UNIVERSIDAD DE IXTLAHUACA CUI

Incorporada a la Universidad Autnoma del Estado de Mxico

LICENCIATURA EN QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA

CLAVE 091-Q

MICROBIOLOGA GENERAL

PROYECTO DE INVESTIGACIN:
CARACTERIZACIN Y DETERMINACIN DE LA ACCIN LIPSICA DE
Aspergillus niger

EQUIPOS 5, 6, 9, 10, 11 Y 12

QFB. 501

M. en. C. Gabriel Martnez Gonzlez

Noviembre 2017
 UNIVERSIDAD DE IXTLAHUACA CUI
Incorporada a la Universidad Autnoma del Estado de Mxico
LICENCIATURA EN QUMICA FARMACUTICA BIOLGICA
CLAVE: 091-Q
MICROBIOLOGA GENERAL

CARACTERIZACIN Y DETERMINACIN DE LA ACCIN LIPSICA DE

Aspergillus niger

Alarcn Gmez Kevin Amado, Bermdez Becerril Anai Mireya, Carmona Alcntara Karina,
Cejudo Gonzlez Joel Nicols, Coranguez Menchaca Zinnia Lisette, Delgado Arriaga Sonia,
Garca ngeles Berenice, Garca Jaramillo Daniel Alejandro, Gil Gmez Arely, Gonzlez
Atilano Jovita, Nieto Rodrguez Lizet, Rojas Becerril Abraham, Salgado Daz Karen.

RESUMEN
Las lipasas son de importancia biolgica como catalizadores de algunas reacciones, as
como la degradacin de lpidos. Con ayuda de este proyecto se pretende utilizar materia
orgnica en descomposicin para la produccin de lipasas. Estas enzimas pueden tener un
impacto en el manejo de residuos industriales y el cuidado del medio ambiente, en la
obtencin de productos con valor agregado o como herramienta para generar nuevas
fuentes de energa. El proceso se basa en aislar una cepa de Aspergillus niger, despus
ser crecido en un medio rico en nutrientes para posteriormente extraer las enzimas de
inters. El aislamiento se llev a cabo de muestras de vegetales contaminadas (jitomate y
tomate) para ser resembrados, usando tambin una cepa tipo de Aspergillus niger. Se
realiz un microcultivo de cada una de las muestras vegetales contaminadas y con ayuda
de una tincin de azul de lactofenol poder identificar Aspergillus niger. Para hacer la
extraccin de lipasas se hizo uso de caldo papa dextrosa. Posterior a ello se inmovilizaron
las esporas del hongo Aspergillus niger gracias a la reaccin de alginato de sodio con CaCl2.
Las bolitas formadas de alginato de calcio se transfirieron al caldo, y se agreg sulfato de
amonio como fuente de Nitrgeno y Aceite de oliva como fuente de Carbono, se llevaron a
agitacin constante para activar su metabolismo y, de esta forma, promover la produccin
de lipasas.
Los resultados obtenidos fueron negativos, ya que no hubo presencia de lipasas despus
de hacer las pruebas con aceite de naranja y ajonjol. Por lo tanto, el mtodo de extraccin
no fue el adecuado para la obtencin de lipasas, por los factores externos que pudieron
influir al momento de la experimentacin.

1
ABSTRACT
Lipases are of biological importance as catalysts of some reactions as well as the
degradation of lipids. With the help of this project, the intention is to use decomposing
organic matter for the production of lipases. These enzymes can have an impact on the
management of industrial waste and the care of the environment, in obtaining products
with added value or as a tool to generate new sources of energy. The process is based
on isolating a strain of Aspergillus niger, after being grown in a nutrient rich medium to
later extract the enzymes of interest. The isolation was carried out of samples of
contaminated vegetables (tomato and tomato) to be reseeded, also using a type strain
of Aspergillus niger. A micro-culture of each of the contaminated plant samples was
carried out and with the help of a lactophenol blue stain, we could identify Aspergillus
niger. To make the lipase extraction, potato dextrose broth was used. After that the
spores of the fungus Aspergillus niger were immobilized thanks to the reaction of sodium
alginate with CaCl2. The pellets formed of calcium alginate were transferred to the broth,
and ammonium sulfate was added as a source of Nitrogen and Olive oil as a source of
Carbon, they were taken to constant agitation to activate their metabolism and, in this
way, promote the production of lipases.
The results obtained were negative, since there was no presence of lipases after doing
the tests with orange oil and ajonjol. Therefore, the extraction method was not adequate
for obtaining lipases, due to external factors that could influence the moment of
experimentation.
PALABRAS CLAVE: Aspergillus niger, hongo, lipasas, enzima, catalizador,
degradacin, lpidos, esporas.

MARCO TERICO
Aspergillus niger
Caractersticas generales
Es un hongo filamentoso hialino, saprofito, perteneciente al filo Ascomycota. Se
encuentra formado por hifas hialinas septadas y puede tener reproduccin
sexual (con formacin de ascosporas en el interior de ascas) y asexual (con
formacin de conidios)
Aspergillus es uno de los principales hongos productores de micotoxinas. Las
micotoxinas son metabolitos secundarios producidos y secretados por el hongo
durante el proceso de degradacin de la materia orgnica, como mecanismo de
defensa frente a otros microorganismos
Reservorio: Suelo, vegetales (en descomposicin).
Hospedadores: Humanos, bovinos, equinos, aves, cetceos.
Dosis infectiva mnima (DIM): Se desconoce en la actualidad.
Supervivencia ambiental: Crece en cualquier tipo de sustrato,
especialmente en suelos y materiales en descomposicin.
Es un contaminante habitual de los conductos de climatizacin-
ventilacin.
Es termotolerante, puede vivir entre los 12C y los 57C.
Formas de resistencia: Las esporas pueden sobrevivir a 70C

