemente, al terminar
rociar alcohol isoproplico por 10 segundos.

FIN
67
 FABRICACIN DE LA CELDA
MICROFLUDICA

INICIO

Impresin 3D del Preparacin del PDMS con el

molde que forma el agente curante Sylgard 184 en
cuerpo de la celda. una proporcin 10:1.

Construccin del molde final Colocacin de la mezcla dentro de una

fijando el molde del cuerpo de cmara de vaco por aproximadamente
la celda con la oblea que tiene 30 min para eliminar las burbujas
los microcanales. dentro de la mezcla.

Agregacin del PDMS en el molde

final y colocacin de la tapa que
forma los conductos de entrada
/salida.

Introduccin del molde con el PDMS al horno a

una temperatura de 60C por 15 horas o a 95C
por 2 horas.

Desmontaje de la celda de PDMS del molde.

Introduccin de la celda de PDMS y del vidrio ptico que

tiene la pelcula de Au y Cr a la cmara de radiacin
UV/Ozono por 5 min.

Unin del vidrio ptico a la celda de

PDMS para formar el chip sensor de
celda microfludica completo.

FIN

68
7.7 Prueba y calibracin de chip sensor con diferentes concentraciones de sucrosa

Para realizar la prueba y calibracin visitamos el CIDETEQ donde se encuentra el equipo

de medicin de SPR NanoSPR 6/321.

Figura 52. Equipo de medicin de SPR.

7.7.1 Ajuste de la celda microfludica en el equipo NanoSPR/321

El primer paso fue ajustar la celda microfludica al equipo de medicin. Se logr ajustar
correctamente debido a que la celda de flujo fue diseada con las dimensiones fsicas del
equipo.

La celda se coloco de acuerdo a la configuracin Kretschmann necesaria (Figura 53):

Figura 53. Configuracin final de nuestro prototipo de chip sensor para el dispositivo Nano SPR/ 321 1) Prisma de
retroflexin trapezoidal con un ngulo de 65, 2) Fluido de inmersin ptico (n = 1.6100), 3) Chip sensor de oro
(vidrio/Cr/Au), 4) Celda microfludica de PDMS.

69
 1. Primero se coloco en el equipo NanoSPR6/321 el prisma de retroflexion
trapezoidal (n=1.61)(Figura 54):

a) b)

Figura 54. a) Prisma de retroflexin trapezoidal, b) Ajuste del prisma en el equipo de NanoSPR/321

2. A continuacin se coloca sobre el prisma el aceite de inmersion optico (n=1.61)

para acoplar opticamente el prisma y el vidrio optico, para evitar refraccin
(Figura 55).

a) b)

Figura 55 a) Aceite de inmersin (n=1.61), b) Colocacin de aceite de inmersin sobre el prisma

3. Sobre el aceite de inmersin colocamos la celda microfludica constituida por el

vidrio ptico (n=1.61, con un depsito de Cr de 5nm y 45nm de Au) y la celda de
PDMS con canales de 100 micrmetros de espesor (Figura 56).

Figura 56. Ajuste de la celda microfludica sobre el aceite de inmersin.

70
Finalmente el equipo de pruebas queda conformado por la computadora y el equipo de
resonancia que contiene nuestra celda microfludica (Figura 6 y 7).

a) b)

Figura 57. a) Equipo de pruebas de SPR constituido por una computadora y el equipo de medicin, b) Colocacin
de nuestra celda en el quipo NanoSPR/321.

Figura 58. Vista superior de la celda microfludica en el equipo de SPR.

7.7.2 Verificacin de conexin al equipo de computo

Comenzamos encendiendo el equipo NanoSPR/321 y la computadora, se observa en el

equipo el lser que incide en prisma (Figura 59), si ambos estn correctamente conectados
se presenta un mensaje de bienvenida con la versin del programa. A continuacin
aparece una grfica en blanco donde se representar el fenmeno de Resonancia de
plasmones superficiales en modo barrido, que muestra la relacin entre la reflectividad y
el ngulo de SPR (Figura 60a y 60b).

