Composicin del aceite esencial y actividad antifngica de Salvia officinalis originarios

del noreste de Marruecos, contra la fitopatgena poscosecha hongos en las manzanas

ABSTRACTO
El aceite esencial de Salvia Officinalis, una planta medicinal endmica de Marruecos, se ha
estudiado utilizando gas cromatografa (GC) y espectrometra de masas GC (GC-MS). 96.3%
de los componentes son detectados. y el mayor componentes fueron, l'-thujone (22.2%), le
1,8-cinole (18.4%), le trans-pinocarveol (9.4%), le -thujone (8.4%) le -pinne (8.2), le
globulol (5.9%), le -Humulene (3.7%) et le trans-caryophyllne (2.6%). actividad antifngica
del aceite esencial se evalu in vitro por la tcnica de alimentos venenosos (PF) y la actividad
voltil ensayo (VA) contra tres fitopatgenos que causan el deterioro de la manzana, como
Botrytis cinerea, Penicilliumexpansum y Rhizopusstolonifer. La tcnica PF demostr inhibicin
significativa del micelio crecimiento de todas las cepas (p <0.05), con la inhibicin completa de
P. expansum a MIC = 2 L / mL. Del mismo modo, el VA ensayo mostr que el aceite esencial
inhibe fuertemente los tres hongos. La inhibicin completa del crecimiento micelial de tanto
P.expansum como R.stolonifer, se observaron respectivamente en MIQ = 80 L / disco y
160L / disco. El general los resultados sugieren que el aceite esencial de S.Officinalis tiene
un potencial como conservantes antifngicos para el control de enfermedades poscosecha de
la manzana.
Palabras clave: actividad antifngica, SalviaOfficinalis, aceite esencial, anlisis GC-MS,
Apple.
INTRODUCCIN
Durante el almacenamiento, las frutas y verduras a menudo estn sujetas a diferentes niveles
de descomposicin microbiana, principalmente atribuibles a hongos patgenos, que
generalmente infectan al husped a travs de heridas sufridas durante la manipulacin y / o
procesamiento de la cosecha. Se estima que alrededor del 20 al 25% de las frutas y verduras
cosechadas son destruidas por patgenos despus de la postcosecha. manejo, incluso en
pases desarrollados [1].
El uso de qumicos sintticos como fungicidas es un mtodo principal para controlar la
descomposicin poscosecha de las manzanas. Sin embargo, la aparicin de cepas de
patgenos resistentes a estos fungicidas, as como la creciente preocupacin por el petrleo,
el anlisis GC-MS, Apple. la seguridad humana y la proteccin del medio ambiente nos
obligan a buscar alternativas al uso de sintticos fungicidas para controlar las enfermedades
poscosecha [2].
La manzana (Malusdomestica) es la tercera cosecha de fruta ms cultivada en el mundo
(5280 Mha) y la tercera en produccin (59 059 Mt) despus de Citrus sinensis (naranja) y
Musa paradisiaca (pltano) en 2004, segn Food and Estadsticas de la Organizacin Agrcola
[3]. Sin embargo, la calidad de la manzana se deteriora debido a enfermedades poscosecha,
como el moho azul causado por Penicilliumexpansum, la podredumbre de ojo de buey
causada por Alternaria species y Rhizopus soft pudricin causada por Rhizopusstolonifer [4].
La supervivencia de estos hongos patgenos en los alimentos es un problema grave en
pases en desarrollo que pueden provocar el deterioro y el deterioro de la calidad de los
productos alimenticios. Estos agentes fngicos producen tambin micotoxinas que pueden ser
mutagnicas, teratognicas, cancergenas, causantes de rechazo de alimento y vmitos en
humanos o animales [5]. Recientemente, muchos investigadores han demostrado que las
fuentes naturales como los aceites esenciales podran desarrollarse como una alternativa
prometedora a los fungicidas sintticos debido a su baja toxicidad para los mamferos, menos
efectos ambientales y amplia aceptacin pblica [6].
Salvia officinalis es un sub-arbusto de la familia Lamiaceae, a menudo se cultiva en jardines
como condimento y planta officinale o simplemente por la belleza de su follaje y flores.
Tambin se llama hierba sagrada. Esta es una planta altamente ramificada, barras cuadradas,
la base de madera. Las hojas acechadas son de color verde plido, aterciopeladas, oblongas.
Las flores en flor vertical los tallos se agrupan en pequeos grupos. Se usa con mayor
frecuencia en forma de infusin. Luego se usa principalmente contra el dolor problemas
estomacales y digestivos, tambin ayuda a combatir el exceso de sudor. Por lo tanto, a
menudo se administra a la posmenopausia mujeres para reducir la sudoracin nocturna.
Finalmente, tambin sera eficaz para aliviar la inflamacin de las vas respiratorias superiores
tracto (nariz, boca y garganta) [7, 9-11]. Informes sobre la composicin del aceite esencial de
esta especie han sido publicados por varios autores [12-18], aparte de algunas variaciones
qumicas, cis y trans-thujones. El objetivo de este estudio es el estudio del efecto antifngico
del aceite esencial de Salvia officinalis sobre el crecimiento micelial de tres hongos (Botrytis)
cinerea, Penicilliumexpansum y Rhizopusstolonifer) responsables de la podredumbre de la
manzana almacenada en refrigeradores.

