Volumen30,nmero10,octubre2012,Pginas538545

Revisin

deEscherichiacoli paralaproduccin
debiocombustibles:cerrarla
brechadelapromesade
practicar
2,
SarahHuffer1,
2,
ChristineM.Roche1,
2,
HarveyW.Blanch1,
2,
DouglasS.Clark1,

Mostrarms

doi:10.1016/j.tibtech.2012.07.002
Obtnderechosycontenidos

El cambio anticipado de materias primas para biocombustibles a partir de maz de lignocelulosa
presenta retos enel desarrollo deenfoques de pretratamiento delabiomasa efectiva, locualincide
en la seleccin y capacidades delos organismos productores decombustible.Para un procesode
produccin de biocombustibles viable, el organismo ideales produccin de combustibledebe ser
capaz de convertir de manera eficiente una variedad de azcares a los combustibles
anaerbicamente a rendimientos cercanos terico, resistir inhibidores generados por el
pretratamiento de la biomasa y exhiben baja toxicidad delproducto. Escherichiacoliencuentrauso
extenso como un sistema modelo, pero no ha sido ampliamente utilizado como unhost industrial.
Esta revisin destaca los recientes avances en la ingeniera metablica de las vas de
biocombustiblesntesis en E. coli yresume losconocimientosadquiridosen la regulacin deestas
vas, ydescribe el progreso hacia lasuperacin delosdesafos queenfrentasuadopcincomouna
cepadebiocombustiblesalaproduccincoli.

Palabrasclave
Escherichia
biocombustibles
anaerbico
secrecin
fago
lignocelulosa

IngenieraE.coliparabiocombustibles
Lanecesidaddefuentesdeenergaalternativasyrenovablesest impulsandounresurgimientoenla
investigacin de biocombustibles, con nfasis en losbiocombustiblesderivados dematerias primas
lignocelulsicas. El etanolha sidoel focode mucha investigacin enlas ltimas dcadas, pero sus
deficiencias como combustible han llevado a la ingeniera metablica de huspedes microbianos
para producircombustiblesconpropiedadesmsdeseables,talescomobutanol,isobutanol,medio a
los hidrocarburos de cadena larga, y isoprenoides(Recuadro1).Una variedad de anfitriones estn
disponibles para la produccin de estos combustibles, incluyendo microalgas, hongos y bacterias.
Las algas ofrecen la capacidad de producir materias primas para biocombustibles y precursores

directamente de CO2 y la luz solar Sin embargo, sigue habiendo importantes retos de ingeniera

antesde lastecnologas basadas enalgaspuedenserprcticos,incluyendoelcultivoagran escala,

la recoleccin y separacin de productos. La levadura Saccharomyces cerevisiae es ampliamente
utilizado para la produccin de etanol,sin embargo, es incapazde consumir azcaresde pentosa,
aunque esto ha sido abordado con la ingeniera metablica [1].En contraste, E. coli es capaz de
utilizar tanto los azcaresdepentosa yhexosa, yesaltamentesusceptiblealaingenierametablica
paralaproduccindecombustible.

Box1.

Loscombustibles

Alcoholes

Aunqueeletanolhasidoelfocodelainvestigacinpredominante biocombustibles,quecarecede las

propiedades necesarias para ser utilizados en la actual infraestructura para su distribucin y
consumo. Por tanto, la atencin se ha convertido en alcoholes de cadena superior (C4C10) que
pueden ser fcilmente mezclarse con la gasolina o completamente reemplazarlo. Alcoholes de
cadena Superior tienen un mayor poder calorfico superior a etanol (36,1 MJ / kg para el butanol
frentea29,7paraeletanol)ynoson higroscpicas[51].Estaspropiedadespermitenlaintegracinen
las tuberas y los motores existentes, pero la produccin de estos combustibles en grandes
cantidadesyenaltosrendimientosatravsdebioprocesossiguesiendounretopendiente.

Biodiesel

La mayora debiodiesel producido actualmente estderivado de losaceitesvegetales enforma de

triacilgliceroles, que son entonces qumicamente convertida en steres metlicos decidos grasos
(FAMEs). Sin embargo, los aceites vegetales no son una fuente sostenible de biodiesel en
cantidades lo suficientemente grandes como para desplazar a fracciones significativas de diesel.
Fuentes de aceites microbianos se han propuestocomouna alternativa sostenible, y losmicrobios
hansido diseadosparaproducirsteres etlicosde cidosgrasos(FAEEs)directamente.FAMEsy
FAEEs tpicamente variar en longitud de 12 a 22 tomos de carbono y tienen una densidad de
energa comparable a diesel de petrleo. La alta densidad de energa y otras propiedades
ventajosas, como buena lubricidad y menores emisiones, hacen FAME un buen reemplazo diesel
renovable. Es difcil, sin embargo, para producir mezclas de FAME que equilibren propiedades
deseables,comoelnmerodecetanoydeflujoenfro,quedependen delalongituddelacadena, la
ramificacin,y el gradodesaturacin.Laexpresinheterlogadetioesterasasesunenfoqueque ha
sidoutilizadoconxitoparaalterarlalongituddecadenadecidograso[52].