71
 Figura 59. Se observa la luz lser que incide en el prisma lo cual indica que est en funcionamiento.

a) b)

Figura 60. a) Mensaje de verificacin de conexin y bienvenida, b) Pantalla inicial donde se mostrara ms
adelante los datos de la prueba

7.8 Calibracin de la celda microfludica

El siguiente paso es llenar la celda con agua (Figura 61) y ejecutar la prueba de SPR por
la computadora. En la grfica que se muestra en la computadora (Figura 62) se observa
el ngulo crtico y el ngulo de SPR para el agua en la celda que fueron de 55.67 y
62.6834 respectivamente.

Figura 61. . Curva de SPR para el agua.

72
 Figura 62. Para la calibracin de la celda se obtiene la curva de SPR con agua.

La forma de calibracin de la celda es la siguiente:

1. Se obtiene la curva de SPR para el agua

2. Se obtienen las curvas de SPR para 6 diferentes concentraciones de sucrosa (0.0,
0.04, 0.08, 0.12, 0.16 y 0.20 g/ml), cuidando de limpiar la celda con agua entre
cada solucin (Figura 63).
3. Se realiza el anlisis de la informacin de las curvas. Teniendo como base la curva
de agua y sabiendo que tiene un ndice de refraccin 1.33, se realiza una
aproximacin del ndice de refraccin de cada concentracin, por tanto se obtiene
la relacin entre el ndice de refraccin y el ngulo de SPR para cada solucin o
directamente el ndice de refraccin en relacin a la concentracin de sucrosa.

Figura 63. Se introducen diferentes concentraciones de sucrosa y se obtiene su respectiva curva de SPR.

73
Captulo 8. Anlisis e interpretacin de resultados

Para el anlisis de los resultados obtenidos con el equipo de medicin y el software

NanoSPR versin 6.5, se us el software WinSpall en su versin 3.02 el cual es un
programa libre (un link para su descarga se puede encontrar en el Anexo B), calcula la
reflectividad de sistemas multicapa, ideal para la simulacin de curvas que representan el
efecto de resonancia de plasmones superficiales.

Al realizar la simulacin de las curvas donde se aprecian los ngulos de SPR de las
diferentes concentraciones de sucrosa, se pretende obtener la relacin del ngulo respecto
al ndice de refraccin.

El software WinSpall lee documentos en formato de texto plano, por lo que para ingresar
los datos de la curva obtenidos con el equipo NanoSPR 6/321 se recomienda guardarlos
en un archivo .txt, ya que ste los genera con extensin .sp1. El archivo debe contener
solo los puntos medidos acomodados en dos columnas, la primera con los datos del ngulo
de incidencia y la segunda con el valor de reflectividad ha dicho ngulo. Cabe mencionar
que los valores de los ngulos generados por el equipo deben estar expresados en grados,
mientras que los datos de reflectividad se tiene que normalizar respecto al valor de
reflectividad en el ngulo crtico o ms cercano a l.

En la Figura 64 se muestra la pantalla de inicio del programa de simulacin, lo primero

que se realiza es cargar los datos de la curva obtenida cuando se introdujo agua dentro del
microcanal.

Figura 64. Pantalla de inicio WinSpall 3.02

74
Para cargar los datos se va a la seccin Scan y se selecciona Load. Aparecer un
recuadro como se puede observar en la Figura 65, que al dar clic en Load nos permitir
buscar el documento con los datos. Al seleccionar el archivo se podr observar en el
mismo recuadro el o los datos cargados que tenga el archivo con el que se estar
trabajando.

Figura 65. Ubicacin para cargar datos.

Una vez cargados los datos, se puede observar la curva del efecto SPR que se form con
el agua dentro del microcanal.

