Apostila Laboratrio de Microbiologia

Profa. Elisa Esposito

Tcnica responsvel: Ticiana Vasques
Monitoria: Eduardo Martins

2017

A importncia dos infinitamente pequenos infinitamente grande Louis Pasteur.

 Contedo da disciplina
Apresentao do curso;
Sada de campo para coleta de material a ser trabalhado em laboratrio;
Observao, Isolamento e purificao de Micro-organismos e conscio do ambiente;
Isolamento de micro-organismos endofticos e da rizosfera;
Preparao de laminas;
Contagem de micro-organismos;
Curva de crescimento, mesmo isolado, diferentes meios e condies;
Produo de EPS a partir de kefir, e extrao;
Seleo de bactrias produtoras de EPS;
Ensaio de antagonismo;
Ensaios com isolados promotores de crescimento vegetal;
Mtodos de preservao;

Objetivo da disciplina
Os alunos devem concluir a disciplina com uma ideia clara das tcnicas de isolamento de fungos e
bactrias, controle microbiano, contagem e crescimento de bactrias e fungos.

Avaliao
Os alunos sero avaliados pela participao nas aulas, 1 relatrio completo e uma prova prtica, no
final da disciplina.

Aulas Prticas
Ser realizada uma sada de campo aqui em So Jos dos Campos, no Centro Ambiental Edoardo
Bonetti (Estrada Dr. Bezerra de Menezes 1250, Bairro Torro de Ouro, SJC-SP) para observao e
coleta de material que ser trabalhado em aula prtica.
Micro-organismos do solo, endofticos e do rizoplano: Isolamento.

Micro-organismos do solo: Os micro-organismos atuam na transformao e decomposio da

matria orgnica, na ciclagem de nutrientes e no fluxo de energia no solo (Figuras 1 a 4).

Figura 1. Partcula de solo e seu microambiente, salientando a presena de colnias microbianas.

Fonte:

Figura 2. Micro-organismos do solo e interao com plantas.

Figura 3. Iteraes trficas no solo.
Fonte: www.ccta.ufcg.edu.br/admin.files.action.php?action=download&id=1930

Figura 4. Organismos do solo e suas funes no ecossistema.

Fonte: www.ccta.ufcg.edu.br/admin.files.action.php?action=download&id=1930

Solos Supressivos: So ecossistemas naturalmente especiais, nesse tipo de solo, mesmo que os
agentes patgenos persistam, eles causam pouqussimo dano s plantas.
Um estudo de Rodrigo Mendes, da EMBRAPA, identificou 33 mil bactrias associadas, de forma
consistente, supresso de doenas. Segundo Mendes, o estudo, que ganhou comentrio na
revista Nature Biotechnology, concluiu que o fenmeno de supresso de doenas no depende apenas
da atuao de bactrias isoladas, mas tambm da sinergia de todo um consrcio de bactrias. Os
dados indicam que essa combinao especfica de microrganismos ativada por uma sinalizao no
contexto da prpria comunidade bacteriana.
Acessar O artigo Deciphering the Rhizosphere Microbiome for Disease-Suppressive Bacteria (DOI:
10.1126/science.1203980), de Rodrigo Mendes e outros, pode ser lido
em Science em www.sciencemag.org/content/332/6033/1097.full.

Microrganismos endofticos so definidos como organismos que vivem em associao simbitica com
plantas e podem conferir benefcios as plantas e estes benefcios podem ser recprocos, resultando em
um sistema simbitico superior para caractersticas especficas da planta. A versatilidade bioqumica
e diversidade de endofticos representam uma enorme variedade de genes que so ainda
desconhecidos. Est se descobrindo cada vez mais funes gnicas, particularmente para remediao
ambiental e propsitos industriais. Assim, o uso de bactrias e fungos abre novas reas de explorao
biotecnolgica, que dita a necessidade de isolar, caracterizar e determinar a biodiversidade
microbiana em diferentes espcies de plantas. Endofticos so usados para controle biolgico, para
caractersticas agronmicas melhoradas e para agentes farmacolgicos.

Figura 5. Desenho esquemtico mostrando a localizao de bactrias no solo, rizoplano, crtex e

meristema.
Fonte: Trends in Microbiology, Volume 16 (10), 463-471 (2008)