Los isoprenoides son potencialmentebuenas alternativasde combustiblediesel, as, porquetienen

baja higrometra, de alto contenido energtico, y una buena fluidez a bajas temperaturas. Estas
molculas, sin embargo, los nmeros de cetano exposicinms bajos debido alamayorgrado de
insaturacin. Esto puede ser mitigado por hidrogenacin qumica, como se utiliz para producir
farnesane, que tiene propiedades de combustible superior de precursor, farnesenosu producida
[53]microbiolgicamente.Antesde cualquiera delos decadena larga o hidrocarburos cclicospuede
serviablecomocombustible,lasconcentracionesdeproduccindebenmejorarsedrsticamente.

El anfitrindebesercapaz demetabolizar todoslos azcares derivadosde procesosanteriores.La

glucosay la xilosasonlos principales azcares derivados demateriasprimaslignocelulsicas,pero
otrosazcarespueden estarpresentes,incluyendocelobiosay arabinosa.El anfitrintambindebe
producir el biocombustible en condiciones anaerbicas, evitando la necesidad de airear grandes
volmenesde reactor.Lacapacidadde convertirlosazcaresaproductocon altosrendimientos(por
ejemplo, en unidades de g de producto / g de azcar consumido) con altas productividades
(tpicamente definido en g / l / h) es tambin esencial. Estos criterios importantes para un buen
anfitrinproduccinmicrobianaseilustranesquemticamenteenlaFigura1.

Figura1.

Representacin esquemtica de unadeidealizado Escherichia coli cepapara producir biocombustibles a partir de

hidrolizados lignocelulsicos. El organismo tiene la capacidad de crecer y producir biocombustibles bajo condiciones
anaerbicas, consume todos los azcares, segrega los combustibles producidos a cerca de rendimientos tericos,yes
resistentealosinhibidores.

OpcionesFigura
Tabla 1 contiene los rendimientos y productividades para la produccin de biocombustibles
informado para E.coli.La resistencia a los compuestos txicos que seencuentran en el hidrolizado
resultante de pretratamiento de la biomasa, que, en el caso de pretratamiento con cido diluido,
puede incluir furfural, cido actico, y 5hidroximetilfurfural (HMF),yalosproductosdecombustible
a s mismos, es necesario alcanzar concentraciones elevadas de productos y rendimientos. Los
productos de la combustin pueden ser txicos a niveles muy bajos y sofocar el crecimiento y la
produccin (porejemplo,4 g /ldebutanoldisminuyela tasade crecimientoespecfico deE.coliK12
en un 50%) [2].La secrecin del producto es otro factor importante, especialmente en el caso de
molculas decombustible hidrfobos.Estos productos decombustible sesabe queseacumulanen
la membrana plasmtica, que puede causar la ruptura celular. Que secretan los de combustible
permitir laseparacin defasesque se produzca, facilitar larecuperacindelcaldodefermentacin
yaliviarlosproblemaspotencialesdetoxicidad.

Tabla1.

actualescombustibles,concentraciones,ylosrendimientosproducidoseningenieraE.colicepasendiversascondiciones.

rendimie
nto Rendimie promediode
Concentraci Reportad nto productividad
n o terico volumtrica

(gde (gde condiciones

producto producto/ (gde de
/gde gde producto/l/ fermentaci Ref
decombustible (g/l) glucosa) glucosa) h) delsustrato n s

Etanol 45 0,50 0,51 0,63 Mixtasugars AN [11]

54.4 0.51 0.51 1.2 Glucose AN [59]

41.6 0.53a 0.51 1.1 Xylose AN [59]

1Propanol 3.6 ND 0.44 0.038 Glucose AE [60]

Isopropanol 4.97 0.15 0.34 0.40 Glucose AE [61]

143b 0.23 0.34 0.60 Glucose AE [62]

3Methyl1butanol 4.4,9.5c 0,10, 0,33 0,122,0,158c glucosa AE [32]

c
0,11

nbutanol 14 0.33 0.41 0.39 Glucosa AE [36]

4,65b 0,11 0,41 0,065 Glucosa AE [25]

 15,30b 0.36, 0.41 0.20 Glucose AN [22]
0.29b

Isobutanol 13.4 0.41 0.41 0.56 Glucose AN [20]

50.8c 0.29c 0.41 0.71 Glucose AE [33]

22 0.35 0.41 0.35 Glucose MA [63]

21.2 0.31 0.41 0.21 Glucose AE [35]

C6C10alcoholes 0,42 0,083 0,57 0,0089 glucosa AE [36]

Grasosacids 0.30 ND 0.33 0.008 Glucose AE [48]

0.94 0.060b 0.33 0.19b Glucose AE [39]

2.5 0.048 0.33 0.17 Glucose AE [64]

