UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

FACULTAD DE QUMICA Y BIOLOGA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGA
LABORATORIO DE BIOQUMICA

INFORME N4
ENZIMOLOGIA II:
DETERMINACIN DE LOS PARMETROS CINTICOS DE LA ENZIMA FOSFATASA
CIDA DE GRMEN DE TRIGO

CURSO : Bioqumica
INTEGRANTES : Daro Calbul
Mauricio Gutirrez
PROFESORA : Alejandra Saavedra
AYUDANTE : Catalina Rodrguez
SECCIN : L1
FECHA DE EXPERIENCIA : 20 de noviembre de 2017
FECHA DE ENTREGA : 27 de noviembre de 2017
 1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS
Las enzimas son catalizadores biolgicos de naturaleza proteica. Una determinada
enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un complejo enzima
sustrato (E-S), el cual se descompone para dar el producto (P) y la enzima libre (1).

Las reacciones enzimticas se caracterizan porque, aunque aumente la concentracin de

sustrato, la velocidad no aumenta linealmente, apareciendo un efecto de saturacin, el
que ocurre cuando todos los sitios activos de la enzima estn ocupados por sustrato.
Si se representa la velocidad de reaccin frente a la concentracin de sustrato se obtiene
una hiprbola rectangular cuya expresin matemtica se conoce como ecuacin de
Michaelis Menten (2).

La expresin matemtica viene dada segn:

Vmx [S]
V0 = (1.1)
K M + [S]

Donde:
V0 : Velocidad total.
Vmx : Velocidad mxima de reaccin.
KM : Constante de Michaelis Menten.
[S] : Concentracin de sustrato.

La ecuacin de Michaelis Menten puede linealizarse y graficarse por medio de los

dobles recprocos, llamado Lineweaver Burk (3):

1 KM 1
= + (1.2)
V0 Vmx [S] Vmx

En el prctico se determinarn estos parmetros para la enzima Fosfatasa cida de trigo,

sin inhibir y con inhibicin.

1
 2. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

2.1. Construccin Curva de Calibracin de p-nitrofenol

Se prepararon 6 tubos para la construccin de la curva de calibracin, los cuales

contenan:

Tabla 2.1: Volmenes de solucin para cada tubo

Tubo 1 2 3 4 5 6
p-NP 60 [mL] 0,0 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0
NaOH 0,5 M [mL] 4,0 3,5 2,0 2,0 1,0 0,0

Posteriormente, se homogeniz y ley la absorbancia de cada muestra a una longitud de

onda de 405 nm. Para finalizar, se graficaron los puntos obtenidos de absorbancia y
concentracin de p-nitrofenol, determinando la ecuacin de la recta.

2.2. Determinacin de parmetros cinticos de fosfatasa cida de germen de trigo y

efecto del fosfato en la reaccin

Se prepararon 10 tubos que contenan:

Tabla 2.2: Volmenes de solucin para cada tubo

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
p-NPP 2,5 mM [mL] 0,0 0,25 0,5 0,75 1,0 0,0 0,25 0,5 0,75 1,0
Buffer pH 5 [mL] 1,5 1,25 1,0 0,75 0,5 2,0 1,75 1,5 1,25 1,0
KH2PO4 10 mM [mL] 0,5 0,50 0,5 0,50 0,5 0,5 0,00 0,0 0,00 0,0

El set de tubos se incub a 37C por 5 minutos, para posteriormente agregar 0,5 [mL] de
enzima a cada uno y nuevamente incubar a la misma temperatura, pero por 10 minutos.
Una vez transcurrido el tiempo de incubacin, se agreg una alcuota de 0,5 [mL] a cada
tubo de NaOH 0,05 M preparado con anterioridad.

Finalmente, se midi la absorbancia de cada muestra a una longitud de onda de 405 nm.