Coleta e Isolamento
Entre os vegetais, as gramneas por serem as mais abundantes so preferenciais para coleta. As
amostras podem ser depositadas em frascos previamente esterilizados para serem transportadas. As
razes vegetais so escolhidas para fazer o isolamento, por serem os locais com maior frequncia
desses micro-organismos segundo a literatura, justificado por seu contato direto com o solo e ser sua
principal porta de entrada (Azevedo et al. 2002, Oliveira et al. 2003).
Mtodo
As amostras vegetais sero lavadas com gua de torneira e sabo e deixadas secar ao ar, sobre papel
absorvente. Aps secagem as amostras sero pesadas (1,0g), desinfetadas superficialmente de
acordo com a metodologia descrita por Arajo et al. (2002). A sequncia de desinfeco ser
realizada expondo as amostras vegetais a: etanol 70% por 1 minuto; hipoclorito de sdio a 2%, por 4
minutos; lavagem em gua destilada esterilizada, por trs vezes; banho de ultrassom 40 kHz, por 10
minutos; lavagem com gua destilada esterilizada, por trs vezes; etanol 70% por 30 segundos,
seguidos de uma lavagem final com gua destilada esterilizada, por duas vezes. O controle do
processo de desinfeco da superfcie vegetal ser realizado inoculando trs alquotas de 1,0 mL da
ltima gua de lavagem das amostras em tubos contendo caldo nutriente ou caldo BHI e incubando a
30C, por 72 horas. A ausncia de turvao nesses meios ser considerada uma resposta positiva
quanto a eficincia do processo de desinfeco. Para confirmao, aps este perodo de incubao,
amostras dos tubos sero inoculadas em placas de Petri contendo Agar Nutriente e incubadas a 30C,
por 48 horas. O no desenvolvimento de colnias ser indicativo da eficincia da desinfeco. Para o
isolamento dos micro-organismos endofticos ser utilizada a tcnica de fragmentao, onde as
amostras previamente desinfetadas sero cortadas em 21 fragmentos de 1 cm com o auxlio de um
bisturi esterilizado. Sero utilizados para o isolamento os meios de cultura: Agar nutriente (NA) e
meio TSA (Agar Triptona de Soja). As amostras sero individualmente inoculadas em placas de Petri
contendo os meios citados. Nesta etapa inicial de isolamento sero utilizadas duas placas de cada
meio de cultura. As placas com os fragmentos vegetais previamente desinfetados sero incubadas a
30C durante 15 dias. Aps o crescimento os micro-organismos sero isolados e purificados por
esgotamento nos respectivos meios slidos onde o micro-organismo teve seu crescimento observado
pela primeira vez. Este procedimento ser repetido at obteno de colnias puras. Aps a
purificao, as bactrias sero mantidas em TSA e armazenadas em geladeira a 4C. Os isolados
tambm sero preservados em glicerol 50% e armazenados em freezer a 20C. Para uma
classificao inicial dos micro-organismos isolados ser realizada a identificao morfo-tintorial pela
colorao de Gram.

O microscpio ptico composto (M.O.C.) constitudo por duas partes uma parte mecnica e uma
parte ptica. Cada parte engloba uma srie de componentes constituintes do microscpio (Figura 6).
Figura 6. Componentes constituintes do microscpio.

A parte mecnica serve para dar estabilidade e suportar a parte ptica. Esta parte constituda por:
P ou Base suporta o microscpio, assegurando a sua estabilidade.
Brao ou Coluna pea fixa base, na qual esto aplicadas todas as outras partes constituintes do
microscpio.
Tubo ou Canho cilindro que suporta os sistemas de lentes, localizando-se na extremidade superior
a ocular e na inferior o revlver com objetivas.
Platina pea circular, quadrada ou retangular, paralela base, onde se coloca a preparao a
observar, possuindo no centro um orifcio circular ou alongado que possibilita a passagem dos raios
luminosos concentrados pelo condensador.
Ocular Tubo Revlver Objetiva Platina Diafragma Condensador Fonte de luz P Parafuso
Macromtrico Parafuso Micromtrico Coluna 5
Parafuso Macromtrico engrenagem que suporta o tubo e permite a sua deslocao a da platina.
indispensvel para fazer a focagem.
Parafuso Micromtrico imprime ao tubo ou platina movimentos de amplitude muito reduzida,
completando a focagem. Permite explorar a profundidade de campo do microscpio.
Revlver disco adaptado zona inferior do tubo, que suporta duas a quatro objetivas de diferentes
ampliaes: por rotao possvel trocar rpida e comodamente de objetiva.
A parte ptica constituda por: Sistema de Oculares e Sistema de Objetivas o conjunto de lentes
que permitem a ampliao do objeto. A ampliao dada ao microscpio igual ao produto da
ampliao da objetiva pela ampliao da ocular.
Fonte Luminosa existem vrios tipos de fontes luminosas, podendo ser uma lmpada (iluminao
artificial), ou um espelho que reflita a luz solar (iluminao natural).
Condensador distribui regularmente, no campo visual do microscpio, a luz refletida pelo espelho.
Diafragma regula a intensidade luminosa no campo visual do microscpio.

Contagem das clonias de bactrias, fungos filamentosos e leveduras para quantificao dos micro-
organismos presentes nas amostras de solo.
Obteno de um inculo por diluies decimais sucessivas
1. Identifique previamente os 4 tubos de ensaio contendo 9 mL de soro fisiolgico, com as
referncias 10-1 , 10-2, 10-3 e 10-4;
2. Homogeneze a suspenso de microrganismos fornecida e, em condies de assepsia, transfira
com uma pipeta 1 mL da suspenso para o primeiro tubo (diluio 10-1);
3. Descarte a pipeta e homogeneze a suspenso diluda; 4. Com outra pipeta esterilizada retire 1 ml
da diluio (diluio 10-1) e introduza-a num segundo tubo de diluio, para obteno da diluio
10-2;
5. Proceda de igual modo at diluio 10-4, seguindo o esquema da Figura;
6. Semeie imediatamente (Figura 7), de acordo com os mtodos indicados nos pontos seguintes,
seguindo a ordem decrescente das diluies.