2
Aspergillus niger dentro del gnero Aspergillus, descubierto inicialmente por el
bilogo italiano Pier Antonio Micheli; existen cientos de especies cuyo hbitat
natural son el heno y el compostaje. Aspergillus niger es el hongo filamentoso
que produce un moho negro en varios vegetales, muy comn en la lechuga, el
tomate o la acelga y limn
La produccin industrial principal del Aspergillus niger est enfocada a la
conservacin de alimentos. Debido a que es un agente de fermentacin, puede
someterse a un proceso qumico que lo hace un polvo que se usa en la
conservacin de alimentos. Al igual que el jugo de limn o de lima pueden evitar
que una manzana o un aguacate se oscurezcan en presencia del oxgeno, el
Aspergillus niger, que se encuentra en el jugo ctrico, puede ayudar a preservar
la comida embotellada y enlatada.
Pruebas de laboratorio demostraron que podra emplearse el Aspergillus niger
como fertilizante biolgico en huertas y plantaciones de tamao relativamente
reducido. Adems, actualmente se investiga si el hongo puede solubilizar
tambin compuestos de hierro, otro importante micronutriente vegetal.
Hasta antes del hallazgo de los investigadores de la UNLP, a los Aspergillus se
los consideraba peligrosos. Esto se debe a que se trata de un hongo
ampliamente difundido en la naturaleza, que se desarrolla en vegetales en
descomposicin, granos de cereal, heno, tejidos de algodn y lana y en plumas,
siendo su medio ideal los ambientes oscuros, hmedos y cerrados.
Las esporas pueden sobrevivir, en las condiciones adecuadas, durante miles de
aos. Estudios recientes demostraron que las esporas de Aspergillus mantienen
intacta su capacidad invasiva.
Lipasas
Los lpidos son biomolculas orgnicas ampliamente distribuidas en la biomasa
de la tierra, siendo las enzimas denominadas lipolticas o lipasas las encargadas
de la degradacin de estas molculas insolubles en agua. Las lipasas se han
estudiado desde hace ms de 300 aos, sin embargo, su capacidad para
catalizar la hidrlisis y sintetizar steres ha sido reconocido apenas hace 70
aos. Este tipo de enzimas revisten de gran importancia en la industria por sus
mltiples aplicaciones debido a que llevan a cabo la degradacin de sustratos
con alto contenido graso, as como en reacciones de esterificacin en la industria
alimenticia, farmacutica y cosmtica. Las lipasas han sido encontradas en
muchas especies de animales, plantas y microorganismos. Sin embargo, las
lipasas microbianas son mucho ms verstiles y presentan caractersticas
interesantes como estabilidad en solventes orgnicos, actividad bajo diversas
condiciones, alta especificidad de sustrato, as como regio y enantio selectividad.
Las lipasas son sintetizadas por los microrganismos preferencialmente en
presencia de inductores como son los lpidos. Estas molculas y otras sustancias
presentes en los residuos agroindustriales permiten el crecimiento de los
microorganismos y actan como sustancias inductoras para la produccin de
lipasas microbianas. Se ha demostrado que los aceites naturales como el aceite
de soya, los cidos y steres grasos como los jabones, los esteroles como el
colesterol, las sales biliares y detergentes se comportan como inductores y por
ello son ampliamente utilizados para la produccin de lipasas microbianas.

3
Se ha encontrado que los niveles de produccin de lipasas microbianas varan
significativamente entre las diferentes especies de microorganismos, por ello es
indispensable la presencia de una fuente de carbono de naturaleza lipdica.
Aplicaciones biotecnolgicas de las lipasas
Las lipasas microbianas constituyen uno de los grupos ms importantes de
biocatlisis por sus amplias e importantes aplicaciones en la industria
alimentaria, como la produccin de grasas con propiedades fsicas y qumicas
deseables, adems de contener una baja proporcin de grasas trans en el
producto final. Estas enzimas catalizan una amplia variedad de reacciones como
la hidrlisis parcial o total de triacilglicridos y reacciones de esterificacin,
transesterificacin e interesterificacin de los lpidos en medios no acuosos.
El inters en la produccin de las lipasas radica en aplicaciones como aditivos
alimentarios en la modificacin del sabor, sntesis de steres con una importante
actividad antioxidante, hidrlisis de grasas para la fabricacin de detergentes,
tratamiento de aguas residuales especficamente en la degradacin y remocin
de sustratos grasos (aceitosos), eliminacin de lpidos y aceites en la industria
cosmtica y farmacutica, as como en el tratamiento de los cueros en la
industria marroquinera. Por ello, la investigacin se ha enfocado en la bsqueda
y utilizacin de diferentes microrganismos y sustratos que permitan obtener a
escala industrial estas enzimas utilizando condiciones de operacin que faciliten
la reduccin de los costos de produccin y se convierta en un proceso
biotecnolgico econmicamente viable. Lo anterior puede lograrse con el empleo
de sustratos econmicos considerados como un desecho como son los residuos
agroindustriales.
Microorganismos productores de Lipasas
Los microorganismos con un alto potencial para producir lipasas pueden ser
encontrados en diferentes hbitats, principalmente en desechos o residuos de
aceites vegetales empleados en la elaboracin de frituras, industrias de
productos lcteos, suelos contaminados con aceites y alimentos deteriorados. A
partir de stos nichos se han aislado bacterias, hongos filamentosos, levaduras
y actinomycetos, entre los que sobresalen los gneros Pseudomonas, Bacillus,
Rhodococcus, Staphylococcus, Rhizopus, Mucor, Candida, Aspergillus y
Geotrichum spp. por su capacidad para producir lipasas extracelulares,
facilitando de esta manera, la recuperacin de estas enzimas a partir del medio
de cultivo. Asimismo, se ha evaluado diferentes especies de los mohos como
Aspergillus y Penicillium para la produccin de lipasas extracelulares en medios
de cultivo slidos y lquidos utilizando como agente inductor aceite de oliva.
Caractersticas Generales de las Lipasas.
Las lipasas son catalizadores verstiles que se aplican dentro de un amplio rango
de bioconversiones tales como hidrlisis, interesterificacin, esterificacin,
alcohlisis, acidlisis y aminlisis como se muestra en la figura 1.

4
 Fig. 1 Accin tpica de las lipasas hidrolizando un triglicrido.

Son de naturaleza anfiflica, es decir, que se caracterizan por la presencia de

una parte tanto hidroflica como hidrofbica en sus molculas (figura 2)
(Cifuentes y Rojas, 2005); actuando en la naturaleza en una interfase orgnico-
acuosa como en la figura 3 (Verger et al., 1990; Jaeger et al., 1994; Cifuentes,
2005) y su modelo cintico normalmente no se ajusta a las cinticas del tipo
Michaelis-Menten siendo generalmente ms complejo.

