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FACULTAD DE INGENIERA
LICENCIATURA EN INGENIERA QUMICA INDUSTRIAL
POR
LUISA MARA ARIAS GONZLEZ
PREVIO A CONFERRSELE
A Dios y la Virgen por ser lo que soy, por darme la voluntad para terminar mis
estudios con xito, la fuerza para levantarme en cada cada, la paz en los
momentos difciles, y la sabidura para tomar las mejores decisiones.
A mi papi por darme nimos y consejos a lo largo de la carrera. Por su amor, por
creer en m y ser paciente en todo momento.
A mis hermanas y cuado, Colocha, Canche, Seca, y Joe, por darme su alegra,
motivacin y ser un ejemplo para m de la perseverancia, la lucha constante y que
todo se puede lograr. A mi Fernandita bella, por darme su sonrisa y alegra,
haciendo mis das ms bonitos.
A mi Guapito, por ser parte importante de mi vida, estando a mi lado durante toda
la carrera, compartiendo desvelos, madrugadas, largas horas de estudio y
celebrando cada triunfo. Por todo su apoyo, su amor, alegra y paciencia, te amo!
Agradecimientos
A toda mi familia y amigos, que de una u otra forma estuvieron pendientes durante
la carrera, motivndome a seguir adelante, creyendo en m. En especial a la
familia Keller Gonzlez, Espinoza Gonzlez, Arias Chupina y Fajardo Galindo. Mil
gracias.
Resumen Ejecutivo
El presente trabajo titulado: Validacin de un mtodo analtico para la
cuantificacin de vitamina A en alimentos en cromatografa lquida de alta
resolucin y su determinacin en guayaba fresa (Psidium Cattleianum Sabine),
surgi por la necesidad de validar un mtodo nuevo para cuantificar la vitamina A,
y aportarlo al laboratorio CONCALIDAD. Influy por ser Guatemala un pas con
problemas de deficiencia de Vitamina A, siendo necesario tener metodologas
validadas con rapidez de obtencin de resultados, para que las industrias
alimenticias puedan evaluar el contenido de vitamina A de sus productos, y
cumplir as con los requerimientos que establece la FDA.
ndice de Tablas
Tabla No1. Gua de matriz para evaluacin de Test de Youden y Steiner ............ 22
Tabla No.2 Matriz para evaluacin de Test de Youden y Steiner modificada ....... 23
Tabla No.3 Formas de expresar el contenido de Vitamina A ................................ 32
Tabla No.4 Instrumentos utilizados en la metodologa .......................................... 49
Tabla No.5 Materiales utilizados en la metodologa .............................................. 51
Tabla No.6 Otros materiales.................................................................................. 55
Tabla No.7 Reactivos ............................................................................................ 55
Tabla No.8 Matriz de evaluacin para determinar robustez .................................. 66
Tabla No.9 Selectividad ........................................................................................ 75
Tabla No.10 Linealidad ......................................................................................... 75
Tabla No.11 Lmite de deteccin y cuantificacin ................................................. 76
Tabla No.12 Repetibilidad ..................................................................................... 76
Tabla No.13 Reproducibilidad ............................................................................... 77
Tabla No.14 Sesgo con un valor terico de 450 ER/100g................................... 77
Tabla No.15 Rango ............................................................................................... 77
Tabla No.16 Datos calculados para la determinacin de la robustez .................... 78
Tabla No.17 Conclusin de la robustez del mtodo .............................................. 78
Tabla No.18 Conclusin de la robustez del mtodo por medio de reproducibilidad y
repetibilidad ........................................................................................................... 78
Tabla No.19 Incertidumbre para la determinacin de vitamina A en frmula infantil
.............................................................................................................................. 78
Tabla No.20 Incertidumbre para la determinacin de vitamina A en Guayaba Fresa
.............................................................................................................................. 79
Tabla No.21 Contenido de Vitamina A en Guayaba Fresa .................................... 79
Tabla No.21 Datos originales para la determinacin de Selectividad y sesgo. ..... 92
Tabla No.22 Datos originales para la determinacin de Linealidad y Repetibilidad
por medio de Acetato de Retinol ........................................................................... 92
Tabla No.23 Datos originales para la determinacin de Reproducibilidad ............ 93
Tabla No.24 Datos originales para la determinacin de Robustez ........................ 93
Tabla No.25 Datos originales para la determinacin del contenido de vitamina A en
Guayaba Fresa. ..................................................................................................... 93
Tabla No. 26 Repetibilidad de la ecuacin de la recta por medio de la curva de
calibracin. .......................................................................................................... 100
1
1.1 Lo escrito sobre el tema
2
Garca (2009) plantea una metodologa para la cuantificacin de vitaminas en
margarina por no existir; con la metodologa planteada logr determinar
nicamente la Vitamina A, debido a que el mtodo no fue apropiado para la
Vitamina E. Se llev a cabo por medio de Cromatografa Lquida de Alta
Resolucin, y la validacin se realiz siguiendo los lineamientos de la FDA
(Federal Drug Asociation). Concluy que la metodologa en estudio es precisa,
reproducible, exacta, lineal, selectiva, robusta bajo los cambios y procesos
realizados, adems de determinar el lmite de cuantificacin de 3.01UI/g de
muestra.