Quantificao de micro-organismos do solo (Figura 7): A partir do nmero de colnias crescidas nas
placas, calculado o nmero de micro-organismos vivos por grama de solo.
Figura 7. Inoculao por (a) Pour-plate e (b) Spread-plate para contagem microbiana. Ref.
http://vignette1.wikia.nocookie.net/aia1317/images/6/65/Pour_plate_spread.jpg/revision/latest?cb
=201 30411015052&path-prefix=pt-br

Cada grupo observa e efetua a contagem de micro-organismos, distinguindo bactrias de leveduras e

fungos filamentosos.
(Nmero de colnias x diluio)/0.1 mL = UFC/mL

Mtodo

Observao dos micro-organismos do solo, retirando diretamente um determinado volume de solo

diludo e realizando a colorao de Gram. Tambm caracterizao Gram das culturas j crescidas;

Obteno de isolados: Para isolar micro-organismos efetua-se a inoculao utilizando a tcnica do

esgotamento do inculo por estrias, tendo-se o cuidado de usar inteiramente toda a rea do meio
para garantir a separao das bactrias, de modo que aps a incubao cada clula separada origine
uma colnia pura.

Figura 8. Tipos de inoculaes em Placa.

https://www.google.com.br/search?q=obten%C3%A7%C3%A3o+de+isolados+de+bacterias&espv=2&
biw=905&bih=42 3&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0CAgQ_AUoA2oVChMIuMaiv4yRyAIVRQ-
QCh2wXQMZ#tbm=isch&q=+cultura+por+esgotamento&imgrc=9_UyTE5HN4y9cM%3A

Semeaduras em meios slidos em tubos

Meios de Cultura
Estria sinuosa: semear com ala ou agulha bacteriolgica, em zig-zag, partindo da base para a
extremidade do bizel (superfcie inclinada do meio).
Objetivo: obteno de intensa massa de micro-organismos.

Picada Central: semear com agulha bacteriolgica, no centro do Agar. Dependendo da

finalidade, o inculo deve penetrar at 2/3 do tubo ou at o fundo deste.
Objetivo: utilizado para verificar fermentao e motilidade em algumas tcnicas.

Semeaduras em meios slidos em placas de Petri

Pour-plate ou disseminao (mtodo em profundidade): Transferir 1 mL da
cultura para placa de Petri vazia, colocar 10 20 mL do meio fundido (e
resfriado a cerca de 45 50C) sobre a cultura e homogeneizar suavemente
com movimentos circulares.
Objetivo: contagem bacteriana. utilizado tambm para anlise de micro-
organismos anaerbios, adicionando uma outra camada de meio fundido
aps o endurecimento da primeira camada.

Estria simples: transferir uma alada da cultura para meio slido em placa e
estriar com a ala bacteriolgica sobre o meio. A estria pode ser realizada em
movimento de zig- zag (estria sinuosa) ou como uma linha reta sobre o meio
(estria reta).

Objetivo: Essa tcnica muito utilizada para visualizao de determinadas

propriedades metablicas, como a produo de enzimas hidrolticas (hidrlise de substncias do
meio - gema de ovo, sangue...), e produo de pigmentos.

Esgotamento em estrias ou estrias mltiplas: transferir uma alada da

cultura para meio slido em placa e estriar com a ala bacteriolgica sobre o
meio. A placa dividida em 4 quadrantes e a inoculao pode ser feita de 2
tipos:
3 estrias: estriar em metade da placa, com movimentos de zig-zag. Quando
atingir a metade, girar a placa 90 e estriar at a metade (1/4 da placa), girar
mais 90 e estriar o meio restante.
4 estrias: estriar at 2/3 da metade da placa, girar 90, estriar 2/3 do
prximo quadrante (1/4 da placa), girar 90, estriar mais 2/3 do prximo
quadrante (1/4 da placa), girar 90 e estriar o restante do meio.
Objetivo: obteno de colnias isoladas. importante no cruzar as estrias (no tocar a ala na
estria anterior), para reduzir o inculo a cada estria e obter as colnias isoladas. Pode-se,
alternativamente, flambar a ala entre as estrias e tocar a ponta da estria anterior, arrastando um
pequeno inculo para a prxima estria.

Spread-plate ou distenso: Transferir 0,1 ml da cultura para o meio slido na

placa e espalhar uniformemente com a prpria ponta da pipeta, ou ala
bacteriolgica / swab / ala Drigalsky.
Objetivo: obteno de crescimento confluente, ou para contagem
bacteriana. Esta tcnica muito utilizada na realizao de antibiogramas.

