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CINTICA ENZIMTICA
ASPECTOS TERICOS
Cualquier diferencia detectable entre las propiedades del sustrato y del producto
pueden ser utilizados como base para un ensayo directo continuo.
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Ensayos continuos tienen la ventaja de permitir obtener la curva progreso de la
reaccin continuamente, lo que facilita determinar velocidades iniciales y observar
cualquier desviacin en la fase inicial.
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e. Reacciones que significan asociacin o disociacin de protones pueden
seguirse en soluciones no tamponadas o pobremente tamponadas midiendo el
cambio de pH con un pH-metro.
R-CO-O-R + H2O R-CO-O- + H+ + R-OH
El uso de este mtodo restringe el pH a un pH mayor que el valor de pK A del
producto formado y generalmente a la zona del pH ptimo, donde el cambio de
pH sea lo menor posible y no afecte en forma significativa la actividad de la
enzima. Un mtodo alternativo que impide el cambio de pH es el uso de un
auto titulador (pH-stat) que titula la mezcla de reaccin aadiendo cido o
base, para mantener el pH constante y al mismo tiempo, registrando la
velocidad de adicin. Es ventajoso trabajar a bajas concentraciones de tampn
(1 mM) para minimizar fluctuaciones dramticas de pH.
Detencin de la reaccin.
Es importante que los procedimientos sean virtualmente instantneos y que no
interfieran con el anlisis posterior. Cuando se realiza un ensayo nuevo es
conveniente chequear que la reaccin ha sido detenida completamente.
Generalmente se detienen por inactivacin de la enzima.
a. Calor.
Generalmente se coloca la muestra en un bao de agua hirviendo cuidando que la
transferencia de calor sea rpida ya que en las reacciones catalticas aumenta la
velocidad con la temperatura hasta que ocurre desnaturalizacin. Es conveniente usar
volmenes pequeos y tubos de paredes delgadas. El calor tiene la ventaja de que
es poco probable que interfiera en el procedimiento analtico subsiguiente, pero debe
recordarse que algunas enzimas (adenilato quinasa y ribonucleasa) no son
inactivadas en una exposicin corta a 100C. La misma consideracin debe tomarse
si se detiene la reaccin colocando la mezcla de ensayo en un bao de agua con
hielo.
b. cidos.
Las enzimas se desnaturalizan rpidamente con cidos fuertes. El cido
tricloroactico y el perclrico son particularmente efectivos a concentraciones finales
de 3% p/v. En el caso que sea necesario el perclorato puede ser removido por
neutralizacin con KHCO3, ya que KClO4 es poco soluble a 4C. El tricloroacetato
presenta la caracterstica de ser extrable con ter.
c. Bases.
Si una solucin fuertemente alcalina es compatible con el procedimiento analtico
posterior, se usa una base fuerte (p.e. NaOH, Na 2CO3) para detener la reaccin. En
ensayos con sustratos sintticos del tipo nitrofenilderivados, la base detiene la
reaccin y deprotona al p-nitrofenol obtenindose el p-nitrofenolato de color amarillo
que absorbe alrededor de 405 nm.
d. Solventes orgnicos.
En algunos casos solventes miscibles en agua (alcohol, acetona) pueden ser
utilizados en una proporcin aproximada a lo menos del 50%.
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Como en los ensayos continuos estos mtodos tienen la ventaja de no ser
susceptibles a errores durante la manipulacin posterior de la muestra y que adems
permiten obtener la curva progreso de la reaccin en un slo experimento.
Los reactivos que reaccionan con uno de los productos para formar un compuesto
detectable pueden ser incluidos en la mezcla de ensayo siempre y cuando no
reaccionen con la enzima o algn otro componente del sistema.
Por otra parte, la reaccin de deteccin debe ser rpida de modo que la reaccin
catalizada en estudio sea siempre la limitante en la velocidad. De este modo la
velocidad medida corresponde a la actividad de la enzima en estudio.
Los ensayos ms comunes de este tipo ocupan enzimas adicionales para catalizar la
reaccin de uno de los productos dando un compuesto que sea detectable
directamente. Ensayos de este tipo se conocen como ensayos acoplados y las
enzimas que participan en la deteccin, enzimas auxiliares.