MATERIALES Y MTODOS
2.1. Material vegetal
La parte area de Salvia Officinalis se cosech en marzo 2011 en la naturaleza en la montaa
AssoullocatedTaza en el Nord-este de Marruecos. Se deposit un espcimen de comprobante
en el Herbario de la Facultad de Ciencias, Oujda, Marruecos. El material vegetal seco se
almacena en el laboratorio a temperatura ambiente (298 K).
2.2. Aislamiento de aceites esenciales
El material vegetal seco (100 g) se destil con agua (3 h) usando un aparato de tipo
Clevenger. Lo esencial oilobtenido se sec bajo sulfato de sodio anhidro y se almacen a 4
C en la oscuridad antes del anlisis. Lo esencial el rendimiento promedio de los aceites fue del
1.5%.
2.3. Aparato y procedimiento de hidrodestilacin

A menudo, la hidrodestilacin se realiz mediante el uso de aparatos Deryng o aparatos de

tipo Clevenger. En esto La extraccin de aceite esencial de la parte area de Salvia Officinalis
se realiz por hidrodestilacin utilizando un Aparato tipo clevenger fig.1.
2.4. Caracterizacin y composicin qumica de aceites esenciales
La espectrometra de masas por cromatografa de gases (GC-MS) combina las caractersticas
de la cromatografa gas-lquido (GC) y espectrometra de masas (MS). Esto hace posible
identificar diferentes sustancias dentro de una muestra de prueba. GC-MS Los usos de
hasmany incluyen deteccin de drogas, investigacin de incendios, anlisis ambiental e
investigacin de explosivos. Puede tambin se puede usar para identificar muestras
desconocidas. GC-MS tambin se puede utilizar en la seguridad del aeropuerto para detectar
sustancias en equipaje o seres humanos. Adems, GC-MS puede identificar oligoelementos
en materiales deteriorados, incluso despus de la muestra se separ tanto que otras pruebas
no pueden funcionar. GC-MS es la mejor forma para que los expertos forenses identifiquen
sustancias porque es una prueba especfica. Una prueba especfica identifica positivamente la
presencia real de un particular sustancia en una muestra determinada.
Los componentes qumicos del aceite esencial de SalviaOfficinalis fueron determinados por
anlisis espectral de gas cromatografa y cromatografa de gases acoplada a espectrometra
de masas (GC-MS), identificndose seis principales componentes para aceites esenciales
estudiados.
Los anlisis GC se realizaron utilizando un aparato Perkin-Elmer Autosystem GC (Walhton,
MA, EE. UU.) Equipado con un inyector nico y dos detectores de ionizacin de llama (FID). El
aparato fue utilizado para muestreo simultneo a dos columnas capilares de slice fundida (60
m 0.22 mm, espesor de pelcula 0.25 lm) con diferentes fases estacionarias: Rtx-1
(polidimetilsiloxano) y Rtx-Wax (polietilenglicol). Programa de temperatura: 333-503 K a 275
K / min y luego se mantuvo isotermo 503 K (30 min). Gas portador: helio (1 ml / min). Las
temperaturas del inyector y del detector se mantuvieron a 553 K. La inyeccin dividida se
realiz con una divisin de proporcin de 1:80; espectros de masas de ionizacin de
electrones fueron adquiridos con un rango de masa de 35-350 Da. Volumen inyectado: 0.1 lL.
Para cromatografa de gases-espectrometra de masas, los aceites obtenidos se investigaron
utilizando un Perkin-Elmer Detector TurboMassQuadrupole, acoplado directamente a Perkin-
Elmer Autosystem XL equipado con dos fusibles de slice columnas capilares (60 m 0.22
mm, espesor de pelcula 0.25 lm), Rtx-1 (polidimetilsiloxano) y Rtx-Wax (polietilenglicol). Otras
condiciones de GC fueron las mismas que las descritas anteriormente. Temperatura de la
fuente de iones: 423 K; ionizacin de la energa: 70 eV; los espectros de masas de
electronionizacin se adquirieron con un intervalo de masas de 35-350 Da. Petrleo volumen