Semeaduras em meios lquidos

Difuso: uma alada da colnia (Agar em placa) ou da cultura (de outro meio ou
lquido) introduzida no meio lquido, com agitao da ala, para maior difuso dos
micro-organismos (da ala para o meio e homogeneizao no meio). Pode-se inclinar o
tubo a 30 e esfregar o inculo na parede do mesmo, quando o tubo retornar
posio original o inculo se difundir no meio. Objetivo: um repique genrico para
crescimento bacteriano em meio lquido.

Fonte: Aloysio de Mello e Raquel de Souza. Apostila de Aulas Prticas Bacteriologia. UFF 2007.
 O processo de identificao comea com a observao das caractersticas das colnias isoladas. Os
seguintes critrios so utilizados para a caracterizao colonial:

Forma;

Tamanho (mm);

Elevao - achatada (alta, baixa), espraiada, convexa, etc;

Bordos - inteiros, ondulados, lobados, denticulados, franjados, etc.;

Superfcie - lisa, rugosa;

Estrutura - amorfa, granulosa, filamentosa;

Caracteres pticos - opaca, translcida e transparente;

Cromogenia ou Pigmentao - amarela, branca, preta, rsea, etc.;

Odor ausente, presente, semelhante a...

Aps a observao dessas caractersticas devem ser feitos esfregaos para coloraes especiais, para
observao da morfologia microscpica (forma, arranjos, tamanho e reao ao Gram). Os
procedimentos seguintes envolvem a caracterizao metablica, tolerncia a agentes qumicos e
fsicos, a antimicrobianos e fagos (fagotipagem), extrao de DNA e sequenciamento.
Figura 9. Isolados bacterianos.

Exemplos de bactrias pigmentadas:

Roxo: Spirillum rubrum
Violeta: Chromobacterium violacein
Azul: Streptomyces coelicolor (comestvel de actinorodina)
Verde: Chlorobium tepidum
Amarelo: Xanthomonas campestris (xantomonadinas)
Laranja: Sarcina aurentiaca
Vermelho: Serratia marcescens (prodigiosina)
Preto: Prevotela melaninogenica
Amarelo-ouro: Staphylococcus aureus
Prata: Actinomyces sp.
Branco: Staphylococcus epidermidis
Creme: Proteus vulgaris
Rosa: Micrococcus roseus
Fluorescente azul / verde: Pseudomonas aeruginosa (Piocianina)
Amarelo fluorescente: Pseudomonas fluorescens (Pioverdina / fluorescena)

Muitas aplicaes importantes de pigmentos bacterianos so alistadas:

Na patognese:
Resistncia fagocitose
Resistncia ao calor e estabilidade cida
Unpalatability to protozoa
Estimuladores de formao de anticorpos in vitro
Propriedades antitumorais

Aplicaes industriais:
Em formulaes de tinta
Alternativas aos aditivos de cores de origem vegetal
Em tingimento txtil
Colorantes alimentares
Fonte de vitamina A
Na teraputica
Indicadores de vazamento de leo
Biossensores e marcadores de gua, solo e ar comprimido
Colorao de Gram

Figura 10

https://www.google.com.br/search?q=obten%C3%A7%C3%A3o+de+isolados+de+bacterias&espv=2&
biw=905&bih=42 3&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0CAgQ_AUoA2oVChMIuMaiv4yRyAIVRQ-
QCh2wXQMZ#tbm=isch&q=colora%C3%A7%C3%A3o+de+gram&imgrc=JD4-nMfBDiPSQM%3A

Coluna de Winogradsky

Martinus Willen Beijerinck e Sergei Winogradsky estudaram as comunidades microbianas em seus

ambientes naturais. Os estudos ecolgicos permitiram compreender as caractersticas metablicas
dessas comunidades e esclarecer as etapas do ciclo de alguns elementos (carbono, nitrgeno, azufre).
A construo de uma coluna de Winogradsky um mtodo simples de estudo da diversidade
microbiana mediante a seleo de microrganismos com determinadas caractersticas metablicas.
Trata-se de enriquecer uma amostra de solo com nutrientes, de modo a favorecer o crescimento de
algumas comunidades. Existem numerosas variaes e combinaes possveis na escolha das fontes
de enriquecimento: 1. Fontes de carbono: Materiais que liberam carbono rapidamente tais como
carbonato de sdio, bicarbonato de sdio ou carbonato de clcio (giz modo). Materiais de origem
vegetal que liberam carbono mais lentamente, tais como grama, feno, agulhas de pinho, papel jornal,
papel higinico, amido de milho, aveia, serragem etc. 2. Fontes de enxofre: Enxofre, sulfato de clcio,
sulfato de magnsio, ovos cozidos, queijo etc. 3. Fontes de ferro: Limalha de ferro, qualquer
comprimido contendo ferro. 4. Fontes de fsforo e potssio: Ouro verde ou qualquer outro fertilizante
para plantas com K2HPO4 Proporo: meia colher de ch/l. 5. Fontes de vitaminas: qualquer produto
multivitamnico. Uma modificao parcial ou total do modo de enriquecimento ou do tratamento
permite selecionar microrganismos com caractersticas especficas: bactrias de ferro (ferro),
bactrias do ciclo do nitrognio (fertilizante em excesso), bactrias termfilas (incubao a
temperatura elevada), bactrias halfilas (sal), bactrias acidfilas (vinagre), bactrias basfilas
(fermento qumico) etc. As variaes parecem ser infinitas. H quem coloque coca-cola no meio e
quem acrescente um pedao de casca de fruta para identificar os microrganismos capazes de
coloniz-las. Onde est a dimenso tecnolgica? O mtodo se aplica na prospeco de bactrias
capazes de degradar algum contaminante. Em amostras de solo enriquecidas com essa substncia, s
crescero aquelas que so capazes de metaboliz-la. Contextualizando biotecnologicamente o
mtodo, estaremos no caminho da biorremediao.