3
1.2 Resumen Crtico del marco terico
1.2.2 Verificacin
De acuerdo a la Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010), en algunos casos se puede
realizar una validacin menor o verificacin cuando se trate de:
- Mtodos normalizados.
- Mtodos normalizados usados fuera de su alcance propuesto. Ejemplo:
uso en otra matriz.
- Ampliaciones y modificaciones menores de mtodos normalizados.
Ejemplo: uso en otros analitos.
4
La verificacin comprueba que el laboratorio domina el mtodo de ensayo
normalizado y lo utiliza correctamente, en caso de tratarse de un mtodo
normalizado modificado para la verificacin se requiere slo realizar aquellas
pruebas que indiquen que la variacin realizada no afecta el ensayo. Gua Tcnica
No.1 del ISPCH (2010).
5
- El deber profesional del qumico analtico
Esto lleva implcito que las pruebas realizadas son apropiadas para la parte
analtica del problema que el cliente desea resolver y que el informe final presenta
los datos analticos de tal manera que el cliente pueda entenderlos fcilmente y
sacar conclusiones apropiadas. La validacin del mtodo permite a los qumicos
demostrar que el mtodo es adecuado. Gua EURACHEM (2005).
6
Parte del conocimiento que debe tener el analista qumico y el laboratorio es la
toma adecuada de las muestras, la cual es un trabajo de gran habilidad que
requiere entender el problema con su qumica asociada. Gua EURACHEM
(2005).
Segn dicha gua, se debe validar un mtodo cuando sea necesario verificar que
sus parmetros de desempeo son adecuados para el uso en un problema
analtico especfico.
Por ejemplo:
- Nuevo mtodo desarrollado para un problema especfico.
- Mtodo ya establecido revisado para incorporar mejoras o extenderlo a un
nuevo problema.
- Cuando el control de calidad indica que un mtodo ya establecido est
cambiando con el tiempo.
- Mtodo establecido usado en un laboratorio diferente, diferentes analistas o
con diferente instrumentacin.
- Para demostrar la equivalencia entre dos mtodos, por ejemplo, entre un
mtodo nuevo y uno de referencia.
7
Cuando un mtodo ha sido validado por una organizacin de aprobacin de
normas, como la AOAC Internacional, por lo general, el usuario necesitar
nicamente establecer los datos de desempeo del mtodo para su propio uso.
La Gua EURACHEM (2005), menciona que el laboratorio tiene que decidir cules
de los parmetros de desempeo del mtodo necesitan caracterizarse con el fin
de validar el mtodo. La caracterizacin del desempeo del mtodo es un proceso
costoso pero puede restringirse por consideraciones de tiempo y costo.
8
En respuesta a esta necesidad, el laboratorio puede evaluar si los mtodos
existentes son adecuados, si es necesario desarrollar un nuevo mtodo, o
modificar mtodos existentes. Gua EURACHEM (2005).
Aun cuando se haya realizado la validacin del mtodo, el laboratorio tendr que
verificar peridicamente que se cumplen los parmetros de desempeo
documentados por parte de la organizacin que lo desarroll, modific y/o public.
9
Para esta verificacin el laboratorio puede utilizar, por ejemplo, muestras
inoculadas o materiales de referencia incorporados a las matrices ms
representativas. Tambin tiene que tomar en cuenta los resultados obtenidos de
las auditoras internas y externas de sus sistemas de gestin, dejando registro de
las verificaciones, OGA-GEC-016, (2007).
10
Adicionalmente se debe establecer un sistema para evaluar la factibilidad de
implementar los posibles cambios introducidos en las nuevas versiones del
mtodo, determinando las diferencias en cuanto a equipo, formacin del personal,
instalaciones, y dems aspectos necesarios para la ejecucin del ensayo.