2
 3. RESULTADOS

3.1. Curva de Calibracin

Tabla 3.1: Concentracin de p-nitrofenol en solucin y su absorbancia a 405 nm
Tubo Concentracin pNP [M] Absorbancia
1 0,0000 0
2 6 0,1540
7,50 10
3 5 0,3580
1,50 10
4 5 0,5600
3,00 10
5 5 0,7880
4,50 10
6 5 0,9550
6,00 10

0,8
Absorbancia

0,6

0,4

0,2

0
0,0E+00 1,0E-05 2,0E-05 3,0E-05 4,0E-05 5,0E-05 6,0E-05
pNP [M]

Figura 3.1: Curva de Calibracin de p-nitrofenol

Tabla 3.2: Ajuste lineal para figura 3.1

Ecuacin A = 15791 C + 0,0547
2
Coeficiente r 0,9830

3.2. Parmetros Cinticos Fosfatasa cida de Germen de Trigo y efecto en la

reaccin
Tabla 3.3: Absorbancia a 405 nm de p-NPP en solucin y su concentracin
Absorbancia Concentracin [M]
0,000 0,00
0,102 2,99
0,330 1,74 101
0,342 1,82 101
0,418 2,30 101

3
 a) Presencia de Fosfato

8000
7000
6000
5000
1/[S] [1/mM]

4000
3000
2000
1000
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
1/Vo [min/umol)

Figura 3.2: Grfica de Linewever-Burk

Tabla 3.3: Ajuste lineal para figura 2.2

1 1
Ecuacin = 2,0313 + 601,78
V0 [S]
Coeficiente r2 0,9385

Gracias a la ecuacin obtenida en la tabla 3.2, es posible obtener:

Tabla 3.4: Parmetros Cinticos

Km [] Vmx [

]
4
2,8674 103 5,6590 10

4
 b) Ausencia de Fosfato

3500

3000
1/[S] [M-1] 2500

2000

1500

1000

500

0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
1/Vo [min/mol]

Figura 3.3: Grfica de Linewever-Burk

Tabla 3.5: Ajuste lineal para figura 2.3

1 1
Ecuacin = 0,5913 + 1210,8
V0 [S]
Coeficiente r2 0,9782

Gracias a la ecuacin obtenida en la tabla 3.5, es posible obtener:

Tabla 3.6: Parmetros Cinticos

Km [] Vmx [

]
4,8836 104 8,2590 10 4

5
 4. DISCUSIN
4.1. Parmetros en cinticos en presencia y ausencia de fosfato
Se observa en las tablas 3.4 y 3.6 que el parmetro cintico Vmx es mayor en ausencia
de fosfato. Podemos deducir a priori que la presencia de fosfato ayuda que se reduzca la
velocidad de reaccin. Por otra parte, la constante de Michaelis Menten es menor en
ausencia de fosfato, esto indica que existe una mayor afinidad de la enzima con el
sustrato y, por consiguiente, se esperara una mayor velocidad de reaccin, lo que se
corrobora con las tablas 3.4 y 3.6, mencionadas anteriormente.
Desde el punto de vista de la saturacin, la constante de Michaelis Menten nos permite
deducir que existe una rpida saturacin en ausencia de fosfato, esto quiere decir que la
concentracin de sustrato para que la enzima presente una saturacin ser menor en
comparacin a la presencia de fosfato.
Si analizamos la inhibicin que presenta la enzima es competitiva, en el que el fosfato y
sustrato compiten por el sitio de unin enzimtico, lo que se ve contrarrestado solo si la
concentracin de sustrato aumenta. Si observamos las tablas 3.4 y 3.6 la velocidad
mxima no vara significativamente, mientras que la K M presenta variaciones notorias,
caractersticas propias de una inhibicin competitiva.

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 5. CONCLUSIN
5.1. En presencia de fosfato se obtiene un K M = 2,8674 103 [M] y un Vmx =
M
5,6590 104 [min], mientras que en ausencia de fosfato se obtiene un K M = 4,8836
M
104 [M] y un Vmx = 8,2590 104 [min].
5.2. Se observa que la presencia de fosfato inhibe la actividad enzimtica de la fosfatasa
cida. Se presenta una inhibicin del tipo competitiva, en el cual tanto el inhibidor
como el sustrato actan compitiendo por el sitio de unin activo de la enzima.

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 6. REFERENCIAS

(1) Cintica Enzimtica. Universidad de Pablo de Olavide. [Lnea].

<https://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/miembros/Web_Sofia/GRUPOS/Tema%20
7.pdf>. Visitado el da 25 de noviembre de 2017.

(2) Huerta, S. Reacciones enzimticas. Universidad Autnoma Metropolitana. [Lnea].

<http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/sho/Tema_1_Reacciones_Enzimaticas.pdf>.
Visitado el da 25 de noviembre de 2017.

(3) Rivera E. Cintica Enzimtica. Universidad Nacional Autnoma de Mxico. [Lnea].

<http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/CineticaEnzimatica-
EnriqueRivera_32548.pdf>. Visitado el da 25 de noviembre de 2017.