0.81 ND ND 0.028 Glycerol AE [38]

1.2 0.060 0.33 ND Glucose AE [18]

6.6 0.28 0.33 0.11 Glucose AE [36]

Fattyetlicodel 0.016 ND 0,35d ND Glucosay AE [18]

cidosteres xylan

0.92b ND 0.33 0.020 Glucose AE [37]

0.67 0.033 0.35d 0.008 Glucose AE [18]

0.071 ND 0.26 0.001 ILpretreated AE [17]

switchgrass

metiloketones 0.380c ND 0.33 0.010 Glucose AE [27]

Farnesol 0.135b ND 0.27 0.003 Glycerol AE [65]

Isoprene 0.314b ND 0.3 0.006 Glucose AE [43]

Levopimaradiene 0.700 ND 0.25 0.004 Glycerol AE [66]

Polyhydroxybutyrate 0.4152 0.014 0.48 0.009 Glucose MA [21]

0.6976 0.023 0.48 0.015 Glucose AE [21]

 Bisabolene 0.912 0.09 0.25 0.013 Glucose AE [67]

Abbreviations:AE,aerbicoAN,anaerbicoIL,lquidoinicoMA,microaerbica.ND,nodeterminado

Incluyecontribucionesdeloscomponentesdelmediocomplejos16:....

defermentacinFedbatch

Eninsitulaeliminacindecombustible

Rentabilidadtericasebasaenhacer0FFA

opcionesCuadro

En los ltimos aos, un creciente cuerpo de literatura se ha centrado en E. coli como organismo
modelo para la optimizacin de rutas metablicas [3]. E. coli se utiliza tambin, por ejemplo, enla
produccin comercial de laqumica de1,3propanodiol alto volumen [4].Adems, lafacilidad con la
quesusvasmetablicas pueden ser borradosy sustituidoshaceE. coli un candidato idealparael
desarrollo de las vas para la produccin de biocombustibles [5].Esta revisin destaca el
estadodelarte actual en la ingeniera cepa de E. coli para la produccin de biocombustibles, as
como su uso como una herramienta para comprender la regulacin metablica de las vas
biosintticas de productos y los efectos txicos de las molculas decombustible y los inhibidores.
Tambin se discutennuevasoportunidades para explorar la secrecinde productos ylaproduccin
debiodieselanaerbico.

Utilizacindesustrato
La capacidad de convertir una variedad de sustratos (por ejemplo, los derivados de los residuos
lignocelulsicos agrcolasyforestales,pastos,cultivos oleaginososyresiduos urbanos)enproductos
de inters es unagranventajaparauna posiblecepade produccin. E. coli utiliza deformanatural
una amplia gama de sustratos, incluyendo glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa y a partir de
lignocelulosa, y los cidos grasos y glicerol a partir de cultivos de semillas oleaginosas 6 y 7.La
eficiencia con la que se metabolizan mezclas complejas de sustratos no es ideal para procesos
industriales y mucho esfuerzo se ha dirigido hacia la reconfiguracin de las vas de utilizacinde
sustratonativas de E.coli.Losprocesosindustriales msexitososproducenbiocombustibles a partir
de materias primas defcildigestincomoelalmidn (maz)ysacarosa(caadeazcar).Adems,
la glucosa, que seobtiene fcilmenteporhidrlisis decualquierade materia prima, es la fuente de
carbono preferida de E. coli y por lo tanto se consume yse metabolizan demanera eficiente. Sin
embargo, independientemente del sustrato de azcar ltimo, el uso de materias primas
lignocelulsicas de bajo costo y sostenibles en un proceso industrial basado en E. coli requiere
mayordesarrollodeprocesoseingenieradeunacepadeproduccinadecuado.

La naturalezacomplejadelacorrientederivadadelaenzimticacatalizadaporcidoo sacarificacin
de la biomasa pretratada (hidrolizado), junto con su potencial toxicidad para E. coli y otros
organismos (discutido en una seccin posterior), son obstculos actuales para la fermentacin
eficiente de hexosa y mezclas de azcar pentosa. E. coli utiliza represin catablica por carbono
(CCR) [8] para regular su uso de fuentes de carbono, por lo que la presencia de una fuente de
carbono preferida (glucosa) suprime la expresin de genes necesarios para la captacin y la
utilizacin de una fuente menos preferido(xilosa). Esta regulacin resultados en el consumo
secuencial deazcares, ypor lotanto diauxic no ideal(bifsica)de crecimiento, lo que requiereun
tiempoderesidenciamslargoparaelconsumocompletodelasfuentesdecarbono[9].

Variasestrategias para superar hexosa ypentosa diauxie sehandirigidoadesactivarelmecanismo

de la CCR 5 y 10.La eliminacin de otros mecanismos de regulacin tambin pueden aliviar el
metabolismodel carbono priorizada.Porejemplo,cometabolismodeunamezcladeazcardecinco
y seis de carbono (glucosa, xilosa, arabinosa, manosa, y galactosa) se mejor en una sintasa de
metilglioxal (MGSA) cepa de delecin de unetanolognico E.coli [11].El objetivo, MGSA, es un
inhibidor general de metabolismo del azcar cuando los azcares fosforilados han acumulado y
MGSAaumentalagravedaddeCCRporlaglucosa[11].