11
1.2.9 Mtodos No Normalizados
12
1.2.10 Mtodos Desarrollados por el Laboratorio
Cuando sea el caso, el laboratorio debe demostrar que tiene un plan en el que se
incluye la evaluacin de su capacidad en cuanto a personal, equipo y dems
recursos que le permitan desarrollar mtodos propios. Los mtodos desarrollados
por el laboratorio deben estar adecuadamente validados, documentados y
autorizados antes de su uso. Cuando sea posible, se debe emplear material de
referencia con una matriz equivalente a la de la muestra, o bien debe utilizarse un
mtodo de ensayo normalizado alterno, preferiblemente de diferente principio de
medicin, para comparar los resultados. OGA-GEC-016, (2007).
- Selectividad o Especificidad
13
Una prueba de Selectividad comnmente utilizada, consiste en analizar un mnimo
de tres reactivos, tres blancos de matriz y tres muestras o estndares de
concentracin conocida del analito de inters. Gua Tcnica No.1 del ISPCH
(2010).
Se deben comparar las lecturas obtenidas para cada caso, y observar si existen
variaciones entre los testigos reactivos, blancos de matrices y estndares o
muestras con analito. Si se encuentran diferencias significativas debern ser
identificadas y en lo posible eliminadas. Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010).
- Linealidad
La curva de calibracin se debe realizar cada vez que se trabaje el mtodo, con
diferentes puntos, incluyendo blanco y el material de referencia de concentracin
conocida. Se recomienda abarcar valores cercanos al cero y valores superiores al
valor de inters. El nmero de puntos a analizar deber ser establecido por el
analista de acuerdo a la Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010).
14
Generalmente el criterio de aceptacin cualitativo que se usa para determinar la
linealidad es el coeficiente de correlacin: El coeficiente de correlacin indica el
grado de relacin entre la variable concentracin X y la variable respuesta Y de la
curva de calibracin. El valor mximo de 1 indica una correlacin positiva perfecta
entre X,Y con una pendiente positiva. Cuando r = 0, no existe correlacin alguna,
independencia total de los valores X,Y.
15
Se rechaza la hiptesis nula, las variables estn relacionadas.
Se acepta la hiptesis nula, las variables no estn relacionadas.
tcrtica se determina por medio de las tablas para un nivel de confianza del 95%
para grados de libertad n-2, por conocer el valor de la media y de la desviacin
estndar.
| | 2
1
Dnde:
tr = Valor del estimador t Student obtenido para el coeficiente de correlacin
| r | = Valor absoluto del coeficiente de correlacin
n2 = Nmero de grados de libertad
r2 = Valor del coeficiente de determinacin
16
El trmino lmite de deteccin no es aceptado ampliamente aunque se usa en
varios documentos sectoriales. La ISO utiliza como un trmino general valor
mnimo detectable de la variable de estado definida. Fuente: Gua EURACHEM
(2005). De acuerdo a la Gua EURACHEM (2005). El lmite de deteccin no existe
criterio de aceptacin, ya que depende del propsito de la metodologa empleada,
pero se puede determinar con la muestra en concentracin cercana al blanco.
!"2"
3.29 "
LC=Valor crtico
LOD=Lmite de deteccin
S=Desviacin estndar
&=Media
' =Datos obtenidos de cada lectura
- Lmite de cuantificacin
17
- Exactitud
De acuerdo a la Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010) (Pg. 39), Bajo el manual
del Codex Alimentarius, define la exactitud como el grado de concordancia entre el
resultado de un ensayo y el valor de referencia. El trmino exactitud est
aplicado a un conjunto de resultados de un ensayo, y supone una combinacin de
componentes aleatorios y un componente comn de error sistemtico o sesgo.
18
Dado que la exactitud depende de dos variables, dentro del plan de validacin
debe establecerse la forma de evaluacin. Para analizar la veracidad se puede
determinar el sesgo o el porcentaje de recuperacin, mientras que la precisin por
medio de repetitibilidad y reproducibilidad.
- Sesgo
- Recuperacin
19
- Precisin
a) Repetibilidad:
Es la precisin bajo las condiciones de repetibilidad, es decir, condiciones donde
los resultados de anlisis independientes se obtienen con el mismo mtodo en
tems de anlisis idnticos en el mismo laboratorio por el mismo operador
utilizando el mismo equipamiento dentro de intervalos cortos de tiempo. Se puede
determinar registrando a lo menos 6 mediciones bajo las mismas condiciones
(mismo operador, mismo aparato, mismo laboratorio y en corto intervalo de
tiempo) de un analito en un Material de Referencia. Calcular la desviacin
estndar (S) y el porcentaje de coeficiente de variacin (CV%). Gua Tcnica No.1
del ISPCH (2010).