Fig. 2. Lipasa de naturaleza anfifilica.

Fig. 3 Migracin de la lipasa a la interfase.

Los sustratos propios de las lipasas son steres insolubles, necesitando la lipasa
de una interfase orgnico-acuosa para su activacin; esta actividad normalmente
se produce en un fenmeno de adsorcin inicial sobre dicha fase, al que sigue
la reaccin propiamente dicha sobre la interfase, con la formacin de complejo
enzima-sustrato y posterior liberacin de los productos a la fase acuosa con la
posterior regeneracin de la enzima (Verger et al., 1990; Jaeger et al., 1994).
Especificidad y Selectividad.
Las lipasas han sido definidas como enzimas especficas para catalizar la
separacin hidroltica de los cidos grasos de cadena larga presentes en los
acilgliceroles (Snellman y col., 2002), los cuales son sus sustratos naturales, muy
pocas lipasas son especficas en sus reacciones. Por este motivo, el trmino
especificidad se ha ido reemplazando en la literatura por el de selectividad, el
cual describe mucho mejor el comportamiento reactivo de estas hidrolasas
(Gonzlez y col., 2010). La especificidad de las lipasas est directamente
relacionada con el microorganismo productor de las mismas (Snchez, 1998).
Por lo que refiere a las lipasas pueden ser de los tipos:

5
Posicional
Cuando se hidrolizan preferentemente ciertas posiciones del triglicrido,
normalmente las posiciones 1 y 3 que son las ms accesibles, por ejemplo,
pertenecen a este tipo las lipasas producidas por Yarrowia lipolytica, Candida
deformans, Aspergillus niger, Rhizopus arrhizus, Rhizopus japonicus y Rhizopus
delemar (Alarcn, 2008).
De cido graso
Cuando se cataliza la hidrlisis de un determinado tipo de cido en particular de
un triglicrido. Ejemplos de este tipo son las lipasas de Penicillium ciclopium,
Aspergillus niger, Rhizopus delemar, y Geotrichum candidum (Alarcn, 2008).
Hidrlisis del enlace ster del sustrato
La hidrlisis sucede mediante un mecanismo similar al de las serin-proteasas
con los siguientes pasos y mostrados en la figura 4 (Arroyo, 1995):

Fig. 4 Mecanismo para la hidrlisis de enlaces steres por parte de lipasas a partir del
mecanismo re reaccin serina proteasas.

Produccin de lipasas en diversos sustratos. Caracterizacin de las lipasas

de Aspergillus niger
Las lipasas o ms sistemticamente llamadas triacilglicerol acilhidrolasas son
enzimas que hidrolizan triglicridos y en ciertas condiciones catalizan la reaccin
inversa. Debido a su especificidad y a la gran variedad de sustratos que aceptan,
se han convertido en catalizadores de gran inters para diversas industrias.
Para la seleccin de microorganismos productores de lipasas se deben de usar
diversas cepas de bacterias, levaduras y hongos, los cuales deben de ser
desarrollados en un medio salino con sulfato de amonio al 1% y aceite de oliva
al 2% como fuentes de nitrgeno y carbono respectivamente. Tambin se
pueden emplear otro tipo de sustratos como fuentes de carbono y que sean un
poco ms baratos.

6
Un dato muy importante es que los hongos son los mejores microorganismos
productores de lipasas, alcanzando niveles de actividad lipsica entre 0.05-0.26
UI/ml como ejemplos claros tenemos A. niger, donde podemos comprobar que
las enzimas son inductivas y su produccin se encuentra asociada al crecimiento
microbiano, tanto el glicerol como los azcares que podemos llegar a emplear
inhiben la produccin de actividad lipoltica, sin embargo, los sustratos lipdicos
la estimulan de forma satisfactoria.
Medios de cultivo
Agar Papa Dextrosa PDA
El Agar Papa Dextrosa (Potato Dextrose Agar, PDA, por sus siglas en ingls) es
un medio de propsito general para levaduras y mohos que puede ser
suplementado con cidos o antibiticos para inhibir el crecimiento bacteriano. El
Agar Papa Dextrosa (PDA) puede ser usado para el cultivo de levaduras y mohos
clnicamente significativos. La base (infusin de papa) nutricionalmente rica,
estimula la esporulacin de los mohos y la produccin de pigmentos en algunos
dermatofitos.
Fundamento
El Agar Papa Dextrosa est compuesto por Infusin de Papa deshidratada y
Dextrosa que fomentan el crecimiento exuberante de los hongos. El agar es
adicionado como agente solidificante. Muchos procedimientos estndares usan
una cantidad especfica de cido tartrico estril (10%) para reducir el pH de este
medio a 3,5 0.1, y as inhibir el crecimiento bacteriano. No recalentar el medio
acidificado, el calentamiento en estado cido hidrolizar el agar.
Apariencia del Deshidratado
Polvo suelto, homogneo, de color beige claro.
Apariencia del Preparado
El medio preparado presenta una apariencia de trazas de niebla a levemente
nublado, y de color plido a amarillo claro.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Infusin de papa a 4g Suspender 39 g del medio de cultivo
partir de 200 g en un litro de agua purificada.
Dextrosa 20 g Calentar agitando frecuentemente y
Agar 15.0 permita que hierva por un minuto
para disolver completamente el
medio. Autoclave a 121C durante
15 minutos.
pH final: 5.6 2
Cuadro 1. Constitucin del medio PDA

Resultados
Las levaduras crecern como colonias desde un color crema a un color blanco.
Los mohos crecern como colonias filamentosas de variados colores.
Microorganismo Respuesta
Aspergillus niger Crecimiento

7
 Candida albicans Crecimiento
Penicillium roqueforti Crecimiento
Trichophyton Crecimiento
mentagrophytes
Cuadro 2. Respuesta Esperada del Cultivo y Pruebas Promotoras de Crecimiento

Sabouraud Glucosado Agar SDA

Medio utilizado para el aislamiento, identificacin y observacin de hongos patgenos y
saprfitos. Tambin es til para el cultivo de levaduras.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Pluripeptona 10.0 Suspender 65 g del polvo por litro de agua
Glucosa 40.0 destilada. Reposar 5 minutos y mezclar
Cloranfenicol 0.05 hasta uniformar. Calentar agitando
frecuentemente y hervir 1 minuto hasta
Agar 15.0 disolver. Distribuir y esterilizar 15 minutos a
118-121C. Mantener en lugar fresco.
pH final: 5.6 2
Cuadro 3. Constitucin del medio Agar Glucosa Sabouraud.

