TALLER DE BIOQUIMICA

DIEGO ALEJANDRO BUITRAGO BUITRAGO

UNIVERSIDAD PEDAGGICA Y TECNOLGICA DE COLOMBIA

CIENCIAS DE LA EDUCACIN
LIC.CIENCIAS NATURALES Y EDUCACIN AMBIENTAL
TUNJA
2016
Cromatografa Lquida (HPLC)
FUNDAMENTO
La cromatografa lquida (HPLC), es una tcnica utilizada para separar los componentes de
una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y una fase mvil. La fase
estacionaria es slica que se ha tratado con RMe2SiCl . La fase mvil acta de portador de
la muestra. La muestra en solucin es inyectada en la fase mvil. Los componentes de la
solucin emigran de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los compuestos con la
columna. Estas interacciones qumicas, determinan la separacin de los contenidos en la
muestra.

La utilizacin de los diferentes detectores depender de la naturaleza de los compuestos a

determinar.
APLICACIONES
Esta tcnica est indicada para la separacin de compuestos orgnicos semivlatiles.
Hidrocarburos Poliaromticos (PAHs), Aminocidos: OTA, cido Flico, Herbicidas,
Vitaminas, Acido tenuazonico, Formaldehdoetc.
Rango de trabajo para muestras lquidas: g L-1 - mg L-1
Rango de trabajo para muestras slidas: g Kg-1 - g g-1

EQUIPOS
VARIAN 920 LC
Bomba de gradiente cuaternaria.
Columna termostatizada rango de temperatura: ambiente+10C-65C.
Auto muestreador (200 vialesx2ml) con jeringa de inyeccin (0-50l) con posibilidad de
realizar incrementos de 1l.
Detector PDA (diodo array) con un rango de longitudes de onda (190 -900 nm) con lmpara
de deuterio para UV y halgena de cuarzo para visible, con una resolucin espectral <1nm
para el fotodiodo.
Detector de Fluorescencia: Lmpara de Xe de 150W, y lmpara de Hg para chequear la
longitud de onda. Presin 145psi.

TIPO DE MUESTRAS
Aguas, suelos, alimentos, extractos.etc (para cualquier tipo de matriz contactar con el
laboratorio).
ELECTROFORESIS
La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas segn la movilidad de
estas en un campo elctrico a travs de una matriz porosa, la cual finalmente las separa
por tamaos moleculares y carga elctrica, dependiendo de la tcnica que se use.

La tcnica clsica utiliza una tira recubierta de una sustancia porosa impregnada de un
electrolito. Sus extremos se sumergen en dos depsitos independientes que contienen
ambos al electrolito y estn unidos a los electrodos del generador de corriente. La muestra
se deposita en forma de un pequeo trazo transversal en la tira. La distancia de migracin
se mide en relacin un marcador interno. Las placas son reveladas con sales de plata, azul
de Coomassie, o reactivos en particular.
Fundamentos y Conceptos Bsicos
La electroforesis capilar (CE) es una tcnica de separacin que se ha desarrollado gracias
a los avances de la cromatografa lquida de alta eficacia junto con los procedimientos ms
tradicionales de electroforesis. Esta tcnica permite separar bastante bien biomolculas,
donde la cromatografa lquida se muestra menos eficaz, y compuestos de pequea masa
molecular, difciles de estudiar por los procedimientos clsicos de electromigracin en
soporte.

La electroforesis capilar constituye una adaptacin particular de la tcnica de electroforesis.

Esta tcnica separativa se basa en la migracin de las especies de la muestra en disolucin,
portadoras de una carga elctrica global, bajo el efecto de un campo elctrico y en contacto
con un soporte (medio de desplazamiento) adecuado. En electroforesis capilar la tira se
reemplaza por un tubo capilar abierto en sus extremos, fabricado con un dimetro pequeo
(15 a 150m). El capilar oscila entre 20 y 80cm, y est lleno de una solucin buffer. Un
detector se encuentra ubicado en un extremo del capilar, cerca del compartimiento
catdico. La seal obtenida es la base de la obtencin del electroferograma, que muestra
el registro de la composicin de la muestra. Solo las especies que se dirigen hacia el ctodo
sern detectadas.
Mtodos de Deteccin

En la deteccin UV-Vis se mide la intensidad de la luz que pasa a travs del capilar en una
pequea zona en la que se ha eliminado el revestimiento opaco. La deteccin por
fluorescencia resulta ms sensible si se emplea una fuente lser muy intensa, asociada a
menudo a un procedimiento de preformacin de derivados de los analitos portadores de un
fluorforo.
Electrocromatografa Capilar
Este tipo de separacin asocia la electromigracin de los iones, propio de la electroforesis,
y los efectos de separacin entre fases presentes en la cromatografa. La tcnica consiste
en la utilizacin de un capilar relleno con una fase estacionaria, cuyo papel es doble: acta
como material selectivo que debe, por otro lado, participar en la migracin del electrolito. El
factor de separacin es muy elevado, pero existen un cierto nmero de problemas que
limitan su aplicacin, como el efecto de los modificadores orgnicos sobre el flujo
electroosmtico y la dificultad de un control preciso del volumen de muestra introducido en
el capilar.