b) Reproducibilidad:
Es la precisin bajo las condiciones de reproducibilidad, es decir, condiciones
donde los resultados de los anlisis se obtienen con el mismo mtodo en tem
idnticos de anlisis en condiciones diferentes ya sea de laboratorio, diferentes
operadores, usando distintos equipos, entre otros. Se puede determinar por medio
del coeficiente de Horwitz, o el valor de HorRat. El valor de HorRat es la razn del
coeficiente de variacin de las rplicas dentro del coeficiente de variacin de
Horwitz. Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010)
- Rango
20
En el extremo inferior del intervalo de concentracin, los factores limitantes son los
valores del lmite de deteccin y/o cuantificacin, depende del mtodo para que
estos sean el extremo inferior del rango.
- Robustez
La Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010), menciona que la robustez es una medida
de la capacidad del mtodo analtico de no ser afectado por variaciones pequeas
pero deliberadas de los factores del mtodo.
21
Inicialmente se deben identificar aquellos factores del mtodo que posiblemente
afectaran los resultados finales obtenidos a travs de este, Gua Tcnica No.1 del
ISPCH (2010).
( )
4
+ , + , +- , +. +/ , +0 , +1 , +2
4
Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010).
22
De este modo se puede conocer el efecto de cada variable. En este sentido,
cuanto mayor sea la diferencia de los resultados entre el valor mayor y el valor
menor, mayor influencia tendr dicha variable en el mtodo analtico.
23
- Incertidumbre
- Muestreo
- Efectos de la muestra: tipo de matriz, almacenamiento, entre otros.
- Sesgos Instrumentales: Las debidas a las caractersticas de los equipos
utilizados para realizar las medidas tales como: resolucin, magnitudes de
influencia.
- Analista: las debidas a la serie de mediciones: variaciones en
observaciones repetidas bajo condiciones iguales.
- Condiciones de medicin: las debidas al certificado de calibracin: en l se
establecen las correcciones y las incertidumbres asociadas a ellas, para un
valor de k (factor de cobertura) determinado, en las condiciones de
calibracin.
- Mtodo (por ejemplo, al interpolar en una recta), tablas (por ejemplo, las
constantes), pesada, alcuota, efectos computacionales. Gua Tcnica No.1
del ISPCH (2010
Para este fin se deber realizar una evaluacin de las incertidumbres tipo A y B
que estn presentes en el mtodo:
24
- Evaluacin de incertidumbre tipo B: evaluacin de un componente
incertidumbre de la medicin realizada por otros medios distinto a los del
tipo A. Ejemplos: La evaluacin basada en la informacin, obtenidos a partir
de un certificado de calibracin. Gua Tcnica No.1 del ISPCH (2010).
25
Figura No.3 Componentes del cromatgrafo lquido de alta resolucin
- Instrumentacin
a) Bomba
Skoog (2007), menciona que existen tres tipos de bombas: de tipo jeringa
impulsada con tornillo, las bombas de vaivn u oscilantes y las bombas
neumticas o de presin constante. Las de tipo jeringa producen una salida no
pulsada cuya velocidad de flujo se controla con facilidad, de baja capacidad de
250ml, por lo tanto no son apropiadas con cambios en los disolventes.
26
Las bombas de vaivn son las ms utilizadas. Consisten en una pequea cmara
cilndrica que se llena y se vaca con el movimiento oscilante de un pistn. El
movimiento de la bomba produce un flujo pulsado que debe atenuarse despus.
Una de sus ventajas es que tiene un volumen interno pequeo, una presin de
salida alta hasta de 10,000psi, fcil adaptacin a la elucin en gradiente y una
velocidad de flujo constante, Skoog (2007).
- Columnas
27
El empaquetamiento ms comn se prepara con partculas de slice, que se
sintetizan por aglomeracin de partculas submicrnicas de slice en condiciones
que producen partculas ms grandes y de dimetro muy uniforme.
Las partculas resultantes suelen cubrirse con pelculas orgnicas finas, que se
enlazan qumica o fsicamente con la superficie. Tambin existen columnas
empacadas de almina, de polmeros porosos o resinas de intercambio inico,
Skoog (2007).
Para asegurar que los lquidos que ingresen a la columna estn libres de
contaminantes o partculas que desgasten la columna, se colocan precolumnas,
en las cuales su composicin de empaquetamiento es similar a la de la columna
analtica, pero con un tamao de partcula mayor para minimizar la cada de
presin. Skoog (2007).