Fundamento
Medio de cultivo recomendado para el aislamiento y desarrollo de hongos,
particularmente los asociados con infecciones cutneas (piel, pelo, etc.).
En el medio de cultivo, la pluripeptona y la glucosa, son los nutrientes para el
desarrollo de microorganismos. El alto contenido de glucosa, la presencia de
cloranfenicol y el pH cido, favorecen el crecimiento de hongos por sobre el de
bacterias.
Adems, al medio de cultivo, pueden agregarse otros agentes selectivos de
crecimiento.
Siembra
Depende del uso, puede ser tanto en tubo como en placa. Consultar referencias
de mtodos recomendados.
Incubacin
El tiempo de incubacin depender del microorganismo que se est buscando
aislar.
Resultados
Microorganismos Crecimiento
Saccharomyces cerevisiae Bueno
Aspergillus niger Bueno
Candida albicans ATCC 10231 Bueno
Cuadro 4. Microorganismos que presentan crecimiento satisfactorio en el medio.

Caractersticas del medio

Medio preparado: mbar claro, ligeramente opalescente sin ningn precipitado.
Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 C

8
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Debido a que los hongos que pertenecen al gnero Aspergillus spp,
principalmente Aspergillus niger, son los principales productores de lipasas, es
posible llevar a cabo la extraccin de estas enzimas, las cuales son catalizadores
biolgicos encargadas de la degradacin de lpidos, y que adems pueden ser
usadas como detergentes o ser empleadas en la purificacin de aguas
contaminadas y destruccin de biofilm, destacando as la importancia que tiene
su estudio y obtencin.
JUSTIFICACIN
La presente investigacin ha sido enfocada a la bsqueda y aislamiento de un
microorganismo productor de lipasas, lo cual es posible gracias a la activacin
metablica del hongo Aspergillus niger.
El motivo por el cual se decidi utilizar Aspergillus niger para la produccin de
lipasas, es bsicamente, su facilidad para cultivarlo, ya que, es un hongo que
produce moho negro en vegetales, y su presencia es muy comn en la lechuga,
el jitomate, cebolla y limn.
Las lipasas microbianas son mucho ms verstiles y presentan caractersticas
interesantes como estabilidad en solventes orgnicos, actividad bajo diversas
condiciones, alta especificidad de sustrato. Las caractersticas de esta enzima
han ayudado a que se le d un mejor aprovechamiento y aplicacin a distintos
campos para la generacin de nuevos productos o en su defecto, para mejorarlos
o, por consiguiente optimizar su produccin.
Aspergillus niger es un hongo que ha mostrado ser una alternativa potencial en
diferentes estudios, la mejora en el proceso fermentativo, as como la extraccin
de la enzima podra elevar los niveles de productividad de lipasas
considerablemente, con lo que se puede satisfacer una mayor demanda. El
potencial de esta enzima puede tener un impacto en el manejo de residuos
industriales y el cuidado del medio ambiente, en la obtencin de productos con
valor agregado o como herramienta para generar nuevas fuentes de energa.
HIPTESIS
Las lipasas producidas a partir de Aspergillus niger, bajo condiciones ptimas de
crecimiento, sern capaces de obtenerse de manera pura, comprobando as su
efectividad y actividad metablica.
MATERIALES Y MTODOS
Aislamiento de Aspergillus niger
El aislamiento del microorganismo se llev a cabo bajo los siguientes pasos:
Se tom un inculo con ayuda de un asa micolgica, a partir de diferentes
muestras (cebolla, tomate y jitomate) el hongo que se encuentra visible en la
superficie de los vegetales mencionados, en estado de descomposicin. Se
sembraron las muestras por duplicado en cajas con Agar Dextrosa Sabouraud
(SDA) y se incubaron a 37C por 96 hrs.
Transcurrido el tiempo de incubacin, se revis el crecimiento y la morfologa del
hongo inoculado a partir de las diferentes muestras.

9
Posteriormente, se seleccionaron dos cajas inoculadas, las cuales presentaron
un tipo de hongo con una morfologa ms uniforme e identificable, las cuales
correspondieron a la muestra tomada a partir de jitomate en descomposicin.
Se transfiri una asada del hongo obtenido en las cajas seleccionadas a tubos
con agar SDA, para su resguardo y posterior caracterizacin.
Tambin se sembr por triplicado en tubos con agar SDA una cepa pura de
Aspergillus niger.
Caracterizacin de Aspergillus Niger: Tincin de Azul Algodn de
Lactofenol
Se llev a cabo la realizacin de microcultivos para la caracterizacin de los
hongos obtenidos a partir de los vegetales en descomposicin seleccionados.
Se incubaron a 28C por 48 h. Incluyendo microcultivos a partir de la cepa pura
de Aspergillus niger, como referencia.
Despus de transcurrido el tiempo de incubacin, se realiz la tincin
correspondiente con azul de algodn de lactofenol.
Se observaron las diferentes laminillas al microscopio (40X) para la
caracterizacin de los hongos obtenidos.
Preparacin del Caldo Papa Dextrosa para la produccin de lipasas
Para la preparacin del Caldo Papa Dextrosa, se extrajo el caldo producido a
partir de la coccin de papas en agua destilada, se adicion sulfato de amonio
1% como fuente de nitrgeno, dextrosa, y se esteriliz. Despus, se adicion
aceite de oliva 2% estril como fuente de carbono.
Inmovilizacin de esporas con alginato de calcio y produccin de lipasas
Para la inmovilizacin de esporas con alginato de calcio inicialmente se prepar
una solucin de esporas a partir de una cepa aislada del microorganismo
Aspergillus niger. Las esporas fueron mezcladas con solucin salina estril.
Una vez obtenida la solucin de esporas se prepar una solucin de alginato de
sodio, la cual fue esterilizada en autoclave a 1 atm durante 15 minutos, se
mezclaron las esporas con la solucin de alginato y se coloc la solucin
obtenida en una jeringa estril.
Con ayuda de la jeringa se formaron gotas de alginato, las cuales al caer sobre
una solucin de CaCl2 0.1 M gelificaron como alginato de calcio.
Una vez obtenidas las bolitas de alginato, estas se lavaron con solucin
fisiolgica estril, se filtraron por decantacin y fueron transferidas a los medios
de cultivo lquidos, previamente preparados.
Por ltimo, se colocaron los diferentes matraces con el medio de cultivo en
agitacin constante por un periodo de tiempo aproximado de 4 das para la
produccin de lipasas. Al tercer da de agitacin, se sembr un inoculo de los
caldos lquidos, en agar SDA para comprobar que aun estuviese presente el
Aspergillus niger en el medio.