Isoelectroenfoque (IEF)

El Isoelectroenfoque es un tipo de electroforesis que se emplea para separar molculas

cargadas.
Fundamento:
Una protena tiene grupos cargados de ambas polaridades, por lo que presenta un punto
isoelctrico (pI) que corresponde al valor de pH al cul la molcula posee carga neta (z)
igual a cero (zwitterion), y por lo tanto es inmvil en un campo elctrico. En un zwitterion
simple, pI= (pK1+ pK2)/2 (Fig. A); mientras que para un aminocido de cadena lateral cido-
base, pI es el promedio de los pK entre la especie con carga+1 y -1.
Se establece un gradiente de pH en el gel de poliacrilamida, que puede tener forma de
cilindro o lmina, realizando una electroforesis de una mezcla de polianfolitos (polmeros
pequeos con mltiple carga). El gel suele tener urea, de concentracin cercana a 6M, que
a diferencia del SDS no posee carga y no puede afectar en forma directa la carga neta de
las protenas. Se coloca la muestra (mezcla de protenas obtenida) en un buffer de baja
fuerza inica y con la aplicacin de una diferencia de voltaje, las protenas cargadas se
desplazan hasta alcanzar un pH equivalente a su punto isoelctrico.

Al aplicar la diferencia de potencial las protenas que se encuentran en regiones de pH

inferior a su punto isoelctrico estarn cargadas positivamente, y migraran hacia el ctodo;
mientras que aquellas que se encuentran en regiones de pH ms altos que su punto
isoelctrico tendrn carga negativa y migrarn hacia el nodo.
Ventajas:

Un anfolito siempre se detiene en la zona en la que el pH coincide con su punto

isoelctrico.

Gran repetitividad: los resultados no estn sujetos a variaciones debidas a las

condiciones experimentales, tales como la diferencia de potencial elctrico aplicada.
Gran poder de resolucin.

La muestra se puede colocar en cualquier zona del medio de soporte, en la zona cercana
al ctodo, al nodo o en el centro del mismo.
Aplicaciones:

La capacidad del IEF de separar las protenas en bandas definidas lo hace til como
herramienta analtica y preparativa. Varias preparaciones proteicas que se crean
homogneas se separaron en varios componentes mediante esta tcnica.

Una de las aplicaciones ms importantes de la IEF es la electroforesis bidimensional, que

consiste en la separacin de protenas segn su pI y su respectivo peso molecular (MW).

DIGRACCION DE RAYOS X
FUNDAMENTOS
Espectro electromagntico y Rayos X

Los Rayos X se descubrieron en 1895 por el fsico alemn Rntgen y recibieron ese nombre
porque se desconoca su naturaleza en ese momento. En 1912 se estableci de manera
precisa la naturaleza de los rayos X. En ese ao se descubri la difraccin de rayos x en
cristales y este descubrimiento prob la naturaleza de los rayos X y proporcion un nuevo
mtodo para investigar la estructura de la materia de manera simultnea.

Los R-X son radiacin electromagntica de la misma naturaleza que la luz pero de longitud
de onda mucho ms corta. La unidad de medida en la regin de los r-x es el angstrom (),
igual a 10-10 m y los rayos x usados en difraccin tienen longitudes de onda en el rango
0.5-2.5 mientras que la longitud de onda de la luz visible est en el orden de 6000 .

El espectro contnuo. Los rayos X se producen cuando una partcula cargada

elctricamente con suficiente energa cintica es frenada rpidamente. Los electrones son
las partculas utilizadas habitualmente y la radiacin se obtiene en un dispositivo conocido
como tubo de rayos x.
Los rayos x emitidos consisten en una mezcla de diferentes longitudes de onda y la
variacin de intensidad con depende del voltaje del tubo. La figura muestra el tipo de
curvas obtenidas. La intensidad es cero hasta cierta longitud de onda, llamada lim,
aumenta rpidamente hasta un mximo y entonces decrece sin un lmite abrupto en la parte
de larga longitud de onda. Esta radiacin se denomina radiacin continua o blanca, pues
est formada igual que ocurre con la luz blanca por muchas longitudes de onda.