Otro enfoque inspirado por eliminacin de glucosa / diauxie xilosa en la levadura se aplic
recientementeenE.coli12y13.Fueronalimentadosconmezclasdecelobiosa/xilosaauncelobiosa
metabolizadoras deingeniera E.coli cepa que expresaba un transportador celobiosa y un
glucosidasa intracelular para facilitar hexosa / cometabolismo de las pentosas. Hidrlisis
intracelular de celobiosaa glucosa porglucosidasaminimizadoglucosarepresindelmetabolismo
delaxilosa,permitiendoascometabolismodelahexosaypentosaazcares13y14.

Azcares delahemicelulosatambincausandiauxie enE.coli.Enloscultivosquecontienenxilosay

arabinosa,E.coliconsumearabinosaprimero[15].Este usosecuencialdepentosasesespecialmente
problemtico para un proceso dealimentacin por lotes, dondeuna mezcla deambosazcaresse
alimenta continuamente, lo que resulta en el consumo de azcar inhibido de la mayor (xilosa).El
factor detranscripcinparaelmetabolismo dela arabinosa (AraC) se descubri que tena sitiosde
unin en los promotores de genes implicados en el metabolismo delaxilosa [15].En presencia de
arabinosa, AraC ocluye estricamente launin delfactor detranscripcin metabolismo delaxilosa
(XylR),impidiendo latranscripcin degenes deutilizacindexilosa [15].SobreexpresaXylRcompite
con AraC para la unin a xilosa de consumo promotores y elimina eficazmente xilosa / diauxie
arabinosa. Es importante destacar quelas mutacionesestablecidas eneste estudio son totalmente
compatiblesconlasmutacionesqueeliminanhexosa/diauxiepentosa[16].

Losesfuerzos hansidodurantemuchotiempoenmarchaparadesarrollarunmicroorganismoquees
capaz de convertir directamente lignocelulosa para alimentar los productos, sobre la base de la
expresin natural o recombinante de celulasas y hemicelulasas. Aunque los rendimientos de los
biocombustibles obtenidos atravs deesteenfoquebioprocesamientoconsolidadosonbajos,varios
estudios depruebadeconcepto sehanmostradoprometedoresenlaproduccin deunavariedad de
combustibles directamente de lignocelulosa17 y 18.Unetanolognico ingeniera E.coliquecontiene
el SIDA celobiasa y actividades pectinolticas en el consumo de pectina rica en biomasa
lignocelulsica[19].

anaerbicoproduccin
anaerbica produccin de biocombustibles elimina la necesidad de airear grandes volmenes de
medios de comunicacin y reduce el riesgo de contaminacinmicrobiana. AunqueE. coli produce
naturalmente etanol bajo condiciones anaerbicas, muchas de las vas incorporadas en su
metabolismo para biocombustibles o productos bioqumicos de produccin requieren regeneracin
aerbica de exceso reducida cofactores [NAD (P) H] derivados de la reduccin desequilibradade
azcaresalos combustibles. Silavametablicagenerarlosequivalentesreductoresnoseequilibra
conla va deproduccin decombustible,el exceso deNAD(P)Hdebeserregenerado,tpicamente
por formacin de agua durante el metabolismo aerbico. Esto requiere tpicamente el crecimiento
bajocondicionesmicroaerbicas,quepuederesultardifcildecontrolaragranescala.

Losestudiosrecientessehan centradoen lasvasaerobiasingenieraparafuncionar deunamanera

equilibrada en condiciones anaerbicas utilizando modelos metablicosy deingeniera enzima20,
21, 22 y 23.Por ejemplo, el modo de anlisis elemental, que se descompone red metablica en
conjuntosde vasnicas, junto con la sobreexpresin delavadeisobutanol, seutiliz para disear
y luego construir un mnimo E. colicepa que produjo isobutanol en condiciones anaerbicas

[23].Optimizacindelas condicionesdedeformacinydefermentacineranecesariodesviarNADH2

de produccin de etanola la vade isobutanol,el equilibrio de equivalentes reductores. Estetrabajo

pone de relieve la importancia de equilibrar los cofactores necesarios para las nuevas vas de
produccindecombustible.