10
Extraccin y caracterizacin de las lipasas obtenidas a partir de Aspergillus
niger
Luego de llevarse a cabo la produccin de lipasas en el caldo, se procedi a
extraerlas mediante decantacin.
Se colocaron 12 mL del caldo extrado en tubos Falcon, se centrifugaron a 4000
rpm por 10 min y se filtraron al vaco.
Posteriormente, se adicionaron 10 mL del filtrado en dos tubos Falcon a los
cuales se les adicion sulfato de amonio para la obtencin del precipitado y
recuperacin de las lipasas.
Para la caracterizacin, se comenz por realizar una prueba de velocidad de
liberacin de cidos grasos mediante la disminucin de pH. De igual manera, se
llev a cabo otra prueba colocando en tubos de ensaye agua, las lipasas
obtenidas (y en otro tubo se coloc detergente en lugar de stas), y aceite
esencial de naranja (tambin se utiliz aceite de ajonjol); se agit vigorosamente
la mezcla y se observ la accin caracterstica de las lipasas en comparacin
con la accin del detergente y el control negativo (agua con aceite).
RESULTADOS Y DISCUSIN
Aislamiento de Aspergillus niger
El aislamiento se realiz a partir de tres muestras distintas, las cuales
correspondieron a cebolla, jitomate y tomate, vegetales en los cuales ha sido
demostrado tener un buen desarrollo una vez que estos comienzan su proceso
de descomposicin.
Las muestras se seleccionaron ya que las caractersticas macroscpicas
observadas en las mismas correspondan con el desarrollo caracterstico del
hongo, la inoculacin de las muestras se realiz en placas de agar SDA, las
cuales se dejaron en incubacin a 28C por 72h.
Una vez terminado el periodo de incubacin se procedi a realizar las
observaciones correspondientes, en las cuales, de acuerdo a las caractersticas
macroscpicas se identific al hongo Penicillium spp. y crecimiento negativo
para Aspergillus niger.
El hongo correspondiente a la muestra de cebolla present las siguientes
caractersticas: colonias vellosas, aterciopeladas, azul-verdosas con un
crecimiento pobre. El reverso se observ amarillento-cremoso.

Fig. 5 Crecimiento de hongos a partir de muestras de tomate

11
Las caractersticas descritas corresponden con la morfologa macroscpica de
Penicillium chrysogenum, como se muestra a continuacin:

Fig. 6 P. chrysogenum inoculado en el centro de un csped deStaphylococcus aureus

Los hongos de la muestra de tomate fueron los siguientes:

Fig. 7 Crecimiento de hongos a partir de muestras de tomate

Se observ una superficie aterciopelada, los colores caractersticos fueron verde

y azul verdoso respectivamente, acompaados de un borde blanco.
La parte trasera de las placas se observ de color crema plido a amarillo.
Dichas caractersticas corresponden al hongo Penicillium spp.

Fig. 8 Crecimiento de hongos a partir de muestras de tomate (Reverso)

En los inculos realizados a partir de jitomate se observ de la misma forma una

textura aterciopelada azul verdoso para una de las placas, mientras que para la
otra se observ contaminacin ya que hubo presencia de dos hongos, el hongo
ubicado en el centro de la placa Petri correspondi a Penicillium spp.

12
 Fig. 9 Hongos obtenidos a partir de la muestra de jitomate

Luego de analizar el crecimiento de los hongos en cada una de las placas, se

concluy que no se obtuvo el microorganismo esperado, es decir, Aspergillus
niger.
Una vez concluido el anlisis macroscpico en placas se realiz una resiembra
para el posterior anlisis del hongo a travs de microcultivo.
Resiembra y Microcultivos
Despus de haber sembrado las muestras orgnicas del jitomate, cebolla y
tomate, se obtuvieron diferentes hongos, pero no el que se deseaba aislar por lo
que se tuvo que resembrar, pero este se llev a cabo a partir de una cepa pura
de A. niger, la cual fue resembrada en tubos de SDA al mismo tiempo se
resembraron las muestras del jitomate (Hongo 1 y 2); esto para saber qu tipo
de hongo se haba obtenido.
Como se muestra en la Fig. 10, se logr resembrar la cepa de A. niger en 4 tubos
de agar SDA inoculados por picadura.

Fig 10. Resiembra de la cepa de A. niger

En la Fig. 11 y 12 se observan dos tubos de SDA en donde se inoculo por

picadura una pequea muestra del Hongo 1 y 2 de la muestra orgnica del
jitomate, con el fin de poder saber qu tipo de hongo se aisl y poder conocer
que hongo creci en estos alimentos. Esto se realiz en tubos de SDA para que
creciera el hongo especific e inhibiera otros que no se deseaba en este estudio.

13
 Fig 11 y 12. Resiembra del Hongo 1 y 2, procedentes de la muestra de Jitomate

El microcultivo es el procedimiento idneo para la identificacin de estructuras

fngicas, pues te permite visualizar al microscopio el micelio en su conjunto. Por
lo cual se realizaron los microcultivos, con el fin de observar la morfologa
microscpica y de esta forma poder determinar que hongo se aisl de las
muestras iniciales.