inyectado: 0.1 lL [7].
La identificacin de los componentes se bas (i) en la comparacin de sus ndices de
retencin de GC (RI) en polares y columnas polares, determinadas en relacin con el tiempo
de retencin de una serie de n-alcanos con interpolacin lineal, con los de los compuestos
autnticos o datos de la literatura [19] y (ii) en la coincidencia de la computadora con la masa
comercial spectrallibraries [19,20] y comparacin de espectros con los de nuestra biblioteca
personal. Cantidades relativas de Los componentes individuales se calcularon sobre la base
de sus reas de picos GC en los dos capilares Rtx-1 y Rtx-Wax. columnas, sin correccin del
factor de respuesta FID.
2.5. Aislamiento de cepas fngicas
Tres aislados fngicos que causan la pudricin de las manzanas: Botrytis cinerea,
Penicilliumexpansum y Rhizopusstolonifer fueron aislado directamente de manzanas
enraizadas recogidas de diferentes habitaciones en la estacin de Midelt (Marruecos). Todos
los hongos aislados las especies fueron transferidas a tres rplicas esterilizadas de placas de
Petri de 9 cm que contenan agar fresco de papa dextrosa (PDA) medio en presencia de una
cantidad de estreptomicina para detener el crecimiento de bacterias. Las placas se incubaron
en 25 2 C durante 7 das y oscuridad. Las colonias fngicas en desarrollo se purificaron e
identificaron hasta el nivel de especie mediante examen microscpico con la ayuda de las
siguientes referencias [21]. Los aislamientos recolectados fueron mantenido en PDA a 4 C.
2.6. Ensayo de actividad antifngica
La actividad antifngica del aceite esencial de Salvia Officinalis contra el crecimiento micelial
de hongos aislados fue llevado a cabo utilizando la tcnica de alimentos envenenados (PF)
[22] y ensayo de actividad voltil (VA) [23] con algunas modificaciones. En PF, el aceite
esencial se dispers como una emulsin en suspensin de agar estril (0,2%) y se aadi a
PDA. inmediatamente antes de que se vaciara en las placas de Petri de vidrio (90 20 mm de
dimetro) a una temperatura de 40-45 C. Las concentraciones probadas fueron de 0,25 a 2
L / mL. Los controles recibieron la misma cantidad de suspensin de agar estril (0.2%)
mezclado con PDA. Los hongos probados se inocularon con tapones miceliales de 6 mm de
cultivos de 7 das de edad. con un corcho estril e incubado durante 11 das para B.cinera, 7
das para P.expansum y 60 horas para R.stoloniferat 25 2 C.
En el ensayo VA, las placas de Petri (90 20 mm) se llenaron con 20 mL de medio de agar de
papa dextrosa (PDA) y Luego se sembr con un disco micelial (6 mm de dimetro), cortado de
la periferia del cultivo de micelio de 7 das de edad del testsfungi. Las placas de Petri (90 20
mm, que ofrecen 80 ml de espacios de aire despus de la adicin de 20 ml de medio de agar)
fueron Discos de papel de filtro estriles e invertebrados (9 mm de dimetro) impregnados con
diferentes concentraciones de aceite esencial: Se depositan 10, 20, 40, 80 y 160 L / disco de
aire sobre la tapa invertida y se incuban durante 10 das para B.cinera, 6 das para
P.expansum y 48 horas para R.stoloniferat 25 2 C. Para cada control correspondiente, la
misma cantidad de agua era vertido en el filtro de papel esterilizado.
En ambos tipos de experimentos, se inocularon tres placas replicadas para cada tratamiento
(hongos / cantidad) y el experimento se realiz tres veces y se sigui el crecimiento micelial
midiendo el dimetro siguiendo dos lneas perpendiculares pasando por el centro del plato. La
fungitotoxicidad del aceite esencial se expres en trminos de porcentaje de inhibicin del
crecimiento micelial (I%) y calculados siguiendo la frmula de Pandey et al. [24].