Clostridiumacetobutylicum,una Gramnegativa, obligar anaerobio, produce naturalmente

nbutanol,y su nbutanolva de se ha expresado en E. coli con ciertoxito. El C. acetobutylicum
nbutanol vaen E.colise expresymodificadoparaobtenerunaconcentracinaparentede30g/l
de nbutanol(basado en lain situ eliminacindel butanol por arrastre con gas) en condiciones
anaerbicas [22].La comprensin de las vas metablicas implicadas en nbutanollabiosntesis de
fue fundamental en este trabajo. La coenzima A (CoA) y la va hacia el nbutanolen C.
acetobutylicum contiene reacciones reversibles y depende tanto de NADH y ferredoxina, una
protena que contiene hierroazufreque facilita la transferencia de electrones. Aqu,
ferredoxinaindependiente transreductasa enoylCoA de Treponema denticola sustituido por la
correspondienteC. acetobutylicumenzimaparaeliminarladependenciadeferredoxinayel potencial
reversibilidad de la reaccin. Otras sustituciones denativo E.coli enzimas para los de C.
acetobutylicumcondujo alapuestaen comn delaacetilCoAy NADH queelaumento delafuerza
motriz para nbutanolla produccin de en condiciones anaerbicas y mejor la
nbutanolconcentracinde375vecesapartirde40mg/la15g/l(sinenretiradadelproductositu).

Disponibilidadcofactor encondiciones anaerbicas sehamejorado para laproduccindeisobutanol

en E.coli [20].Unpaso importante en la produccindeisobutanoleslaconversinde2acetolactato
a 2,3hidroxiisovalerato por el reductoisomerasa cido cetol NADPHdependiente (ilvC). Evolucin
dirigidadeILVCa travsdemutagnesisdirigidaalsitiodesaturacinsehautilizado para cambiarla
especificidad deILVC deNADPH aNADH, quees elcofactorms abundanteproducida a partirde
catabolismodelaglucosaencondicionesanaerobias.Cuatromutacionesmejoranlaespecificidad de
ILVCparaNADHNADPHapartirde 1:291a185:1.Otraenzimaesencialenestavaesunaalcohol
deshidrogenasa (ADH) que convierte a isobutiraldehdo isobutanol. En un estudio relacionado, por
otro grupodeinvestigacin,unAdhaNADPH independientedeLactococcuslactis[24],quetieneuna
especificidad mayor para isobutiraldehdo de acetaldehdo, sustituido la enzima para la Adh
NADPHdependiente enE.coli.La L. lactis Adhase mut an mselusodemutagnesisaleatoriay

la disminucinde la Km para isobutiraldehdopor triple.Sustituyendo lailvCmutadoyAdha enlava

isobutanol result en la produccin de isobutanol al 100% delrendimientotericoen comparacin

con53%usandolasenzimasdependientedeNADPH.

Estos y otros estudios han demostrado que el uso de la ingeniera metablica para superar los
desequilibrios cofactor y los cuellos de botella pueden mejorar en gran medidalos rendimientosy
concentraciones de alcoholes en condiciones anaerbicas.Sin embargo, hasta la fecha,no sehan
publicado estudios sobre la produccin anaerbica de mediano y de cadena larga alcoholes o
steres. La comprensin de cmo recin graso introducido vas cidos funcionan en condiciones
anaerbicas proporcionar oportunidades para utilizar enin silico modelospara determinar la
disponibilidadcofactor,ascomoparaencontrarnuevasenzimasquerealizanlasmismasreacciones
encondicionesanaerbicas.

deproduccindecombustible
Tcnicasde la ingenierametablica ylabiologasintticapermitenahoranuevasvasdeproduccin
de combustible para ser construidos en E.coli.Para aumentar las concentraciones de productos y
productividades, E. coli cepas se pueden desarrollar para expresar enzimas heterlogos con
actividades de mayor catalticos para intermedios clave en las nuevas vas y knockoutsde genes
construidos para canalizar mayorflujo decarbonohacia el productodeseado20,22,23,24,25,26,
27, 28, 29, 30 y 31.Vas de ejemplo se muestran en la Figura 2y la Tabla 1se resumen los
combustibles actuales producidos junto con sus concentraciones, rendimientos, productividad y
condicionesdefermentacin.

Figura2.

Las vasmetablicas paralaproduccin debiocombustibles. Losrendimientosde lasvastericas(g / g de glucosa) se

incluyen para cada biocombustibles [58].Los rendimientostericosdeproductosdebiocombustiblesdelaruta delcido
graso se basan en siete vueltas del ciclo de biosntesis de cidos grasos, el producto central de la cual es el cido
palmtico. Rendimientostericosdebiocombustibles productosdelas vasisoprenoides sedan como: rendimientova del
mevalonato(DXP rendimientova).Lasflechascontinuas representan lasvas nativas.Flechas rotasrepresentanvasde
ingeniera. La mayora de las reacciones representadas por las flechas son catalizadas por ms de una enzima.
Abreviaturas:DXP,2CMETILD4erythritolfosfatoFAEEs,steresetlicosdecidosgrasosG3P,gliceraldehdo3fosfato
PEP,fosfoenolpiruvatoFigura.

opciones
Introduccindelasvasnonaturales
E. coli no produce de formanativa muchosde losproductosde combustibleactualmentedeseadas,
tales como hidrocarburos de cadena larga o alcoholes de cadena ms larga, y las vas exgenos
para estoscombustiblesdebeserintroducido yoptimizado. Ejemplosdetalesproductosnonaturales
incluyen 3metil1pentanol [31],3metil1butanol[32], nbutanol [22],isobutanol 20,23,24,33, 34 y
35,a medioy alcoholes de cadena larga o cidos27,29,36,37,38,39,40y41,yalcanos.42y43Un
desafo actual para la produccin de dichos combustiblesreside enlaoptimizacin denuevas vas
quecontienenvariasenzimasheterlogas.