- Detectores
28
Existen dos tipos de cromatografa muy importantes, los cuales dependen de la
polaridad de la fase mvil y de la fase estacionaria. Se encuentra la cromatografa
en fase normal, donde la fase estacionaria es polar y la fase estacionara es no
polar. En la cromatografa en fase reversa ocurre lo contrario, la fase estacionaria
es no polar, en muchos casos hidrocarburos, mientras que la fase mvil es un
disolvente relativamente polar como el agua, metanol, acetonitrilo o
tetrahidrofurano. Skoog (2007).
1.2.13 Vitamina A
Segn Gil (2010), la vitamina A es un trmino genrico que se utiliza para describir
a los compuestos que presentan la actividad biolgica del retinol, como los
retinoides y los carotenoides con actividad provitamnica A.
29
La vitamina A fue la primera vitamina en ser definida; en 1915 la vitamina fue
denominada por McCollum y Davis factor liposoluble A, atribuyndole como
propiedad principal la estimulacin del crecimiento. En 1920 Drummond le asign
el trmino Vitamina A, aunque no fue aislada hasta 1937 por Morton.
De acuerdo a Gil (2010), en 1930 Moore mostr que la molcula del beta caroteno
presentaba actividad vitamnica A y desde entonces hasta ahora han sido
numerosas las funciones fisiolgicas que se le han atribuido, tanto al beta
caroteno como al resto de compuestos englobados en la denominacin de
vitamina A.
Las formas con mayor actividad fisiolgica son el retinal y el cido retinoico. En los
vegetales no existe como tal, pero s sus provitaminas o precursores carotenoides,
de los cuales existen ms de 500, siendo el ms importante el -caroteno. En la
conversin del -caroteno en vitamina A, ocurren reacciones de oxidacin-
reduccin, transformndose en retinal, luego en retinol, para finalmente
almacenarse en el hgado como palmitato. En teora, la ruptura enzimtica de los
dos carbonos centrales en la mucosa intestinal liberara dos molculas de retinal,
sin embargo en la prctica esta transformacin no se logra totalmente y slo se
alcanza el 50% de efectividad, Badui (2006).
30
- Carotenoides con estructura de hidrocarburos o carotenos, que no
contienen oxgeno.
Gil (2010), menciona que tanto los retinoides como los carotenoides son
liposolubles, y por lo tanto solubles en la mayor parte de solventes orgnicos.
- Fuentes de alimentacin
31
En el mundo la mayor pare de vitamina A alimentaria la aportan carotenoides. Las
zanahorias, sopas de verduras, vegetales de hojas verdes y mixtas, espinaca,
ensalada verde, jugo de naranja, camote, estofado de res y el meln constituyen
las 10 fuentes mximas de provitamina A. Mahan y Escott (2001).
1.2.14 Guayaba
32
Segn indica Geilfus (1994), la guayaba se utiliza comercialmente en forma de
jaleas, mermeladas, dulces y dems conservas. La pulpa adquiere a veces un
color rojo al cocinarse. Tambin se preparan bebidas enlatadas, sorbetes, helados
o tartas. La madera de su rbol es adecuada para herramientas, adems de ser
utilizada como lea y en preparacin para carbn. Las hojas tienen propiedades
medicinales en particular contra la diarrea y la gastroenteritis.
33
Se propaga por semillas, las cuales conservan su poder germinativo durante un
ao. O bien por acodos, el cual es el mtodo ms fcil y ms utilizado para
reproducir variedades mejoradas, donde se escogen ramas de 1cm de dimetro o
ms, y se retira un anillo de corteza de 2.5cm de ancho, y luego se sigue un
proceso de germinacin adecuado. Geilfus (1994).
34
1.2.15 Guayaba Fresa
35
Se determinaron 204 compuestos en el concentrado del aroma de la guayaba
fresa, en mayor cantidad: etanol, alfa-pineno, (Z)-3-hexenol, (E)-beta-cariofileno y
cido hexadecanico. Investigaciones han determinado que el extracto de la hoja
contiene metabolitos secundarios que tienen propiedades antimicrobianas.
Fuente:FAO (2006)
36
II. Planteamiento del problema
Dentro de sus requisitos la norma solicita que los mtodos utilizados sean
validados, la validacin es necesaria al implementar una nueva metodologa
dentro de un laboratorio de ensayo. Dependiendo de la procedencia de la
metodologa as ser el grado de validacin. Una metodologa desarrollada por el
laboratorio, deber cumplir con una validacin completa, evaluando todos los
parmetros de desempeo que el mtodo requiera.
37
Luego de validar el mtodo, se procedi a determinar el contenido de Vitamina A
en Guayaba Fresa (Psidium Cattleianum), debido a que no existen antecedentes
nutricionales en el pas. Por ser un fruto poco conocido, no existen datos de
consumo y produccin en el pas, esta investigacin es una iniciativa para la
explotacin e investigacin de la Guayaba Fresa.