Dicrosmo circular
Descripcin
El dicrosmo circular se expresa frecuentemente como la propiedad que poseen algunos
materiales de absorber la luz a diferentes grados dependiendo de la forma de polarizacin
del haz incidente. Se dice que un material presenta dicrosmo circular cuando la absorcin
de la luz circularmente polarizada en una direccin (derecha) es diferente de la absorcin
de la luz circularmente polarizada en la direccin opuesta (izquierda).

Cuando la luz se polariza circularmente, surge un componente secundario de absorbancia.

Este componente secundario de absorbancia se mide como el cambio entre la luz
polarizada circularmente (RCP) a la derecha e izquierda, y la diferencia resultante se
expresa como absorbancia (Berova N., 2000 y Velluz L., 1965).

Dispersin ptica rotatoria

Medicin de la variacin de la rotacin especfica (v. actividad ptica) en funcin de la
longitud de onda de la radiacin incidente sobre una muestra. La tendencia mostrada en la
Figura es la que se observa de manera ideal; sin embargo, las curvas frecuentemente
pueden seguir un comportamiento mucho ms complejo. En ingls: rotatory optical
dispersion. La grafica de la Figura se construy en base a la informacin que aparece en el
artculo "Rotatory dispersion and stereochemistry of organic compounds. IV. On the optical
rotatory contribution of hydroxyl groups in glucose. (Preliminary report)".
Racemizacin de aminocidos
La racemizacin de aminocidos es un mtodo de datacin qumica que consiste en la
conversin de un compuesto L-aminocido a un D-aminocido o viceversa y permite datar
muestras orgnicas hasta el Paleoltico Medio.
Los ismeros son molculas orgnicas formadas por los mismos tomos, idntica
composicin, pero con propiedades fsicas y qumicas diferentes.
1. La isomera estereoqumica ocurre en los compuestos que tienen los mismos
tomos; pero estn orientados de diferente manera. Los compuestos capaces de
existir en dos formas diferentes y que cada forma es la imagen en el espejo de la
otra, como la mano derecha y la mano izquierda, reciben el nombre de compuestos
quirales (del griego mano).
El fenmeno de la quiralidad se produce en compuestos que poseen algn tomo de
carbono unido a cuatro compuestos o grupos de tomos diferentes, como algunos
aminocidos entre ellos la alanina, la prolina o el cido asprtico.
Mezcla racmica y racemizacin La mayora de aminocidos tienen dos ismeros, la
forma izquierda (L o levgira) y la forma derecha (D o dextrgira). La forma de identificar
cada forma es someter la solucin a un haz de luz polarizada, con lo que las L se desviarn
a la izquierda y las D a la derecha. Una solucin de un aminocido con el mismo nmero
de L y de D, cada forma anula el efecto de la otra en la luz.
A una mezcla de las dos formas (levgira y dextrgira) de un mismo aminocido en
cantidades iguales se le denomina mezcla racmica; y racemizacin al proceso qumico
que consiste en la conversin de un compuesto L en D o de D en L.
En las plantas y animales vivos se forman aminocidos (que despus forman protenas)
mayoritariamente de la forma L y cuando estos seres vivos mueren empieza la
racemizacin y la transformacin de L-aminocidos a D-aminocidos hasta alcanzar la
estabilidad, la mezcla racmica.
Se puede determinar la edad cronomtrica de un resto orgnico si se conoce de un
aminocido, su tasa de racemizacin y la cantidad de forma L y D en la muestra.
Esta tcnica de datacin puede medir hasta el Paleoltico Medio.
Referencias

Castellan, G. (1998) Fisicoqumica, 2 ed. Mxico, Pearson-Adisson Wesley. Pgs. 461-

462

Rouessac, F. (2003) Anlisis Qumico: Mtodos y Tcnicas Instrumentales Modernas.

Espaa, McGraw Hill. Pgs. 121-133

Nelson, D. (2001) Lehninger Principios de Bioqumica, 3 ed. Espaa, Omega. Pgs. 123-
125.

Lehninger, A. (1994) Principles of Biochemistry. 3rd ed.

Van Holde K.E., Johnson W.C., Ho P.S. 1998. Principle of Physical Biochemistry. New
Jersey, USA: Prentice-Hall Inc., p. 418451.