Como la mayora de los microorganismos, E.coli tiene unmetabolismo altamente reguladoPorlo

tanto, laintroduccinde nuevas vasno garantizaaltasconcentracionesoproduccineficientedela
biocombustible deseado. Mutagnesis aleatoria y seleccin de crecimiento se han utilizado para
superar los desafos de un metabolismo complejo. Estas herramientas se han utilizado para
investigarE. coli cepascapaces deproducirisobutanol a travsde partede lavadevalina[35].E.
coli fue expuesto al mutgeno NmetilN'nitroNnitrosoguanidine (NTG) y norvalina utilizado, un
anlogo de aminocido txico devalina, para aislar clulasconuna mutacin quedesregulala va
valina, aumentandoas el flujo decarbono haciaisobutanol. Las cepas capacesde sobreviviren la
presencia de norvalina fueron transformadas con los genes isobutanolva y se rastrearon parala
produccin de isobutanol. Las cepas que exhiben concentraciones ms altas deisobutanol queel
tiposalvaje fueron sometidos aotrarondademutagnesis aleatoriayelcrecimiento ennorvalina.La
secuenciacin delgenomaidentificado ms de 200 mutaciones, unode los cualesera uncodnde

parada en el polimerasa RNAfaseS factorestacionaria,que conduce a un truncamiento de

S.
Extraccin del codn de parada aument la concentracin isobutanol 13,6 a 21,2 g / l. Tanto

mutagnesis aleatoria y diseo racional se han utilizado para mejorar las concentraciones de
3metil1butanol [32].Unanlogodeleucina,4aza,D Lleucina,yNTGdesreguladoslavadeleucina
y mejoraron las concentraciones de 3metil1butanol 0,45 a 4,4 g / l. Estos estudios ilustran una
estrategia general para la mejora delas concentraciones de productos,especialmentelosalcoholes
sintetizadosatravsdevasdeaminocidos.

Grasosdeproduccindecido

Muchas enzimasapoyan tanto la sntesisy la degradacindeloscidos grasos,ascomoregularla

produccin decidograso.Unamejorcomprensinde anabolismoyelcatabolismodecidosgrasos
permitira dirigir la ruta del cido graso para la sntesisde combustible. Para este fin, se utiliz un
sistemalibredeclulasparainvestigardirectamentey cuantitativamentela regulacin ylasntesisde
cidos grasos en E.coli[39].RadiomarcadomalonilCoAenelextractolibredeclulas seutiliz para
determinar que la sntesis de cido graso era altamente dependiente de la disponibilidad de
malonilCoA. Laconcentracinintracelular demalonilCoAseestimaquerequiereun aumentode 10
vecesparaalcanzarlamximaproductividadparalasntesisdecidosgrasos.

Computacional y se combinaron enfoques experimentales para determinar el nmero mnimo de

cambiosgenticosnecesariosparaproducirunciertorendimientode malonilCoA[41].Los resultados
computacionales permitieron lareconstruccindeunaE.colicepaqueexhibiun aumentode cuatro
veces en malonilCoA. Esta investigacin es un ejemplo importante de cmo los modelos
computacionalespuedensertileseneldiseodeE.colicepasconpropiedadesespecficas.

Revertir elciclodeoxidacindeconstruiren lugardelos cidosgrasossedegradantambinseha

convertido en un objetivo de la investigacin reciente. Estudios previos han aprovechado de este
ciclo de produccin de combustible. Por ejemplo, el ciclo de oxidacin se invirti mediante
mutaciones se inform anteriormente para el opern oxidacin en E. coli y deshidrogenasas y
tioesterasas endgenas [36].En otro esfuerzo para disear la va oxidacin, se trunca a

sobreproducir metilcetonas alifticos con C11 a C15 cadenas de carbono [27].En tipo salvaje

E.coli,cetoacilCoAsedivideenacilCoAyacetilCoAporelFADE deshidrogenasaacilCoA.FADE
fue eliminadoy reemplazado con el tioesterasa FADMnativa para convertir cetoacilCoAaceto
cido, que se descompone espontneamente en una cetona de metilo. Estos estudios ponen de
relieve la complejidadde la modificacinde lasvas existentes y laintroduccinde nuevas vas en
E.coli,. mientras que el equilibrio de los muchos otros criterios deseados para un husped de
produccinadecuado

desecrecin
Muchas molculas de biocombustiblespotenciales se difunden librementea travs delamembrana
celular (por ejemplo, alcoholes de cadena corta) Sin embargo, otros se acumulan en la bicapa
lipdica de la membrana citoplasmtica (por ejemplo, alcoholes de cadena larga, hidrocarburos
cclicos, terpenos, yalcanos) [44].Laacumulacinde estos compuestos lipfilosenlamembrana es
en gran parte responsablede los efectostxicos deestasmolculas.La toxicidaddelproductopara
el microorganismo es a menudo una limitacin importante de la produccin de biocombustibles
microbianaysediscutebrevementeenelRecuadro2.