Fig 13, 14 y 15. De izquiera a derecha se muestran los microcultivos de A. niger, hongo 1 y
hongo 2 (correspondientes a la muestra de jitomate)

La tcnica consiste en colocar en el interior de una caja Petri estril, una varilla
de vidrio con forma de V estril y sobre ellas un portaobjetos. La varilla evita que
el portaobjetos tenga contacto con el fondo de la caja Petri. El fondo de la caja
Petri debe contener un pedazo de papel filtro al cual se le agrego Glicerol para
poder mantener un ambiente hmedo para el crecimiento.
El colorante azul de algodn desempe varias funciones, de acuerdo a sus
constituyentes, los cuales son:
Fenol: Inactiv las enzimas lticas de la clula e impidi que sta se
rompiera; de igual forma, destruy la flora acompaante e inactiv a la
clula, quitndole el grado de patogenicidad.
cido lctico: Preserv las estructuras fngicas al provocar un cambio de
gradiente osmtico con relacin al interior fngico, lo que gener una
pelcula protectora.
Azul de algodn: Es un colorante cido, que ti el citoplasma y la quitina
presente en las clulas fngicas.
Glicerol: Mantuvo la hmeda la preparacin
Cuando se observaron al microscopio los portaobjetos con las muestras se
observaron distintas morfologas, las cuales se muestran a continuacin:

14
 Fig. 16 Imagen al microscopio del Hongo

En la Fig. 16 se observ una estructura muy parecida al gnero Penicillium, la

estructura present conidiforos ramificados, los conidios observados tenan
forma ovoide; la estructura en general (conidiforos y conidios) se asemejaba a
un pincel.
Penicillium spp. es un hongo que se clasifica en el Reino Fung, este gnero
tiene ms de 300 especies, pero para poder identificar que especie es necesario
realizar ms pruebas, por lo cual solo se identific el gnero del hongo, el cual
caractersticamente hablando cuenta con una forma reproductiva asexual, como
son los conidiforos y estos crecen formando un denso cepillo como cojinete, lo
cual corresponde con lo observado.
Tambin otra caracterstica que lo diferencia de A. niger es que los penicilios
generan conidios, los cuales son un tipo de esporas caracterizadas por formarse
directamente en la hifa, adems tambin se puede percibir una coloracin verde-
azulada de las esporas lo cual tambin es una caracterstica de este tipo de
hongo. Al final se puedo observar las estructuras de los hongos que se aislaron
a partir de las muestras orgnicas del jitomate.
La Fig. 17 corresponde morfolgicamente a Aspergillus, se observ una vescula
de forma subclavada, color amarillo, seguida de conidios azules, las hifas se
observaron ligeramente septadas con conidiforos de paredes lisas.

Fig. 17 Hongo Aspergillus.

15
La Fig. 18 tambin corresponde a una muestra de Aspergillus niger ya que se
encontraron hifas tabiculares y conidiforos cuya cabeza se localiz en el
extremo de la hifa.
La identificacin de Aspergillus niger en esta imagen se realiz comparando el
resultado con lo reportado en bibliografa. Se presentaron esporas al extremo de
este hongo cultivado.

Fig. 18 Muestra de Aspergillus niger

Inmovilizacin de esporas
Se logr inmovilizar a las esporas del hongo Aspergillus niger gracias a la
reaccin del alginato de sodio con CaCl2. Esto debido a que al mezclar la solucin
de alginato de sodio con la suspensin de esporas y tras gotearla sobre una
solucin de CaCl2 0.1M, las esporas quedaron atrapadas en el alginato de calcio,
una vez que las esporas se colocan en un medio de cultivo favorable estas tienen
la capacidad de germinar.

Fig.19 Esporas inmovilizadas (previo y posterior a la filtracin)

Transferencia al medio de cultivo

El medio de cultivo elegido fue preparado a partir de papa como base del mismo,
ya que esta es altamente nutritiva y tiene la caracterstica de permitir la
esporulacin de hongos, promoviendo altamente su crecimiento.
El sulfato de amonio se utiliz como medio salino y a su vez como fuente de
nitrgeno, mientras que el aceite de oliva fue la fuente de carbono para el hongo.
Al colocarse las bolitas de alginato en el caldo de cultivo este tuvo la funcin de
aportar los nutrientes antes mencionados a A. niger, los matraces se llevaron a
agitacin constante por un periodo de tres das con el fin de activar su
metabolismo y, de esta forma, promover la produccin de lipasas.

16
En este caso, debido al tipo de agitacin a la cual se mantuvo no fue posible
controlar factores como la temperatura.

Fig. 20 Medios de cultivo con las esporas inmovilizadas

Comprobacin de presencia de Aspergillus niger

Un punto importante fue asegurarnos de que los medios designados para la
produccin de lipasas no se contaminaran, por lo cual para la comprobacin se
tom un inculo de cada uno de los caldos y se sembr en agar SDA, las placas
se mantuvieron en incubacin a 28C por un periodo de 72h.
De acuerdo a lo observado, en ningn matraz se registr contaminacin.

Fig. 21 Comprobacin de presencia de Aspergillus niger en los medios de cultivo, en la ltima

placa se encuentra el control negativo.

Recuperacin de las lipasas

Una vez comprobada la presencia de A. niger y la ausencia de contaminacin en
los matraces que contenan el caldo de cultivo, se continuo con el procedimiento.
Con el fin de separar las microesferas de esporas y alginato de calcio del Caldo
Papa Dextrosa, se realiz una filtracin por decantacin.
Una vez filtrado, inicialmente se realiz un filtrado con la ayuda de acrodiscos de
0.45 micras, con el fin de la retencin de las esporas presentes de A. niger, sin
embargo, la gran cantidad de residuos de papa que aparentemente no fue
posible percibir saturaron el disco, por lo que este proceso fue muy lento, para
evitar esto se utiliz el lquido aun sin filtrar con el objetivo de precipitar todos los
posibles residuos de papa contenidos en el caldo, la centrifugacin fue llevada a
cabo a 4000 rpm durante 10 minutos.
Una vez que los residuos de papa fueron separados del caldo, se agregaron
10mL de una de las muestras filtradas (del matraz 1.2) en 2 tubos Falcon, a los
cuales se les agreg sulfato de amonio con el fin de precipitar las lipasas, ya que

17
ha quedado comprobado que la recuperacin de actividad lipoltica es ms alta,
respecto a precipitaciones con solventes orgnicos. Las condiciones ptimas de
separacin se consideran en un 60% de saturacin de sulfato de amonio, en el
cual se produce una recuperacin superior al 70% con respecto a la actividad
lipoltica (Harris y Angal, 1989).
Finalmente, las muestras se centrifugaron por 10 min a 4000 rpm para la
precipitacin de lipasas.