Existem inmeros e bons protocolos na Internet, sendo os meus preferidos:

Building a Winogradsky Column. An Educator Guide with Activities in Astrobiology.

http://quest.nasa.gov/projects/astrobiology/fieldwork/lessons/Winogradsky_5_8.pdf Deacon, J. The
Microbial World: Winogradsky column: perpetual life in a tube.
http://www.biology.ed.ac.uk/research/groups/jdeacon/microbes/winograd.htm

La colonne de Winogradsky. Illustration de la photosynthse microbienne et du cycle du soufre.

http://www2.ac-lyon.fr/enseigne/biotech/Winogradsky.html

Composto orgnico Bokashi

O Bokashi um tipo de composto orgnico concentrado, que utiliza EM (Effective Microorganisms)
como inoculante, e outros resduos industriais, como farelo de arroz e algodo
 Figura 11. Aparncia do adubo fermentado, mtodo Bokashi

O Bokashi pode ser aplicado em covas, ruas, no p da planta, a lano, ou com calcareadeira,
quando a rea for muito grande. No caso de aplicao manual, deve-se tomar cuidado para
que no se formem torres muito grandes.

A quantidade de Bokashi a ser aplicada no solo varia muito de cultura para cultura e tambm com o
histrico e a anlise do solo. Em um solo onde a quantidade de matria orgnica baixa, a dosagem
e a frequncia de aplicao bem diferente de um solo onde a matria orgnica sempre
incorporada.
EM (effective Microorganisms) um conjunto de microrganismos que vivem no solo naturalmente frtil.
Pode-se dizer que o EM constitudo basicamente por quatro grupos de -, que so:

-Leveduras;
-Actinobactrias;
-Bactrias produtoras de cido lctico;
-Bactrias fotossintetizantes.

Cada grupo desempenha uma funo no solo, melhorando a capacidade de produo das plantas,
pois confere a elas maior resistncia aos agentes patognicos existentes no solo e maior
disponibilidade de elementos necessrios ao crescimento.

Funo do Bokashi no solo:

Dada a sua composio muito rica em matria orgnica, o Bokashi proporciona ao solo uma srie de
vantagens, entre elas, melhor estrutura. Podemos dizer que, desde que aplicado, de forma correta,
recupera o solo depauperado (esgotado). Os micro-organismos contidos no Bokashi transformam a
matria orgnica em substncias solveis e utilizveis pela planta.
 Materiais usados no preparo do Bokashi:

-500 kg de farelo de arroz;

-200 kg de farelo de algodo;
-100 kg de farelo de soja;
-170 kg de farinha de osso;
-30 kg de farinha de peixe;
-40 kg de termofosfato;
-200 kg de carvo modo;
-4 L de melao;
-4 L de EM4;
-350 L de gua.

Como fazer o composto orgnico Bokashi:

O principal cuidado que se deve exercer ao preparar o Bokashi o seu ponto de umidade. A umidade no
preparo to importante que por meio dela podemos obter um Bokashi de extrema qualidade ou
ento um Bokashi putrefato, em que a maioria dos nutrientes se perde com a m fermentao.

O primeiro passo para se obter a umidade ideal da fermentao ir molhando, aos poucos, o material.
Depois de tudo uniformemente misturado, coloca-se um pouco do preparo, na palma da mo, que
deve ser fechada com fora. Esse composto no deve escorrer entre dos dedos, nem deve ser to
seco a ponto de no formar um torro.

O torro que se forma na mo deve ser facilmente esfarelado, quando manipulado, ou seja,
fechando-se as mos, o Bokashi forma torres; apertando-o o torro se desfaz.

Em condies ideais, o Bokashi estar pronto de uma semana a dez dias.

A coluna de Winogradsky uma forma simples de selecionar e estudar os microrganismos

existentes em qualquer ambiente. A coluna pode ser construda a partir de lodo ou solo de
qualquer origem, com gua proveniente da mesma fonte ou de uma fonte diferente. A seleo de
diferentes tipos de microrganismos se consegue mediante o acrscimo de alguns componentes
(orgnicos e inorgnicos) e o ajuste do pH. A iluminao estimula o crescimento de fottrofos
(aerbios e anaerbios), que se desenvolvem formando um biofilme entre a parede da garrafa e o
meio. Perto do topo da coluna crescero os organismos aerbios e microaerfilos, no fundo se
multiplicaro os anaerbios (Clostridium, bactrias metanognicas).