Cuadro2.

Lasbacteriasylaproduccindebiocombustiblesindustriales

condicionesnoasptica

La contaminacin es un problemagrave para cualquierproceso defermentacinindustrial, pero es

un desafo mayor encondiciones noaspticastpicos delaproduccin debiocombustibles.Un tipo
de contaminacin es bacterifago (o fagos) queinfecta a las bacteriasycausalafermentacinpara
desacelerar o detener, lo que el tiempo de inactividad de produccin y los costos asociados
significativos. Los fagos seconviertenenunadelasprincipalespreocupacionescuando elsustratoo
el suministro deaire noesestril.Unavez fagoshan infectadoungranfermentador,el tanquedebe
ser limpiado y desinfectado. Unproceso debiocombustiblesindustriales con E. coli comohusped
de produccin seenfrentanalos mismos retos decontaminacin fagocomolaindustriaalimentaria
En particular, la industria lctea [54].Por ejemplo, Streptococcus thermophilus es una bacteria de
cido lcticoutilizadosparaproduciryoguryessusceptiblealosfagos.Laindustrialcteautilizauna
combinacin de saneamiento mejorado instalacin, cultivos iniciadoresen mediosresistentesa los
fagos, y las cepas resistentes a los fagos para prevenir lacontaminacinde fagos. Los fagos,sin
embargo,puedenadaptarsealascepasresistentesyencontrarnuevasformasdeinfectaraellos.

Laindustria delabiotecnologa tambintieneantecedentesdeinfecciones defagos[55].Porejemplo,

acetonabutanoletanol (ABE) fermentaciones utilizando de Clostridium cepasestaban plagadosde
ataques defagos durantegranparte delsiglo 20[56].Unenfoqueutilizadoparacombatirfagosesla
adicin de agentes al caldo de fermentacin, que eliminan cationes divalentes conocidos por ser
esencial para la infeccin por fagos quelante. Adems, el mtodo de ms xito y ampliamente
utilizadofueelusode diferentes cepasquesonresistentes auna ampliagamadefagos.Apesarde
los avances hacia la disminucin de las infecciones de fagos, fagos seguirn siendo un asunto
costoso para fermentaciones bacterianas, especialmente en ambientesno esterilizados. Empresas
de biocombustibles utilizando bacterias como E.coliprobablemente tendr que luchar con fagos,y
debeconsiderarelcostosignificativo,prdidadeproductoy eltiempodeinactividad asociado con la
infeccinporfagos.

Toxicidaddelosbiocombustiblesyproductosdedegradacin

La toleranciade lasbacterias, especialmenteE.coli,aazucarerosyligninaproductosdedegradacin

txicos del tratamiento previo de lignocelulosa es tambin un factor importante para el desarrollo
comercialde E.colicomo unorganismoproductor debiocombustibles.Mecanismosdetoxicidad de
los combustibles a s mismos tambin deben estudiarse y efectivamente lograron alcanzar
concentracioneselevadasdeproductosyproductividades.Unarevisinexhaustivademetabolitoyel
sustrato presin sobre los microbios productores de biocombustibles ha sido recientemente
publicado[57].

La excrecin activa de compuestos txicos de las clulasatravs debombasde eflujo harecibido

mucha atencin por su papel en la resistencia a los antibiticos [45].Muchosde estos sistemasde
excrecinhan sido identificados, incluyendoacrABtolCenE.coli,ysonfuncionaleshaciaunaamplia
gama de sustratos qumicos [46].Por lo tanto, lo que permite el transporte activo de los
biocombustibles a partir de clulasa travsde bombas deeflujoes un enfoque prometedor para el
alivio de la toxicidad. Adems, los sistemas de transporte facilitado son atractivos para permitir la
secrecin de producto, especialmente de las molculas que se acumulan intracelularmente. La
secrecin de molculas de combustible tiene el potencial para aliviar la inhibicin del producto de
retroalimentacin, lo que aumenta las concentraciones finales. Desde un punto de vista de
bioprocesamiento, la secrecin tambin puede disminuir los costos de procesamiento aguasabajo
mediantelaeliminacindelanecesidaddelalisiscelular.

En un reciente estudio, hidrfobo / anffilo flujo de salida delasbombas(HAE1) se expresaron de

forma heterloga en E. coliy se tamiza para la tolerancia conferidos a una variedad de
biocombustibles (es decir, nbutanol,isopentanol,acetatode geranilo,geraniol,pineno,limoneno,y
hexanoatode farnesil) aadidos almediodecrecimiento.Ademsdelasbombasqueidentificanque
la restauracindel crecimiento enpresencia dealgunosdeestoscompuestos, lascepaspotenciales
de produccin que albergan estas bombas exhiben rendimientosmejorados [47].Cabesealar,sin
embargo,que en cada caso, la concentracin deproducto producido era por debajo desulmitede
toxicidadexaminado.