(%) = 100

Donde DtandDiis representa el dimetro de crecimiento micelial en placas de Petri controladas
y tratadas, respectivamente.

Las mediciones se usaron para determinar la concentracin mnima inhibitoria (CIM)

(concentracin ms baja de el aceite esencial que inhibir el crecimiento visible de un
microorganismo despus de la incubacin durante la noche). Thefungistatic- la naturaleza
fungicida del aceite esencial se prob observando la reactivacin del crecimiento del disco
micelial inhibido que sigue su transferencia a PDA no tratado. Un efecto fungicida fue donde
no hubo crecimiento, mientras que un efecto fungisttico fue donde se produjo la inhibicin
temporal del crecimiento microbiano.
2.7. Ensayo de produccin de esporas

La produccin de esporas fngicas se prob usando el mtodo modificado de Tzortzakis y

Economakis [25]. Las esporas del Las colonias previamente expuestas por el vapor de aceite
esencial se recogieron mediante la adicin de 5 ml de agua estril que contiene 0,1% Tween-
20 a cada placa de Petri y frotando la superficie tres veces con el esparcidor estril en forma
de L para liberar las esporas. Las suspensiones de esporas obtenidas se filtraron a travs de
una estopilla esterilizada en un vaso de precipitados de vidrio estril de 50 ml y
homogeneizado por sacudidas manuales. La concentracin de esporas se estim utilizando un
portaobjetos de hemocitmetro (profundidad 0.1 mm, 0.0025 mm2). El porcentaje de
reduccin de la produccin de esporas se calcul mediante la siguiente ecuacin:

(%) = 100

WhereNt y Ni representan el nmero de esporas en placas de Petri controladas y tratadas,
respectivamente.
2.9. Experimentos de transferencia
En ambos tipos de experimentos, para hacer una distincin entre los efectos fungistticos o
fungicidas del Aceite Esencial en el organismo objetivo (concentracin fungicida mnima
(MFC) y cantidad mnima fungicida (MFQ)), transferencia los discos de la placa de Petri donde
la inhibicin por aceite esencial era total en un medio PDA no complementado por aceite
esencial. Era fungisttico si el crecimiento comenzaba de nuevo y fungicida si no lo haca.
2.10. Anlisis de los datos
El efecto inhibitorio del aceite esencial sobre el crecimiento micelial se analiz mediante un
anlisis de varianza (ANOVA). Media y el error estndar de datos se calcul utilizando el
software SAS (SAS para Windows versin 9.0). La separacin de los medios se hicieron
usando la prueba de Diferencia Significativa Mnima (LSD) a p <0.05.
RESULTADOS

3.1. Composicin del aceite esencial

El anlisis de la composicin del aceite esencial de S.Officinalis se llev a cabo utilizando GC
y GC-MS de acuerdo con metodologa descrita en la parte experimental. Por lo tanto, 31
componentes que representan el 96.3% del total del aceite fueron identificadas por
comparacin de sus espectros de masa EI y sus ndices de retencin con los de nuestra
propia autenticidad biblioteca compuesta (Tabla 1).
3.2. Actividad antifngica in vitro

Usando la tcnica PF, los efectos de las concentraciones del aceite esencial de Salvia
Officinalisonmycelial growth despus de un perodo de incubacin de once das para
B.cinerea, y siete das para P. expansum y sesenta horas para R. stolonifer, a 25 2 C se
resumen en la Tabla 2.