Figura 12. Desenvolvimento de comunidade microbiana em coluna de Winogradsky, disponvel em

http://revistas.unifoa.edu.br/index.php/cadernos/article/viewFile/1053/920

Figura 13. Desenho esquemtico mostrando comunidade microbiana em coluna de Winogradsky.

Fonte: https://aulanapratica.wordpress.com/category/experimento-estendido/

OBJETIVO: construir uma coluna de Winogradsky para observar os micro-organismos do ambiente.

Materiais Bsicos
1 bacia, garrafas plsticas transparentes de 2L, 1 funil, 1 copo plstico, lodo ou amostra de terra do
local analisado, gua do mesmo local, uma fonte de celulose, uma fonte de fsforo e potssio, uma
fonte de CO2, uma fonte de enxofre e, eventualmente, uma fonte de ferro, pedaos de gaze para
cobrir as garrafas, elsticos.

Mtodo
1. Colocar em um recipiente cinco copos de lama, terra de solo pobre; retirar todas as pedras, ramos
ou folhas.
2. Diluir uma colher de ch de fertilizante (Bokashi, previamente preparado com inculo selecionado)
em um volume equivalente de gua. Em outra coluna, inocular apenas com os microrganismos
selecionados (bioinoculante), em outra o mesmo volume de fertilizante.
3. Preparar com ambas partes uma mistura de consistncia cremosa, suficientemente fluida para
passar pelo funil.
4. Colocar no fundo da garrafa 10 g da fonte de celulose, 5 g da fonte de CO 2, 5 g da fonte de enxofre
e, eventualmente, a fonte de ferro.
5. Acrescentar um pouco da mistura. Eliminar o ar, batendo com firmeza para assentar a mistura.
6. Colocar outras camadas de lodo, assentando-as como anteriormente, at que a garrafa esteja 90%
cheia. Se for necessrio, eliminar as bolhas existentes mexendo com uma vareta.
7. Aguardar 30 minutos. A camada de gua na parte superior dever medir pelo menos dois cm de
altura. Acrescentar gua, se for o caso. Observe-se que a proporo das camadas inferior de lodo e
da camada superior de gua pode variar.
8. Cobrir a garrafa com um pano e fechar com um elstico.
9. Incubar em um lugar onde receba suficiente luz, mas no sol direto.
10. Acompanhar semanalmente as variaes, e acrescentar gua quando necessrio para no deixar
secar a coluna.

Exopolissacardeos (EPS) de bactrias

Os biopolimeros extracelulares, sintetizados por algumas espcies bacterianas, so de natureza

polissacardea e/ou proteica, se localizam a membrana externa das clulas Gram negativas e ao
peptidoglicano das Gram positivas. So sintetizados por polimerases e formam uma estrutura
complexa e bem hidratada (N 95% gua), a base de polmeros de carboidratos e protenas
fracamente arranjadas. Esses exopolissacardeos (EPS) variam muito em sua composio e
propriedades fsico-qumicas podendo ser neutras, ou no.
A maioria dessas macromolculas polianinica devido presena de cidos urnicos,
cetopiruvatos e resduos inorgnicos, como o fosfato ou sulfato (SUTHERLAND, 1990). Poucos EPS
policatinico j foram descritos, como por exemplo, associados a cepas e biofilmes de linhagens de
Staphylococcus epidermidis (MACK et al., 1996).
A composio e estrutura dos polissacardeos determina sua conformao primria, j a
configurao secundria frequentemente assume a forma de hlices agregadas. Dependendo da
composio da cadeia principal a conformao secundria toma uma forma consideravelmente mais
rgida, como o do esqueleto celulsico de xantana de Xanthomonas Campestris, ou uma estrutura
mais flexvel como presente em muitos dextranas (SUTHERLAND, 1990).

MACK, D., FISCHER, W., KROKOTSCH, A., LEOPOLD, K., HARTMANN, R., EGGE, H. & LAUFS, R. The intercellular
adhesin involved in biofilm accumulation of Staphylococcus epidermidis is a linear - 1,6-linked
glucosaminoglycan: purification and structural analysis. J Bacteriol, v. 178, p.175183, 1996.

SUTHERLAND, I. W. Biotechnology of Exopolysaccharides. Cambridge: Cambridge University Press, 1990.

PAULO et al. Production, extraction and characterization of exopolysaccharides produced by the native
Leuconostoc pseudomesenteroides R2 strain. Anais da Academia Brasileira de Cincias 84(2): 495-507, 2012

Figura 14 a) Superfcie de polmero (EPS I) e a1) micrografias eletrnicas de varredura (MEV) de EPS I. b)
polmero sedimentado (EPS II) e b1) Micrografias de caractersticas em MEV EPS II de L. pseudomesenteroides
R2. (Paulo et al. 2012)
Produo de EPS

Com o intuito de verificar a produo de EPS os isolados bacterianos sero inoculados e

testados tanto em meio slido quanto lquido. Em ambos os testes o meio de cultura empregado ser
um meio rico em fonte de carbono, no caso o Manitol, porm em duas composies diferentes. O
primeiro mais simples, contendo 20g de Manitol e 2g de extrato de levedura em 1L de gua e o
segundo, mais complexo, composto por 50g de Manitol, 20g de extrato de levedura; 0,01g de Cloreto
de Sdio (NaCl); 0,01g de Sulfato ferroso (FeSo4); 0,02g de Sulfato de magnsio heptahidratado;
0,01g de Sulfato de mangans (MnSo4); 0,02g de Cloreto de Clcio (CaCl2); 20g de Fosfato de potssio
bibsico (K2HPO4) em 1L de gua destilada.