La produccin y secrecin dealcanos [48] ysteres etlicosde cidosgrasos(FAEEs)[18] tambin

seha Sinembargo,niestudioincluyla incorporacin debombasdedisolvente.Msde80%delos
alcanos producidos en elestudioeranalcano extracelular [48].EnelestudioFAEE, la expresinde
una tioesterasa en el citosol en lugar de en el periplasma como resultado la desregulacin de la
biosntesis de cido graso y por lo tanto la sobreproduccin y secrecin de FAEEs a una
concentracin de 400 mg /l[18].Seha demostradoquelos cidosgrasosde cadenalargapueden
atravesar la bicapa de fosfolpidos a travs de un mecanismo de flipflop [49],y este mecanismo
tambinpuedenaplicarseaFAEEs.

Secrecin de productos es una ventaja potencial del uso de un sistemade produccinbacteriana

inherentemente simple tal como E. coli.La faltade compartimentos, talescomo las mitocondriasy
lasvacuolasquese encuentran eneucariotas, evitaque elpotencialde acumulacinintracelularde
productos hidrfobos dentro de lasmembranas compartimentales. Porlotanto, el producto esms
probablequeseexcretaporlaclula.

Descubrir y sistemas de transporte activo de ingeniera paralas molculas de combustibleesuna

direccin interesante para la investigacin actual y futura. Bioprospeccin para las especies que
presentan un crecimiento en ambientes hidrofbicos es una va para el descubrimiento denuevos
sistemas deflujo de salida.Las bombasque sonespecficos para losbiocombustiblesdeintersson
especialmente deseables. Por ejemplo, el uso de casete de unin a ATPcido graso de cadena
larga peroxisomal (ABC) los transportistas ha sido sugerido para que permite la secrecin de los
lpidos [50].Tambin est siendo perseguido bombas de eflujo de resistencia a mltiples frmacos
para Ingeniera especificidad de biocombustibles atravs delaevolucindirigida. Por ejemplo,las
estrategias de evolucin dirigida se han utilizado para aislar E.coli variantesAcrB que mejoran el
crecimiento de E. coli en comparacin con el de tipo salvaje AcrB y otros controles en
aproximadamente un 20% cuando alcoholes de cadena corta medianas se suministran de forma
exgena en el medio. Ms investigacin esten marcha para determinarsi stos bombavariantes
aumento de la concentracin y el rendimiento del alcohol que producen E.E. coli cepas
de(TullmanErcek,comunicacinpersonal).

Observacionesfinales
El desafo deproducirbiocombustiblesen E.coliha conducidoamuchosdescubrimientosrecientes
y los avances en la comprensin del metabolismo y la regulacin degenes en este organismo. El
impulso hacia la produccin de sustitutos de combustible diesel en particular, tambin ha
proporcionado nuevos conocimientos sobre cmo la clula regula su metabolismo de los cidos
grasos. Utilizando tcnicas conocidas, tales como la evolucinadaptativaen combinacin con alto
rendimiento de la secuenciacin del genoma, ha permitido a los investigadores a identificar
mutacionesbeneficiosas,informandoalaingenierademejoresbiocatalizadores.

Esta opinin ha tocado en las propiedades ideales de un microorganismo de produccin de

biocombustibles y discutido cmoE . coli ha sido diseado y desarrollado para asumir estas
caractersticasrecientemente.Aunquemuchossehan hechoavanceshaciael logrodelaproduccin
de combustible en E. coli, it is clear that furtherstrain engineering isrequiredto establisha viable
biofuel production process. Beyond developing an ideal microorganism for fuel production,it isalso
necessary to consider how robust the organism is for a largescale industrial process. From a
bioprocessing standpoint,an E.coliprocess presents additionalchallenges thatare avoided orless
significantwitheukaryotic systems, includingphagesusceptibility(Box2), cellrecycling,andinability
to use spent biomass asabyproduct (eg, as a nutrientsourceforlivestock).Thus, although E.coli
remains a valuable research tool for addressing many important issues relatedtothebiosynthesis
andproduction of biofuels,thesignificant bioprocessingobstaclesandrequirementsforfurtherstrain
developmentpresentdauntingchallengesforitsuseasaproductionstrainonanindustrialscale.

Acknowledgments
The authors thank Dr. Chris Somerville for helpful discussions. This work was supported by the
Energy Biosciences Institute. SH acknowledges the National Science Foundation for a graduate
fellowship. CMR acknowledges the Department of Energy Office of Science Graduate Fellowship
Program (DOE SCGF) for funding, made possible in part by the American Recovery and
ReinvestmentActof2009,administeredbyORISEORAUundercontractno.DEAC0506OR231.

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