En la curva de SPR, que se puede apreciar en la Grfica 6, se muestra que la grfica

comienza con el ngulo crtico (c) obtenido de 55.67 para el acoplamiento entre oro y
agua, adems del ngulo de resonancia de plasmones superficiales (SPR) con un valor
obtenido de 62.6834, el cual es cercano al ngulo caracterstico de 62.90.

Grfica 6. Curva de resonancia de plasmones superficiales con agua dentro del microcanal.

75
Ahora, se prosigue a generar una curva que simule el fenmeno de SPR obtenido. Para
ello necesitamos conocer las caractersticas del prisma para el acoplamiento del chip
sensor y del rayo lser del equipo NanoSPR 6/321, las unidades para graficar la curva de
SPR y los espesores de cada uno de los materiales de nuestro sistema multicapa as como
su ndice de refraccin. Los valores de acuerdo a los espesores dados por el fabricante se
muestran en la siguiente tabla.

Tabla 3. Valores de ndice de refraccin en base a espesores de las capas de los metales dados por el fabricante.

Nmero de Espesor de la ndice de refraccin del material

Material
capa capa (nm) Parte real Parte Imaginaria
1 Prisma-Vidrio 0 1.6160 0
2 Cromo 5 2.1 2.37
3 Oro 45 0.15 3.6
4 Dielctrico 0 1.3339 0

La capa nmero uno se refiere al acoplamiento del prisma de retroflexion trapezoidal, el

lquido de inmersin ptico y el vidrio ptico, los cuales presentan el mismo ndice de
refraccin por lo que se cuenta como una sola capa. Por otra parte tenemos que en la capa
1 y 4 se considera un espesor de cero, debido a que stas en comparacin con las capas
de Cr y Au son muy grandes, tendiendo a ser infinitas, por lo que su valor no se considera.

Una vez con los datos para la simulacin, se procede a ingresarlos al software. Para ello,
en la parte de Simulation, seleccionamos Parameter (Figura 66) y se abrir un
recuadro.

Figura 66. Ingreso de parmetros para simulacin de la curva del efecto de SPR.

Dentro de los parmetros necesarios para la simulacin est el tipo de prisma que se usa
para las pruebas, para este caso usaremos el prisma de medio cilindro que es considerado
un prisma universal ya que el prisma de retroflexin trapezoidal no se encuentra dentro
de las opciones que tiene el programa. Otros datos a especificar son la longitud de onda

76
y el tipo de luz polarizada, que son 670 nm y luz P-polarizada respectivamente, de
acuerdo a las caractersticas del lser que nos da el equipo de medicin (Figura 67a).

De igual manera, se especifica el tipo de parmetro con el cual se graficar respecto a la

reflectividad, en este caso ser el ngulo de incidencia en grados como ya se haba
planteado anteriormente, adems de delimitar el intervalo de visualizacin que ser desde
los 55 hasta 66, suficiente para observar la curva que comienza con el valor del ngulo
critico hasta poco ms del ngulo de SPR (Figura 67b).

Por ltimo, se especifican las caractersticas de los materiales que conforman el sistema
multicapa, donde se tiene que indicar que tipo de variable que se va a introducir, en este
caso, el ndice de refraccin (n) y el coeficiente de absorcin (k) para cada uno de los
materiales as como su espesor (Figura 67c). Los valores los podemos encontrar en la
Tabla 3.

a)

b)

77
 c)

Figura 67. Parmetros de simulacin. a) Tipo de prisma, longitud de onda y luz polarizada, b) Lmites del ngulo y
c) Caractersticas de las capas del sistema.

Con los datos proporcionados obtenemos de forma ideal la simulacin de la curva de

SPR. En la Grfica 7 se pueden observar dos curvas. La curva dibujada por pequeos
cuadros negros representa los datos obtenidos con el equipo de NanoSPR 6/321, mientras
que la curva formada por una lnea continua de color rojo nos muestra la simulacin del
efecto teniendo como dielectrico agua destilada con un ndice de refraccin de n=1.3339.