38
2.1 Objetivos
2.2 Hiptesis
2.2.1 Nula
- La Guayaba Fresa posee un contenido de Vitamina A mayor o igual que la
Guayaba Blanca.
2.2.2 Alterna
- La Guayaba Fresa posee un contenido de Vitamina A menor que la
Guayaba Blanca.
2.3 Variables
39
2.3.2 Variables Dependientes
Parmetros estadsticos para validar el mtodo analtico:
- Selectividad
- Linealidad
- Lmite de deteccin
- Lmite de cuantificacin
- Precisin
- Exactitud
- Rango
- Robustez
- Incertidumbre
- Contenido de Vitamina A en el material de referencia
- reas de respuesta del estndar de referencia
40
- Diluciones del estndar de referencia: accin de diluir con el fin de disminuir
la concentracin de una disolucin aadiendo disolvente. Real Academia
Espaola.
41
- Incertidumbre: parmetro que caracteriza la dispersin de los valores que
podran ser razonablemente atribuidos al mensurando. EUROCHEM (2005).
- Contenido de Vitamina A en Material de Referencia: unidades equivalentes
de Retinol presentes por gramo del material de referencia. Gil. (2010.)
- reas de respuesta del estndar de referencia: integracin electrnica en
donde un dispositivo digitaliza la seal analgica proporcionada por el
detector, detecta el comienzo y el final de cada pico cromatogrfico, integra
digitalmente el rea bajo la curva y corrige automticamente la lnea base.
Conceptos fundamentales de cromatografa (2014).
42
- Lmite de deteccin (LDD): concentracin ms baja de Retinol que se puede
detectar con el mtodo utilizado.
- Lmite de cuantificacin (LDC): concentracin ms baja de Retinol que se
puede identificar y calcular.
- Precisin: representa la dispersin de los datos en una serie de
repeticiones, la cual puede ser determinada por medio de repetibilidad y
reproducibilidad.
- Exactitud: dispersin de datos respecto a un mismo analista y comparando
con un valor de referencia, analizando una serie de repeticiones para la
frmula infantil.
- Rango: la concentracin ms baja y alta que se lograr cuantificar por
medio del mtodo de cuantificacin de Vitamina A.
- Robustez: dispersin de los datos, luego de realizar interferencias
deliberadas para evaluar posibles cambios en el resultado final del anlisis
de Vitamina A.
- Incertidumbre: errores aleatorios que se puedan medir dentro de todo el
proceso de cuantificacin de Vitamina A, desde el pesado de la muestra
hasta la lectura final.
- Contenido de Vitamina A en material de referencia: cantidad medida en
*ugER/100g de Vitamina A en el material de referencia que se analiz por
medio del mtodo cuantitativo.
- reas de respuesta del estndar de referencia: reas obtenidas a partir de
las diferentes diluciones del estndar, y de las muestras problema, las
cuales son proporcionales al analito presente en las muestras analizada.
43
2.5 Alcances y Lmites
Alcances
44
Lmites
45
2.6 Aporte
46
III. Mtodo
Sujetos
- Personas que tienen experiencia en el campo de estudio: Lic. Ana Luisa
Mendizbal (Investigador Laboratorio de Instrumentacin Qumica Analtica,
Centro de Ingeniera, Bioqumica, Instituto de Investigaciones, Universidad
del Valle de Guatemala. Lic. Gabriela Zelada (Proyectos de documentacin
para la acreditacin bajo la Norma ISO 17025).
Unidades de Anlisis
- Instituto de Salud Pblica de Chile
Gua Tcnica para la Validacin de mtodos y clculo de incertidumbre,
elaborada con la supervisin del Sr. Leonardo Merino de la National Food
Administration de Suecia.
- OGA
Oficina Guatemalteca Acreditacin, en su poltica: OGA-GEC-016 Poltica
de Seleccin y Validacin de Mtodos de Ensayo.
- Norma ISO 17025, Requisitos generales para la competencia de
laboratorios de ensayo y calibracin
Norma bajo la cual se tomaron los nueve parmetros para validar el
mtodo, para cumplir con los requisitos de acreditacin.
- AOAC
Metodologas internacionales y normalizadas como gua para el diseo del
mtodo de cuantificacin de Vitamina A.
- Metodologa para la cuantificacin de Vitamina A, por cromatografa lquida
de alta resolucin con detector UV, la cual fue evaluada para confirmar su
validez.