Produo de EPS em meio slido

Para a realizao desse ensaio, os isolados bacterianos sero cultivados separadamente em

meio TSB por 24h, formando assim o inoculo. Concomitantemente o meio slido rico em Manitol
ser preparado e autoclavado 121oC por 15min e as placas de Petri sero preparadas, dividas em 4
quadrantes. No centro de cada quadrante ser colocado um disco de papel filtro estril (previamente
autoclavado) medindo aproximadamente 5mm e em cada disco ser adicionado 5L do inoculo
(Figura 15) (PAULO et al., 2012). Aps 24 a 48hrs ser avaliada a produo de EPS baseando-se na
formao da colnia mucoide ao redor do disco (GUIMARES et al., 1999).

GUIMARES, D. P. Optimization of dextran synthesis and acidic hydrolisis by surface response analysis. Brazilian
Journal of Chemical Engineering, v. 16, n. 2, p.129-139, 1999.

Figura 15: Placa de Petri contendo meio slido rico em Manitol, dividido em quatro quadrantes, onde
sero inseridos os discos de papel filtro para a adio do inoculo bacteriano.
Produo de EPS em meio lquido

A avaliao em meio lquido se fez necessria para a quantificao e mensurao em gramas

por mL da produo de EPS por cada isolado bacteriano. Para esse processo, os isolados sero
cultivados em meio slido TSA por 24h, sequencialmente com o auxlio de uma ala de transferncia
esterilizada em chama incandescente uma colnia ser coletada e colocada em um tubo de
centrfuga contendo 10 mL de meio lquido rico em Manitol conforme descrito no tpico anterior. Os
inoculos sero preparados separadamente e colocados em shaker a 120 rotaes por minuto (rpm)
28oC por 6 dias.
Aps o perodo de incubao as amostras sero centrifugadas a 4.500 rpm por 20 minutos
para a separao do EPS das clulas bacterianas. Cada cultura sobrenadante, 10 mL, ser removida e
transferida para tubos limpos onde sero adicionados 30 mL de etanol (EtOH) gelado (-20oC) 95%,
ficando em repouso por 30 min -80oC. Posteriormente as mesmas sero centrifugadas 4.500 rpm
por 40 min, descartando o sobrenadante e lavando o pellet com 1mL de EtOH 70%, seguindo
protocolo adaptado de BurBank, Mohammadi e Roper (Univ. da California-Riverside). Nesse ponto as
amostras sero transferidas para tubos de microcentrfuga estreis para a quantificao por peso de
massa seca, isso tanto para a massa de clulas aps a primeira centrifugao, quanto para o EPS
extrado aps a ltima lavagem com EtOH 70%.

Ensaio de Antagonismo
O inoculo bacteriano ser preparado utilizando os isolados bacterianos, previamente
selecionados. Cada isolado ser inoculado em placa de Petri (TSA) frente aos demais isolados,
observando-se assim se houve formao das colnias aps 24 e 48hrs.
 Figura 16:Fonte: http://www.horticom.com/pd/imagenes/59/468/59468.html

Ensaios com bactrias promotoras do crescimento vegetal

As bactrias promotoras de crescimento, que se associam as razes das plantas e tem

a capacidade de aumentar a produtividade e conferir as plantas caractersticas de imunidade
e tolerncia induzida a fatores abiticos como a salinizao e a seca. Estas bactrias podem
aumentar a absoro de nutrientes do solo, reduzindo assim a utilizao de insumos
qumicos, contribuindo para reduo de custos por parte dos agricultores e diminuindo a
contaminao de gua e solo (YANG et al., 2009). Estas bactrias colonizam as plantas,
podendo com a interao causar mudanas fisiolgicas, proporcionar benefcios como
aumento da absoro de nutrientes, controle de fitopatgenos, entre outros (MOREIRA &
ARAJO, 2011). De acordo com Ryu et al. (2004), as bactrias podem desencadear resistncia
sistmica induzida, por aumentar a produo de hormnios volteis como jasmonato de
metil desencadeando respostas de defesa nas plantas contra fitopatgenos.
(texto retirado do artigo de, de Arajo et al. 2012, Colloquium Agrariae, vol. 8, n.
Especial, juldez, 2012).
 Figura 17. Mecanismos de ao pelos quais bactrias promotoras de crescimento vegetal
(BPCV), simbinticas ou no simbinticas, podem beneficiar o desenvolvimento da cana-de-acar
(Adaptado de MAHESHWARI, 2011)
Fonte:
htps://www.researchgate.net/publication/286925078_Microrganismos_estimulantes_na_agricultura?channel=doi&linkId=56700b
0908aecdcd23588c6f&showFulltext=true

Maheshwari, D.K. Bacteria in agrobiology: crop ecosystems. Heidelberg: Springer, 2011. 434 p .