Tabla 1: Composicin qumica del aceite esencial de S.Officinalis de Marruecos [7]

Tabla 2: Porcentajes de inhibicin del crecimiento micelial de B.Cinera, P. expansum y R.

stolonifer en diversas concentraciones de aceite esencial de Salvia Officinalis.
Los valores medios ( desviacin estndar) seguidos de diferentes nmeros y letras en
cada fila (lnea y columna) indican diferencias significativas (p <0.05) por prueba de
diferencia mnima significativa (LSD)
Estos resultados indican que el porcentaje de inhibicin del crecimiento micelial aument con
concentraciones crecientes de Aceite de Salvia Officinalis para todas las cepas probadas. Este
resultado sugiere que el aceite esencial tiene una actividad significativa (p < 0.05) e inhibi el
crecimiento micelial de todas las cepas de una manera dependiente de la dosis. Estaba claro
que P. expansum mostr una alta sensibilidad al aceite esencial de S.Officinalis a una
concentracin de 2 L / mL. La tasa de inhibicin alcanzada 30.04% para P. expansum a 0.25
L / mL, y 100% a 2 L / mL, lo que indica que esta ltima concentracin fue la concentracin
inhibitoria mnima (MIC) del aceite de S.Officinalis contra P.expansum, mientras que mostr
una concentracin moderada actividad antifngica contra B.cinerea y R. stolonifer, el
porcentaje de inhibicin aumenta moderadamente con el concentracin que alcanza
respectivamente el valor mximo de 64.4% y 38.42% a 2L / mL, lo que demuestra que MIC
son ms de 2 L / mL. Esto podra ser atribuible al modo de resistencia de los hongos contra
varios sustancias presentes en el aceite esencial. Tambin notamos que B.Cinera y R.
stolonifer tenan el mismo grado de sensibilidad a diferentes concentraciones del aceite
(diferencia significativa, p <0.05). Por lo tanto, los patgenos de plantas estudiados se pueden
clasificar segn su sensibilidad al aceite en el siguiente orden: P. expansum> B.Cinera> R.
stolonifer.Por otra parte, es importante conocer la naturaleza fungitxica del aceite esencial a
2 L / mL de P. expansum De hecho, la transferencia de un disco micelial de las placas que
contienen un medio PDA y 2 L / mL del aceite esencial en PDA fresco (sin aceite) mostr que
el micelio de P. expansum no ha crecido despus de la incubacin durante siete das,
indicando un efecto fungicida de este aceite sobre esta cepa (sin actividad fungisttica) a 2 L
/ mL (Tabla 3).
Tabla 3: Evolucin del crecimiento micelial (en cm) de P. expansum despus de la
transferencia de discos donde la inhibicin fue completa (2 L / mL) durante 7 das de
incubacin Los valores son medias (n = 3) desviaciones estndar.
Tambin se debe tener en cuenta que el efecto inhibidor de la fase de vapor del aceite
esencial de Salvia Officinalis en el micelio el crecimiento (Tabla 4) fue mayor que el efecto
inhibitorio ejercido durante la tcnica de PF (Tabla 2).
Tabla 4: Porcentaje de inhibicin del crecimiento micelial de B.cinerea, P. expansum y
R. stolonifer segn la cantidad de S.Officinalis aceite esencial.

Despus de que se haba establecido la inhibicin del crecimiento con aceite de S.Officinalis,
los discos miceliales se transfirieron a PDA. medio sin el aceite esencial. Los resultados para
ambas cepas de P. expansum y R. stolonifer se presentan en la Tabla 5.

Tabla 5: Evolucin del crecimiento micelial (en cm) despus de la transferencia de

discos donde la inhibicin se complet despus de 6 das de incubacin para
P.expansum y 48 h para R. stolonifer. Los valores son medias (n = 3) desviaciones
estndar.

A partir de estos resultados, no hay crecimiento de hongos P.expansum durante seis das a
concentraciones de 80 y 160 l / disco (MIQ = 80 L / disco), en el otro lado R. stolonifer, hay
un crecimiento micelial desde el primer da a una concentracin de 80 L / disco, luego no hay
crecimiento micelial se observ despus del tratamiento con aceite a una concentracin de
160 L / disco. Entonces S.Officinalis mostr actividad fungicida contra R. stolonifer a 160 L /
disco (MIQ = 160 L / disco) y fungisttico 80 L / disco.
DISCUSIN