47
- Valores Nutritivos de los Alimentos de Centroamrica, Primera y Segunda
Seccin 1996, Oficina Panamericana de la Salud (OPS), Instituto de
Nutricin de Centro Amrica y Panam (INCAP).
- Acetato de Retinol, material de referencia certificado para la cuantificacin
de Vitamina A, se utiliz como estndar de referencia para el estudio de
linealidad, selectividad, repetibilidad, reproducibilidad, lmite de deteccin y
cuantificacin, y rango.
- Frmula infantil, muestra de referencia para la cuantificacin de Vitamina A,
utilizada para la evaluacin de los parmetros de selectividad, sesgo y
robustez.
- Guayaba fresa, muestra problema con ausencia de datos histricos de su
contenido de vitamina A.
- Guayaba Blanca, dato de referencia para comparar el contenido de
vitamina A con la guayaba fresa.
- Cromatogramas, de los cuales se obtuvieron los valores de rea y tiempo
de retencin para identificar y cuantificar el retinol en las muestras
analizadas.
48
3.2 Instrumentos
49
Licuadora Oster, Modelo:blender
clasic
50
Sistema de Hp Compac,L1506.
Computo Software
ChemStation.
ChemStation.(1999-
2003)
Cristalera
Erlenmeyer
Pipetas
E. 1ml0.01ml
51
Balones aforados
F. 250.3ml
I. 50.025ml
Probetas
J. 1000.1ml Probetas de material tipo pyrex,
utilizadas para medir los diferentes
K. 500.01ml volmenes de los solventes.
Viales
Viales mbar para almacenar la
L. 5ml
muestra extrada de vitamina A.
52
Ampolla de decantacin
- 250ml
Mortero y Pistilo
53
Frascos de dilucin
- 500ml
- 500ml
54
Tabla No.6 Otros materiales
Otros materiales
A. Pesa muestras
B. Esptula
C. Filtro Albet-NY-045-47-BL
D. Econofilter, Regen,Cellulose 25/0.45m
E. Jeringas estriles plsticas
F. Jeringa para HPLC, de 50L
55
3.3 Procedimiento
Homogenizacin de muestras
Preparacin de soluciones
56
Preparacin de estndar
- Pesar en un erlenmeyer de acetato de retinol, con una exactitud de 0.001g
- Adicionar etanol, Pyrogallol, y por ltimo la solucin de Hidrxido de
Potasio.
- Mezclar la solucin, cubrir con papel aluminio todo el erlenmeyer.
- Ebullir durante 30min, cuidando que no se evapore la solucin. Luego
enfriar a temperatura ambiente.
- Trasvasar la solucin saponificada a una ampolla de decantacin, tambin
cubierta con papel aluminio, lavar el erlenmeyer con agua destilada. Luego
adicionar hexano, cerrar cuidadosamente la ampolla, liberar
constantemente el gas con la perilla,
- Luego de la extraccin, dejar separar la fase acuosa y orgnica. Descartar
la mayor parte de la fase acuosa.
- Colocar en un Erlenmeyer de 50ml sulfato de sodio anhidro. Trasvasar la
fase orgnica al recipiente con el agente secante.
- La solucin que se reciba filtrarla en una jeringa estril, con un filtro
Econofilter,Regen.Cellulose 25/0.45um , y recibir en un vial mbar. Guardar
en refrigeracin si no se va utilizar inmediatamente.
- Preparar las soluciones del estndar para la curva de calibracin, con las
concentraciones de 10gER/ml, 7.5gER/ml, 5gER/ml, 2.5gER/ml,
1gER/ml, 0.1gER/ml.
Preparacin de muestras
Material de referencia
- Pesar 4.3g de la muestra ya homogenizada a temperatura ambiente, en un
erlenmeyer de 250ml. Adicionar agua desmineralizada.
Muestra problema
- Pesar 10g de la muestra ya homogenizada a temperatura ambiente, en un
Erlenmeyer de 250ml. Adicionar agua desmineralizada.
- Adicionar etanol, Pyrogallol, y por ltimo la solucin de Hidrxido de
Potasio.
57
- Mezclar la solucin, cubrir con papel aluminio todo el erlenmeyer.
- Ebullir durante 30min, cuidando que no se evapore la solucin. Luego
enfriar a temperatura ambiente.
- Trasvasar la solucin saponificada a una ampolla de decantacin, tambin
cubierta con papel aluminio, lavar el erlenmeyer con agua destilada. Luego
adicionar hexano, cerrar cuidadosamente la ampolla, liberar
constantemente el gas con la perilla,
- Luego de la extraccin, dejar separar la fase acuosa y orgnica. Descartar
la mayor parte de la fase acuosa.