Figura 18. Aspecto de uma rcula tratada com consorcio microbiano (a esquerda) e controle,
sem tratamento (a direita).
 Mtodo:
Preparo do Inculo: Inocular o consrcio selecionado em meio caldo triptona soja e
incubar a 30 oC por 24 h.
Diluio: Aps crescimento, centrifugar a 3500 rpm por 5 min, descartar o
sobrenadante e diluir a biomassa em gua Milliq at a concentrao desejada.
Inoculao das sementes: colocar as sementes na terra e banhar com o inculo na
concentrao determinada, cobrir suavemente com solo e aguardar germinao,
observando, semanalmente.

FUNGOS
MICROCULTIVO DE LEVEDURAS
Material e Mtodo:

Para a sua execuo, necessrio ter uma placa de microcultivo.

Fundir meio de Agar - fub com Tween 80;
Pipetar a lmina da placa de microcultivo at cobri - l (cuidado para no formar bolhas);
Deixar solidificar;
Com uma ala de platina, semear em estria fina (1 a 2);
Umedecer o papel de filtro e incubar a 25-30 C por 24-48 horas ou at cinco dias;
Quando houver desenvolvimento satisfatrio, submeta ao do formol (0,5 ml durante 1 hora). E
leve diretamente para o exame ao microscpico.

Leitura e interpretao:

Este mtodo deve ser realizado quando se necessita de estudo morfolgico detalhado das leveduras.
possvel estudar as caractersticas das clulas vegetativas das leveduras, como tambm a formao
de pseudo-hifas e dos esporos por multiplicao vegetativa (clamidocondio, artrocondio e
blastocondio).

TCNICA DE MICROCULTIVO PARA FUNGOS FILAMENTOSOS

1. Colocar sobre uma lmina esterilizada, contida em uma placa de Petri estril, um cubo de gar: ASD
 ou gar batata.

2. A lmina deve estar sobre um suporte, que pode ser formado por outra lmina, ou um pequeno
basto de vidro recurvado, ou ainda, dois palitos de fsforo.

3. Semear o fungo, a partir de repique recente, nos 4 lados do cubo de gar. Recobrir com uma lamnula
esterilizada.

4. Fazer uma cmara mida, adicionando 1 a 2 ml de gua destilada estril no fundo da placa ou
embeber um pequeno chumao de algodo estril, para evitar a dessecao do meio de cultura,
durante o crescimento do fungo.

5. Tampar a placa e deixar temperatura ambiente por 7 a 10 dias, at que se observe

desenvolvimento de hifas com ou sem pigmentao.

6. Aps esse perodo, inativar a esporulao, adicionando 1 ml de formol ao algodo e vedando a placa
com fita adesiva durante 24h-48h. O vapor de formol, alm de inativar o fungo, ir auxiliar na fixao
das estruturas microscpicas.

7. Retirar a lamnula com auxlio de uma pina, cuidadosamente, uma vez que nela devero estar
aderidas as hifas e esporos do fungo.

8. Pingar uma gota de corante azul de lactofenol-algodo (Cotton Blue) e montar sobre uma lmina.

9. Desprezar o cubo de gar e, em seu lugar, pingar outra gota de corante azul e recobrir com lamnula,
para visualizar esporos e hifas tambm aderidos lmina.

10. Observar em microscpio tico com objetiva de 40 x, o tipo e cor da hifa, forma disposio e
formao de esporos.

Figura 19. Tcnica de microcultivo de fungos

 Fonte: http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/microbiologia/mod_7_2004.pdf

O corante azul de lactofenol-azul algodo, utilizado na microscopia de culturas de fungos

filamentosos, formulado e preparado da seguinte forma:

Azul de lactofenol-algodo
cido ltico: 20g
Cristais de fenol :20g
Glicerina: 20g
Azul algodo: 0,05g
gua destilada: 20g

Fundir os cristais de fenol em banho-maria e juntar

Esperar 24 h e filtrar

O azul algodo pode ser substitudo pelo azul de metileno

Fonte:
Microbiologia, ICB/UFMG.
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/microbiologia/mod_7_2004.pdf

Figura 20. Tcnica de microcultivo de fungos.

4.1. Pingar uma gota de corante azul de lactofenol-algodo (Cotton Blue) e montar sobre uma
lmina.

4.2. Desprezar o cubo de gar e, em seu lugar, pingar outra gota de corante azul e recobrir com
lamnula, para visualizar esporos e hifas tambm aderidos lmina.

4.3. Observar em microscpio tico com objetiva de 40 X, o tipo e cor da hifa, forma disposio e
formao de esporos.

Fonte:
Microbiologia, ICB/UFMG.
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/microbiologia/mod_7_2004.pdf