Fig 22. Centrifugacin de los caldo, en la parte inferior se observa el precipitado.

Prueba confirmativa de presencia de lipasas

Para confirmar la presencia de lipasas se realiz primero el anlisis de la
velocidad de liberacin de cidos grasos en el medio, esto se demuestra
mediante la disminucin del pH.
Para esto se usaron dos tubos de ensaye, los cuales contenan 5 gotas de aceite
de oliva y una cantidad de agua, a los cuales se les midi el pH.
Una vez medido este pH inicial se le agrego las lipasas y un control negativo
respectivamente a cada tubo.
Tubo pH inicial pH final
Tubo con lipasas 7.24 5.14
Tubo con control negativo 7.85 5.84
Cuadro 5. Prueba de pH

Fig. 23 Medicin de pH del tubo con el control negativo.

18
 Fig. 24 Tubos con control negativo y tubo con lipasas en el cual se observaron pequeas
micelas en la parte superior

Se obtuvo un resultado negativo en esta prueba, el resultado esperado (resultado

positivo) debi ser la disminucin del pH nicamente en el tubo que contena las
lipasas. Esto debido a que las lipasas atacan a los lpidos (aceite) liberando
cidos grasos que acidifican el medio, por lo tanto, un descenso del pH nos indica
la presencia de este tipo de enzimas. Mientras que el que contena al control
negativo deba de conservar el pH que se midi inicialmente.
La segunda prueba que se realizo fue de acuerdo a la capacidad que tenan las
enzimas para mantener en suspensin agua con aceite.
Para esto se realiz dos veces la prueba con dos diferentes aceites; aceite
esencial de naranja y aceite de ajonjol.
En ambas pruebas se utilizaron 3 tubos, el primer tubo contena agua con aceite,
el cual se tomaba como el control negativo; el segundo tubo contena el control
positivo, lo cual era agua con aceite ms detergente; y el tercer tubo contena
aceite con agua y el producto obtenido que se crea contena lipasas.
Tubo con aceite Produccin de una
esencial de naranja emulsin
Control negativo Momentnea (-)
Control positivo Positiva (+)
Lipasas Momentnea (-)
Cuadro 6. Resultado de las pruebas utilizando aceite esencial de naranja
Tubo con aceite de Produccin de una
ajonjol emulsin
Control negativo Momentnea (-)
Control positivo Positiva (+)
Lipasas Momentnea (-)
Cuadro 7. Resultado de las pruebas utilizando aceite de ajonjol

El resultado de esta prueba tambin fue negativo debido a que el resultado

positivo que se esperaba es que la emulsin que pretenda obtener era similar a
la del detergente, la cual duraba por al menos 5 minutos, sin embargo, en ambos
aceites la emulsin se separaba en menos de un minuto de haberse agitado.

19
Debido a que solo se hicieron estas dos pruebas se determin que, como en
ambos casos se obtuvieron resultados negativos, no se obtuvieron las lipasas
que se pretendan obtener el hongo Aspergillus niger.

Fig. 25 El primer tubo contiene la emulsin del control positivo, el segundo contiene el control
negativo y el tercer tubo las lipasas, se puede observar una similitud entre el segundo y el
tercero.

El resultado obtenido puede atribuirse a diversos factores, principalmente, a la

agitacin y al control de temperatura, ya que para activar el metabolismo del
hongo estos debieron ser constantes, sin embargo, el tiempo de agitacin no fue
el adecuado y el medio estuvo expuesto a cambios de temperatura.
Tambin, se ha reportado en bibliografa que el almidn y la sacarosa reprimen
la sntesis de lipasas si no se cuenta con las condiciones adecuadas de
concentracin y pH, lo cual debi ser un factor importante a tomar en cuenta al
momento de realizar los procedimientos antes mencionados.
CONCLUSIONES
Las lipasas son enzimas extraordinariamente verstiles que hidrolizan
triglicridos a cidos grasos y glicerol, y bajo ciertas condiciones catalizan la
reaccin inversa. Algunas de estas enzimas son tambin capaces de catalizar
reacciones de transesterificacin e hidrlisis enantioselectivas. Estas enzimas
hidrolticas se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza y estn
presentes en los procesos metablicos degradativos de algunas plantas y
animales. Ellas son producidas por un gran nmero de microorganismos a partir
de los cuales se obtienen usualmente para fines comerciales, un ejemplo tpico
lo son las lipasas producidas por hongos como por ejemplo Aspergillus niger.
Aspergillus niger es un microorganismo de gran importancia a nivel industrial, ya
que, gracias al estudio de su metabolismo y la aplicacin de las condiciones
adecuadas, es posible obtener diversos productos, entre los ms producidos por
la industria se encuentran las lipasas y el cido ctrico.
Su extraccin a partir de las muestras utilizadas (tomate,cebolla y jitomate)
result en cierta forma algo complicado ya que no se obtuvo el crecimiento del
hongo (Aspergillus niger) en las placas Petri, esto debido a que las muestras

20
utilizadas siempre se encuentran en constante contacto con el medio ambiente,
y si bien es cierto que Aspergillus niger crece en estos productos, estos no estn
excentos de otros tipos de contaminaciones en las cuales hongos ms
resistentes pueden representar cierto grado de competencia con el hongo
buscado y, por lo tanto, desarrollarse en su lugar.
El uso de cultivos puros del microorganismo constituy una opcin viable al
momento de realizar el experimento, ya que, por los motivos antes mencionados
pudo ser difcil intentar aislar al hongo a menos de que las muestras iniciales
fueran cambiadas por otros posibles productos en los cuales se haya
demostrado el desarrollo de Aspergillus.
En base a los resultados obtenidos del proyecto Obtencin de lipasas a partir
del Asperlligus niger se concluye que no se obtuvo de manera exitosa la
produccin y extraccin de lipasas como se pretenda objetivamente, de manera
que es importante tomar en cuenta aquellos parmetros o factores que
intervinieron al momento de llevar a cabo el proceso. Este procedimiento se llev
acabo de manera satisfactoria ya que se observ el crecimiento del hongo
Asperlligus niger de acuerdo a las caractersticas macroscpicas y
microscpicas; esto con ayuda de los microcultivos as como con las tincin que
fueron realizadas y posteriormente observadas en el microscopio ptico de
campo claro.
En su totalidad el seguimiento del proyecto fue realizado correctamente, sin
embargo, en las pruebas para la identificacin de lipasas (confirmacin de
presencia de lipasas y la prueba siguiente capacidad que tenan las enzimas
para mantener en suspensin agua con aceite) no logramos obtener lo esperado
tericamente, lo cual pudo deberse a que el metabolismo del hongo no fue
activado por las condiciones a nivel de nutrientes en las cuales se encontraba y
por lo tanto, no fue posible obtener el producto buscado.