Grfica 7. Simulacin de curva de SPR con agua como dielctrico dentro del microcanal.

Como se puede observar, la grfica simulada queda muy por debajo de los datos obtenidos
y se necesita que sta quede lo ms sobrepuesta a los valores del barrido realizado. Esto
se debe principalmente a que los espesores de las pelculas delgadas de los metales pueden
variar al momento de que se hizo el depsito y esto afecta al ndice de refraccin. Otros

78
factores que influyen en la medicin son las condiciones en las que se realiza el barrido
como pueden ser la temperatura, presin y humedad, adems de que el agua puede
presentar variaciones en la presin por la forma en que se introdujo y temperatura por el
tiempo en que se expone al rayo lser ya que ste la modifica.

El sobreponer las dos curvas nos ayudar a obtener los ndices de refraccin de las
soluciones a diferentes concentraciones de sucrosa que se introdujeron en el microcanal.
Principalmente se busca ajustar la posicin de los ngulos mnimos de reflectividad
(ngulo de SPR) de cada una de las curvas.

El ajuste de las curvas se puede realizar de dos maneras, de forma iterativa y forma
manual. En la parte de Simulation del software, en la seccin de Simulation se
encuentran las opciones manual e iterative que nos ayudarn a ajustar las curvas
(Figura 68).

Figura 68. Men para ajuste de curvas.

Para el ajuste iterativo de las curvas se despliega un recuadro que nos permite seleccionar
los parmetros a modificar para que la simulacin se sobreponga a los datos medidos
(Figura 69). Dentro de los valores que se pueden modificar solo se deberan seleccionar
los parmetros de las pelculas de cromo u oro, ya que la capa 1, que representa al prisma
y al vidrio, y la capa 4 que viene siendo el agua destilada, mantienen su ndice de
refraccin, mientras que el Cr y Au pueden variar respecto al espesor de la pelcula. Una
vez seleccionados los parmetros se hace la iteracin dando clic sobre Start.

79
 Figura 69. Ajuste iterativo de curvas.

Para el ajuste manual aparece un recuadro con los valores a modificar y de igual manera
solo se modifican los parmetros que son parte de las pelculas delgadas de cromo y oro
(Figura 70), donde se pueden aumentar o disminuir el valor desde 0.1, 0.01 o 0.001, o
bien editarlo.

Figura 70. Ajuste manual de curvas.

El ajuste iterativo es rpido, pero no es efectivo ya que nos puede dar valores irreales
(como se puede observar en el recuadro naranja de la Figura 71, donde el ndice de
refraccin del Cr nos da un valor negativo) y/o lejos de los parmetros que se tienen (el
espesor del Au al que acopla la curva es de 37.32nm, cuando idealmente es de 45nm), por
tales motivos, se recomienda obtener la simulacin de la curva mediante un ajuste manual.

Winspall permite ver los ngulos de SPR de las curvas, ya que muestra el valor exacto
del ngulo donde se encuentra el valor mnimo de reflectividad. Para ello en la pantalla

80
de inicio, se encuentra un cono que hace una evaluacin para obtener dicho valores
(Figura 10).

Figura 71. Evaluacin de datos cargados y simulacin de curva.

En la Grfica 8 se observan las curvas ajustadas, donde se muestra la ubicacin del valor
mnimo de reflectividad.

Grfica 8. Curva de simulacin de SPR con agua destilada como dielctrico junto con curva de valores medidos en
el equipo de NanoSPR 6/321 con los valores mnimos de reflectividad.

Para poder obtener el valor exacto del ngulo, en la misma ventana de evaluacin de las
curvas, la opcin Min-Data (Figura 72), nos muestra los datos y con ello se puede
observar que los valores son muy cercanos entre la simulacin y los obtenidos en la
medicin, teniendo as para el agua destilada un ngulo de SPR de 62.6834 que
corresponde a un ndice de refraccin de n=1.3339.