Frecuentemente los ensayos acoplados involucran la oxidacin o reduccin de
nucletidos piridnicos, ya que estas reaccionan pueden ser seguidas espectrofoto o
fluoromtricamente.
HKe
gl u cos a ATP glu cos a 6P ADP
I
I NADP
G6PDa I
I NADPH
6 P gluconato
El sistema regenera el ATP que es hidrolizado por la ATP-asa y por lo tanto previene
cualquier disminucin de la velocidad causada por disminucin de la concentracin
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del sustrato.
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A continuacin se muestra un ensayo para enzimas que producen fosfato que ocupa 3
enzimas auxiliares.
(E1)e
Glucosa + Pi glucosa-1P
(E2)aux
Glucosa-6P
NADP+
(E3)aux
NADPH + H+
6P-gluconato
E1 = glicgeno fosforilasa
E2 = fosfoglucomutasa
E3 = glucosa 6 fosfato deshidrogenasa
ENSAYOS ESPECIFICOS.
Los ejemplos presentados intentan ilustrar hechos generales de tipos de ensayo
especfico. Ensayos convenientes para enzimas individuales se encuentran en :
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Methods of Enzymology, Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer), Enzyme
Handbook, como tambin en la literatura original.
CONSIDERACIONES PRCTICAS.
Lo anterior significa que puede ser necesario usar ms de un ensayo para completar
el estudio de una enzima.
Estabilidad enzimtica.
En una serie de estudios con una preparacin enzimtica es esencial ensayar su
actividad en intervalos regulares de tiempo en condiciones estndar para chequear
que sta permanezca constante. Si una enzima es inestable y pierde la actividad en el
tiempo, es posible corregir los valores obtenidos en relacin al inicial si se han
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realizado una serie de ensayos estndar a diferentes tiempos; esto permite construir
una curva de calibracin de actividad en el tiempo. De todas maneras es mucho mejor
buscar condiciones bajo las cuales la solucin stock de la enzima pueda ser
almacenada sin prdida apreciable de actividad en el tiempo.
Solventes y tampones.
Es esencial asegurarse que todos los solventes usados estn libre de material
contaminante que pueda afectar la actividad de la enzima. Iones de metales pesados
son inhibidores de muchas enzimas, deben por lo tanto eliminarse del sistema.
Algunos sustratos son insolubles en agua y deben agregarse en una solucin
orgnica al ensayo. En este caso es necesario que el solvente orgnico no tenga
efecto sobre la actividad de la enzima en estudio o sobre el mtodo de ensayo
utilizado.
Debe chequearse que la adicin de los componentes no afecte el pH del ensayo.
Mezclas de ensayo.
En mezclas de ensayo que contienen diferentes componentes es posible preparar una
mezcla que los contenga a todos menos a la enzima. Este coctail puede ser til si se
realiza un nmero de ensayos en las mismas condiciones, como podra ser en una
purificacin de enzimas.
Homogenizacin.
Si no hay blank rates significativas en ninguna mezcla incompleta de reaccin, la
eleccin de iniciar la reaccin con la adicin de la enzima o del sustrato puede no ser
importante. Si la enzima es inestable en la mezcla de ensayo es preferible agregarla
al final. En otros casos, puede ser preferible pre-incubar la enzima con la mezcla
incompleta e iniciar la reaccin por la adicin de uno de los sustratos. Como por
ejemplo, cuando por la dilucin de la enzima hay un efecto histertico. Es
generalmente necesario almacenar la enzima y el sustrato en hielo para asegurar su
estabilidad. Por eso es importante de mantener el volumen final del material usado
para iniciar la reaccin tan pequeo como posible para impedir una cada de la
temperatura al ser agregado.
BIBLIOGRAFIA.
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K.F. TIPTON (1978)
"Enzyme Assay and Kinetic Studies. B.112
Techniques in protein and enzyme biochemistry - Part II.
B. CRABTREE, A.P. LEECH AND E.A. NEWSHOLME.
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Techniques in metabolic research. Part. I.
K.F. TIPTON (1992)
In Enzyme Assays, A Practical Approach.
Edited by R. Eisenthal y M.J. Danson.
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