REFERENCIAS
Bibliografa: 1. [Internet]. 2017 [cited 20 September 2017]. Available from:
http://www.smbb.com.mx/congresos%20smbb/veracruz01/TRABAJOS/A
REA_II/CII-58.pdf
Bibliografa: 2. Sabouraud Glucosado Agar [Internet]. Britanialab.com.ar.
2017 [cited 20 September 2017]. Available from:
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/sabouraudgluagar.htm
Verger, R., Riviere, C., Moreau, H., Gargouri, Y., Rogalska, E., Nury, S.,
Moulin, A., Ferrato, F., Ransac, S., Carriere, F., Cudrey, M. and Tretout,
T.; 1990. Enzyme Kinetics of Lypolysis. In Lipases: Structure, Mechanism
and Genetic Engineering. Gbf Monographs, 16: 105-116.
Snellman, E. A., Sullivan, E. R., Colwell, R. R. 2002. Purification and
properties of the extracellular lipase, LipA, of Acinetobacter sp. RAG-1.
Eur J Biochem 269: 5771-9.
Gonzlez, J. M.; Enzimas. Departamento de Bioqumica y Biologa
Molecular. Universidad del Pas Vasco, 2010
Snchez A.; Recuperacin, Purificacin y Caracterizacin de Lipasas
Producidas por Candida rugosa. Aplicacin a la Resolucin de
Compuestos Quirales y Diseo del Reactor Enzimtico. Doctorado.

21
 Departamento de Ingeniera Qumica. Universidad Autnoma de
Barcelona, 1998.
Alarcn M.; Produccin de la Lipasa LIP2 de Candida rugosa en el
Sistema Pichia pastoris: Caracterizacin y Aplicacin en Reacciones de
Sntesis. Doctorado. Departamento de Ingeniera Qumica. Universidad
Autnoma de Barcelona, 2008.
Gandhi, N. N., 1997. Applications of Lipase. Jaocs, Journal of the
American Oil Chemists Society; Vol. 74, No. 6, pp 621-634.
Orrego CE; Estudio de la Influencia del Medio en la Reaccin de
Transesterificacin de Aceites con Etanol Catalizada por Lipasa de
Candida rugosa. Maestra en Ingeniera Qumica. Facultad de Ingeniera
y Arquitectura. Universidad Nacional de Colombia, 2010.
Arroyo, M.; Sntesis de cidos 2-ARIL-Propinicos Homoquirales
Mediante Esterificacin Enantioselectiva Catalizada por Lipasas
Inmovilizadas. Doctorado. Departamento de Qumica Orgnica y
Farmacutica, Facultad de Farmacia. Universidad Complutense, 1995.
Biorremediacin: organismos que limpian el ambiente [Internet]. 36th ed.
Buenos Aires: ArgenBio; 2017 [citado 19 de septiembre de 2017].
Disponible en: http://www.porquebiotecnologia.com.ar/index.php
Biorremediacin: organismos que limpian el ambiente. (2017). 36th ed.
[ebook] Buenos Aires: ArgenBio, pp.1, 2. 3, 4, 5. Disponible en:
http://www.porquebiotecnologia.com.ar/index.php [acceso 19 de
septiembre de 2017].
Tom Volk's Fungus. Penicillium chrysogenum [Internet] [actualizado en
noviembre de 2003, acceso 21 de noviembre de 2017] Disponible en:
http://botit.botany.wisc.edu/toms_fungi/nov2003.html
Revista Iberoamericana de Micologa. Penicillium chrysogenum. [Internet]
[actualizado 08 de septiembre de 2008, acceso 21 de noviembre de 2017]
Disponible en: http://hongos-
alergenicos.reviberoammicol.com/files/036.PDF
C.M. Visagie, J. Houbraken, J.C. Frisvad, S.-B. Hong, C.H.W. Klaassen,
G. Perrone, K.A. Seifert, J. Varga, T. Yaguchi, and R.A. Samson.
Identification and nomenclature of the genus Penicillium. Elsevier;
STUDIES IN MYCOLOGY, Sep 2014, 78: 343371
Carrillo L. Los hongos de los alimentos y forrajes: Penicillium [Internet]
[actualizado 07 de mayo de 2015, acceso 21 de noviembre de 2017]
Disponible en:
http://www.microbiota.com.ar/sites/default/files/5penicilios.pdf
Hardy Diagnostics. Penicillium. [Internet] [actualizado en noviembre de
2003, acceso 21 de noviembre de 2017] Disponible en:
https://catalog.hardydiagnostics.com/cp_prod/Content/hugo/Penicillium.h
tm
Bertoluzzo, MG; Cena, J; Cavazza, V; Bertoluzzo, SM. Determinacin de
la actividad hidroltica de lipasas fngicas. [Internet] [acceso 21 de
noviembre de 2017] Disponible en:
http://www.unr.edu.ar/descargar.php?id=12650.
Gonzlez B. J., Moreno M. V. R., Del Monte M. A., Las lipasas: enzimas
con potencial para el desarrollo de biocatalizadores inmovilizados por
adsorcin interfacial. Rev. Colomb. Biotecnol., Volumen 12, Nmero 1, p.
124-140, 2010.

22
 Marcelo Abdel S. Produccin de cido ctrico y desarrollo morfolgico en
miembros del gnero Aspergillus [Tesis Doctoral] Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1997.
http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2951_Soria.pdf

23