Figura 72. Evaluacin de valores de la curva de SPR con agua como dielctrico y la curva simulada.

81
Despus de verificar el ngulo de SPR, ambas curvas se pueden observar en la pantalla
de inicio del programa una vez saliendo de la evaluacin (Grfica 9). En la Tabla 4
tenemos los parmetros finales de la curva de simulacin con valores reales y cercanos a
los especificados, que nos ayudar a obtener los ndices de refraccin de las prximas
soluciones.

Grfica 9. Curva de simulacin de SPR con agua destilada como dielctrico ajustada a los valores medidos en el
equipo de NanoSPR 6/321.

Tabla 4. Valores de ndice de refraccin en base a espesores de las capas de los metales dados por el fabricante.

Espesor de la ndice de refraccin del material

Numero de
Material capa
capa Parte real Parte Imaginaria
(nm)
1 Prisma-Vidrio 0 1.6160 0
2 Cromo 1.62 0.0178 2.2976
3 Oro 43.44 0.15 3.6215
4 Dielctrico 0 1.3339 0

Una vez con las curvas ajustadas, se procede a agregar los datos de la prxima curva que
se obtuvo, que es la generada teniendo como lquido la solucin de agua y sucrosa a una
concentracin de 0.04 g/ml. Ahora, en la Grfica 10 se pueden observar tres curvas que

82
representan el efecto SPR, los recuadros negros son los datos obtenidos con agua como
dielctrico y la lnea roja continua la simulacin, mientras que los crculos rojos son las
mediciones de la solucin de sucrosa a la concentracin de 0.04 g/ml.

Grfica 10. Curva de SPR de la solucin de sucrosa a una concentracin de 0.04 g/ml.

Ahora, basta con variar el valor del ndice de refraccin de la capa 4, que es la que
representa el dielctrico, ya que en el sistema multicapa sta fue la nica que se modific
al sustituir el agua con la solucin de sucrosa, manteniendo las pelculas delgadas tal y
como se plantearon para el ajuste de la simulacin.

El ndice de refraccin se modificar hasta acercar la posicin del ngulo con el valor
mnimo de reflectividad de la curva simulada junto con el valor mnimo de reflectividad
de la curva generada con las nuevas mediciones adjuntadas. Como se observa en la Figura
73, en la seccin de evaluacin de las curvas, al igual que en caso cuando solo tenamos
la curva que representa el fenmeno con agua, se pueden obtener el valor especfico del
ngulo, el cual es de 63.1497.

Figura 73. Evaluacin de valores del ngulo de SPR y reflectividad para la solucin de sucrosa a una concentracin
de 0.04g/ml.

83
Una vez ajustadas las curvas (Grfica 11), obtenemos el ndice de refraccin para la
solucin, que en este caso da de n=1.3391.

Grfica 11. Ajuste de curva de SPR de la solucin de sucrosa a una concentracin de 0.04 g/ml con la simulacin
de la curva de SPR con agua destilada.

El prximo paso es adjuntar los valores obtenidos de las curvas que restan a las diferentes
concentraciones, que fueron de 0.08, 0.12, 0.16 y 0.20 g/ml, y de la misma manera, con
ayuda de la simulacin, se va a ir variando solamente el ndice de refraccin para recorrer
la curva y que queden alineados una a una el ngulo de SPR de la curva de datos medidos
con la simulada para obtener los ndices de refraccin de las diferentes soluciones. En la
Grfica 12, se aprecia como las curvas de las soluciones (curvas punteadas rojas), se van
recorriendo a la derecha gradualmente conforme la concentracin de sucrosa aumenta, lo
que hace que el ndice de refraccin se incremente de la misma manera. Las curvas de los
valores medidos con agua destilada representadas por los recuadros negros nos sirven
para observar como el ngulo de SPR se va alejando conforme aumenta la concentracin
de sucrosa.