De acuerdo con el anlisis GC / MS en este estudio, treinta y un compuestos, que representan

el 96,30% del aceite total, se identificado.Recientemente, se han generado intereses en el
desarrollo de aceites esenciales para controlar los fitopatgenos en comida y agricultura. Se
ha informado que la mayora de los aceites esenciales inhiben los hongos poscosecha en
condiciones in vitro [26- 31]. Varios investigadores han informado que los mono y
sesquiterpenos, como componentes principales de varios los aceites esenciales tienen un
enorme potencial para inhibir fuertemente el crecimiento de patgenos microbianos. El
antimictico La actividad de estos compuestos puede atribuirse a su interferencia con ciertas
reacciones enzimticas desarrolladas en el sntesis de la pared celular. De hecho, la
composicin qumica y las relaciones de actividad antifngica deducidas de nuestro estudio
demuestra que la actividad antifngica de Salvia Officinalis est probablemente relacionada
con el alto contenido contenido de -Thujone (22.2%) y 1,8-Cineole (18.4%). La importancia
de este compuesto fue demostrada por M.Marino y cols. Informaron que el 1,8-cineol podra
estar relacionado con la actividad antifngica [32]. Adems, de acuerdo con los resultados
obtenidos en este estudio, el mtodo VA en la volatilizacin discal tiene una mejor actividad
antifngica contra el patgenos probados que en la fase lquida observada en el ensayo PF.
Este resultado indica que las sustancias en el el mtodo de difusin de pozos fue menos
eficiente que el mtodo de volatilizacin de discos. La eficacia de los aceites esenciales en el
estado de vapor probablemente se debi a la deposicin directa de los aceites esenciales
sobre los micelios fngicos lipoflicos con un efecto indirecto por adsorcin a travs del medio
de agar [33]. Estos resultados estn de acuerdo con aquellos informado en la literatura [33,
34]. Los aceites esenciales son mezclas complejas de muchos componentes diferentes
aromticos con diversos grados de lipofilia e hidrofilicidad relativa dada por la presencia de
componentes con polaridad grupos funcionales [35]. Cuando se agrega a un medio, los
aceites esenciales se distribuyen ms o menos en la fase acuosa dependiendo de su
hidrofilicidad relativa Por lo tanto, un aceite esencial con constituyentes con baja solubilidad en
agua debera disolver poco en medio acuoso y, en consecuencia, mostrar una actividad dbil.
Estos aceites esenciales, sin embargo, mostr una actividad muy buena cuando fue evaluada
por VA y esto podra estar relacionado con su alta volatilidad [33]. Estas las observaciones
sugieren que las propiedades fsicas y qumicas (solubilidad y volatilidad) pueden tener un
efecto considerable sobre la actividad antimicrobiana in vitro [36]. Como se muestra en la tabla
2 y tabla 3, el porcentaje de produccin de esporas la inhibicin de P.expansum, era
visiblemente ms alta que la de otros hongos probados, esto se puede atribuir a una mayor
sensibilidad de P.expansum que los otros hongos al aceite esencial de Salvia Officinalis. Se
ha observado que esto es esencial el vapor de aceite utilizado en este estudio es ms efectivo
en la produccin de esporas que el crecimiento micelial. Este resultado podra reflejar los
efectos de los componentes voltiles producidos por el petrleo en el desarrollo y / o
percepcin / transduccin del micelio superficial de seales involucradas en el cambio de
desarrollo vegetativo a reproductivo [30]. Adems, la inhibicin parcial de la produccin de
esporas podra atribuirse a la destruccin del micelio o la inhibicin del crecimiento fngico
[37].
CONCLUSIN
En conclusin, estos resultados demuestran que el aceite esencial de Salvia officinalis es un
agente antifngico eficaz contra B.cinera y R. stolonifer, pero especialmente para
P.expansum. Este aceite esencial puede considerarse un potencial alternativa a los fungicidas
sintticos para la proteccin de las manzanas de hongos fitopatgenos y tambin puede
prevenir la deterioro de otros productos alimenticios durante el Almacenamiento, porque estos
tipos de aceites esenciales tienen un bajo nivel de mamferos toxicidad, son biodegradables y
no persisten en el medio ambiente. Evaluacin de la actividad antifngica de este Antes de
que pueda comercializarse, se requiere aceite esencial contra estos hongos fitopatgenos in
vivo.