84
 a) b)

c) d)

Grfica 12. Curvas del efecto de SPR a diferentes concentraciones de sucrosa, a) C=0.08 g/ml, b) C=0.12 g/ml, c)
C=0.16 g/ml, d) C=0.20 g/ml.

De igual forma, dentro del software Winspall 3.02, se pueden visualizar todas curvas
obtenidas a las diferentes concentraciones de sucrosa como se puede observar en la
Grfica 13, donde adems, en la evaluacin de las curvas, marca los mnimos de
reflectividad para poder obtener el valor exacto del ngulo de SPR como se realiz
anteriormente.

En la Tabla 5 se pueden observar los marcadores que tienen cada una de las curvas de la
figura, adems del ngulo de SPR, el valor de reflectividad en el que se da dicho ngulo
y el ndice de refraccin que le corresponde en base a esos valores.

85
 Grfica 13. Curvas de SPR a diferentes concentraciones de sucrosa con sus valores mnimos de reflectividad
marcados.

Tabla 5. Datos de las curvas de SPR.

Concentracin ndice de
Reflectividad
Representacin de sucrosa ngulo de Refraccin
[u.a.]
[g/ml] SPR [] [u.a.]
0 62.6834 0.3639 1.3341
0.04 63.1497 0.3771 1.3391
0.08 63.5326 0.3910 1.34315
0.12 63.9699 0.3654 1.3478
0.16 64.4011 0.3838 1.3524
0.2 64.9263 0.4439 1.3574

Se puede observar que el ngulo de SPR tiene un cambio aproximado de 0.45 al

aumentar 0.04 g/ml la concentracin de sucrosa en la solucin, mientras que el valor de
reflectividad no presenta muchos cambios conforme la concentracin aumenta. En la
Grfica 14 se muestra una grfica de puntos de los ndices de refraccin respecto a sus
ngulos de SPR, as como regresin lineal en base a los puntos dados. La recta est dada
por y=95.691x-64.991 y para verificar que tan confiable fue es el ajuste de la recta a los
valores obtenidos, calculamos el coeficiente de correlacin de Pearson, obteniendo
r=0.99979065, lo que nos representa una alto grado de relacin entre las variables.

86
 Relacin de Angulo de SPR e ndice de Refreccin
65.5

65

64.5

64
[]
SPR
Theta

63.5

63

62.5

62
1.33 1.335 1.34 1.345 1.35 1.355 1.36 1.365
Indice de Refraccin, n[u.a.]

Grfica 14. Relacin de la estimacin del ndice de refraccin y el ngulo de SPR.

En la Grfica 15 se tiene una grfica que muestra los valores estimados del ndice de
refraccin en funcin de la concentracin de sucrosa. Se tiene que en promedio el ndice
de refraccin tiene un incremento de 0.0046 por cada aumento de 0.04 g/ml en la
concentracin de sucrosa. La recta que permite representar una aproximacin de los
puntos viene dada por y=0.115x+1.3342 con un coeficiente de correlacin r= 0.9996331,
que de igual manera, nos representa una alta relacin entre las variables, por lo que
podemos decir, que el comportamiento del sensor es lineal.

Relacin de la concentracin de sucrosa y la estimacin de los ndices de reraccin

1.365

1.36

1.355
Indice de Refraccin, n[u.a.]

1.35

1.345

1.34

1.335

1.33
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2
Concentracin de sucroca [g/ml]

Grfica 15. Relacin de la concentracin de sucrosa y la estimacin de los ndices de refraccin.

87
Captulo 9. Conclusiones

Los conocimientos adquiridos durante el desarrollo de esta investigacin son tpicos

especializados que no se adquieren en la carrera de binica como tal, sin embargo forman
parte de una rama especfica de la binica que son los biosensores.

Un biosensor consta de un receptor biolgico y un sistema de transduccin que permiten

identificar molculas especficas. El presente trabajo aborda el desarrollo de un chip
sensor que comprueba el fenmeno de SPR en microcanales, este dispositivo es una
propuesta alterna al chip sensor ya comercializado con el equipo NanoSPR 6/321.

En la fabricacin de los microcanales se tuvo un especial cuidado con la limpieza de la

oblea de Si ya que partculas sobre la superficie pudieran contaminar la resina y esto
afectar el patrn de los microcanales. Otro factor de especial cuidado a considerar es la
cantidad de resina SU-8 3050 que se coloca sobre la oblea, as como su distribucin
uniforme comenzando del centro hacia afuera en toda la superficie. Adems para obtener
el espesor propuesto de 100m del microcanal, se realizaron varias pruebas en el spinner
de velocidad y tiempo de giro en base a datos de la ficha tcnica de la resina, estos datos
se obtienen experimentalmente, puesto que dependen de condiciones especficas de
presin y temperatura.

El acabado del molde impreso en 3D para la fabricacin de la celda present relieves que
dificultaron el desmolde y afectaron la esttica, por lo que el molde se recubri con una
pelcula de esmalte que ayud al desprendimiento del PDMS y a la generacin de una
menor cantidad de burbujas en la celda, siendo que estas burbujas pudieran afectar los
microcanales y/o los conductos de entrada de fluido.

La sujecin de la oblea con los microcanales y el molde de la celda debe realizarse

cuidando posibles fugas del PDMS. Dicha unin se realiza con materiales que no afecten
la composicin del polmero y que permitan un fcil desprendimiento de la oblea. La tapa
que forma los conductos de entrada y salida debe centrarse a los microcanales, esto para
garantizar el correcto flujo de las muestras a introducir.

Por otra parte, el curado del PDMS se recomienda sea por un periodo de al menos 12
horas en el horno a una temperatura de 60 C, ya que el colocarlo a una temperatura de
95C por 2 horas puede generar afecciones antiestticas como burbujas.

88
El unir la placa sensora con la celda microfludica mediante UV/Ozono resulto efectivo,
esto se comprob al no presentar derrames en la calibracin y prueba de funcionamiento,
lo que aseguro que el prototipo se pueda presentar en una sola pieza.

Una vez obtenidos el molde para la estructura de la celda, la oblea con los relieves para
los microcanales y el vidrio ptico con las pelculas de Cr y Au depositadas, el tiempo de
fabricacin de la celda microfludica depende principalmente del curado del PDMS, ya
que la unin de la celda demora aproximadamente 10 min. Adems, este tipo de
procedimientos se pueden adaptar a cualquier laboratorio con los equipos adecuados,
logrndose realizar a bajo costo.

La colocacin del chip sensor prototipo en el equipo de medicin se realiz de manera

sencilla ya que la estructura fue diseada fsicamente para un correcto acoplamiento.
Adems el PDMS que forma la celda es un polmero solido ligeramente elstico lo que
permite un cmodo ajuste al equipo.

Para las pruebas del dispositivo se trat de replicar en cada experimento para las
diferentes concentraciones de sucrosa a 0, 0.04, 0.08, 0.12, 0.16 y 0.20 g/ml la forma de
introducir la muestra a los microcanales, controlando la fuerza y la velocidad con la que
se coloc as como el tiempo de exposicin del fluido al rayo lser, ya que esto puede
modificar las condiciones de las soluciones y propiciar resultados errneos.

El ndice de refraccin estimado de cada solucin fue obtenido con el software WinSpall
3.02 simulando las curvas de SPR obtenidas en el equipo NanoSPR 6/321. Cada curva
experimental se ajusta manualmente a una simulada variado el ndice de refraccin con
el fin de que el ngulo de SPR coincidan, lo que ocasiona cierto error en el ndice de
refraccin. A pesar de este error, la relacin obtenida del ngulo de SPR con el ndice de
refraccin presenta un comportamiento lineal con un coeficiente de correlacin de
0.9996331.

89
Captulo 10. Recomendaciones y/o Sugerencias para investigaciones futuras.

El biosensor por resonancia de plasmones superficiales es un dispositivo se ha trabajo

para deteccin de enfermedades de manera rpida y confiable por su especificidad y
sensibilidad. El presente trabajo abre puertas a desarrollo de prototipos portables ya que
como se vio la obtencin de resultados al detectar compuestos especficos demora menos
de un minuto y la aplicacin de sistemas microfludicos hacen que la cantidad de muestra
necesaria para la prueba sea mnima.

El poder detectar el fenmeno de plasmones superficiales a escalas micromtricas da pie

a la integracin en la tecnologa Lab on a chip permitiendo que realizar pruebas ms
complejas en espacios pequeos.

90
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94
Anexos A. Obtencin del vector de resonancia de plasmones superficiales

Las funciones de las ondas electromagnticas para cada uno de los medios en una
interfase metal-dielctrico para el fenmeno de resonancia de plasmones superficiales,
considerando que la onda incidente se da por medio de luz P-polarizada, pueden
representarse de la forma:

Vector elctrico del metal = ( ) = ( +) (1a)

Vector magntico del metal = ( ) = ( + ) (1b)

Vector elctrico del dielctrico = ( ) = ( + ) (1c)

Vector magntico del dielctrico = ( ) = ( + ) (1d)

De las funciones de onda (1) que representan el campo elctrico y el campo magntico
en los diferentes medios, tenemos que y son las componentes del vector en x,
y las componentes en la direccin z y es la frecuencia angular, adems de
que se ignorarn materiales magnticos, es decir, se considerar =1 durante el
desarrollo, donde dichas funciones deben de cumplir las ecuaciones de Maxwell, en este
caso en presencia de una densidad de corriente ,

= 0 (2a)

=0 (2b)

1
+ =0 (2c)

1 4
= (2d)

Aplicando las condiciones de frontera en la interfase se tiene que:

= (3)

= (4)

De la ecuacin (3) se puede representar = = y = = , adems

se tiene que los componentes en la direccin x son las mismas por lo que se pueden
escribir como = = .

95
Aplicando la ecuacin de Maxwell (2d) con = 0 por ausencia de flujo de cargas a los
campos y de las funciones en (1), se obtiene:

= (5)

= (6)

= (7)

= (8)

donde y son la permitividad en el metal y en el dielctrico respectivamente.

Despus, de acuerdo a las ecuaciones (5) y (7) se obtiene:

= , (9)

que muestra que los plasmones superficiales slo se excitan en una interfase entre medios
con constantes dielctricas de signos opuestos, en este caso < 0 y > 0 [13].

Por otro lado, aplicando la ecuacin de Maxwell (2c) a los campos y se obtiene:

+ = (10)

= (11)

A partir de la ecuacin (11), junto con las ecuaciones (7) y (8), obtenemos:

2
2 + 2 = ( ) (12a)

2
2 + 2 = ( ) (12b)

Para obtener la relacin de los plasmones superficiales en la interfase, se despeja de

las ecuaciones (12a) y (12b) las componentes en la direccin z:

2
= ( ) 2 (13a)

2
= ( ) 2 (13b)

que en conjunto con la ecuacin (9), se tiene:

96

=
+ (14)

Definido como el vector de propagacin del plasmn, representndose de igual manera

como = .

Anexos B. Software WinSpall 3.02

Programa de descarga libre que calcula la reflectividad de sistemas multicapa disponible

en:
https://archive.li/o/x87j7/https://web.archive.org/web/20110319210433/http://www.mpi
p-mainz.mpg.de/knoll/soft/winspall302_free.zip

97