- Colocar en un Erlenmeyer de 50ml sulfato de sodio anhidro. Trasvasar la
fase orgnica al recipiente con el agente secante.
- La solucin que se reciba filtrarla en una jeringa estril, con un filtro
Econofilter,Regen.Cellulose 25/0.45um , y recibir en un vial mbar. Guardar
en refrigeracin si no se va utilizar inmediatamente.
58
3.4 Diseo y Metodologa estadstica
59
- Veracidad: se realizaron 6 corridas con el material de referencia y se
determin el sesgo entre el valor reportado y el valor determinado por
medio del mtodo analtico.
- Repetibilidad del mtodo: se realizaron 6 repeticiones bajo las mismas
condiciones, concentracin de estndar, analista, equipo, realizando los
anlisis durante la misma semana.
- Reproducibilidad: se realizaron 6 repeticiones con la muestra de referencia,
en dos das diferentes con diferente analista cada da. La concentracin del
material de referencia fue constante para los dos das, analizando la
muestra desde el inicio de la saponificacin y extraccin, hasta la lectura en
el cromatgrafo lquido de alta resolucin.
60
3.4.3 Descripcin de las unidades experimentales
- Concentracin del material de referencia certificado, Acetato de Retinol, que
se variar dependiendo del parmetro que se quiera analizar.
61
3.4.5 Metodologa de anlisis
Dnde:
&=Media
' =Sumatoria de los datos obtenidos.
n= Nmero de lecturas o valores observados.
' &
1
!"2"
3.29 "
LC=Valor crtico
LDD=Lmite de deteccin
S=Desviacin estndar
&=Media
' =Datos obtenidos de cada lectura
n= Nmero de lecturas o valores observados.
62
Experimento No.3, Lmite de cuantificacin
Se determin calculando el producto de la desviacin estndar del experimento
No.2 por 10. Canadian Health Protection Branch (CHPB), Establece que el lmite
de cuantificacin es el mejor estimado de una concentracin baja, que derive en
una desviacin estndar relativa de aproximadamente 10%, en, al menos, seis
rplicas.
LDC = 10 S
| | 2
1
Dnde:
tcritica= Valor del estimador t Student crtico, para = 0.05 y n-2
tr = Valor del estimador t Student obtenido para el coeficiente de correlacin
|r| = Valor absoluto del coeficiente de correlacin
63
n 2 = Nmero de grados de libertad, Se estable n-2 debido a que se conoce la
media y desviacin, perdiendo dos grados de libertad.
r2 = Valor del coeficiente de determinacin.
- Sesgo
& &
6
/
Fuente: Skoog (2007)
Dnde:
tcalc= t calculado
Xa=Valor medio asignado al material de referencia
X=Valor medio de todas las lecturas realizadas
S= Desviacin estndar de las lecturas obtenidas
n= Nmero de lecturas o valores observados
64
Para evaluar el sesgo, se realiz la prueba t, en la cual el tcalc < tcrit. Buscar t-
Student terico en la Figura de Anexos No.9 para un nivel de confianza de 95%,
con (n-1) grados de libertad debido a que se conoce la media, perdiendo un grado
de libertad.
- Precisin
!8
@A B)
!89: ; <
Dnde:
CVHorwitz=Coeficiente de variacin de Horwitz.
CV=Coeficiente de variacin de las mediciones realizadas.
C=Concentracin del analito expresada en decimales.
Experimento No.7, Robustez
+ , +- + , +.
C D 2
2
65
La matriz para las repeticiones ser la siguiente, donde + representa los valores
altos, y los valores bajos.
A B
1 + + Y1
2 - + Y2
3 + - Y3
4 - - Y4
A=Tiempo de saponificacin
B=Tiempo de desgasificacin
& &
J
:EF G H I
I
66
n2=Nmero de rplicas por el analista No.2
La tcrtica se determin con un nivel de confianza del 95%, para dos colas con n-2
grados de libertad dejando fijos los valores de desviacin y media.
K
CENAM (2010)
Se fij el error de la balanza por ser importante el peso de la muestra para realizar
los clculos posteriores, y la pipeta debido a que la cantidad de analito recuperado
puede variar con la cantidad de solvente hexano que se agregue.
67
Distribucin triangular para determinar la incertidumbre estndar de la medicin
del volumen de 10ml:
)/2
K
6
CENAM (2010)
Distribucin rectangular para la determinar la incertidumbre estndar de la
medicin de la cantidad de gramos de muestra:
)
K
2
K K K- K.
K 8 MC D , C D , C D , C D
:EF G
8 8 8- 8.
CENAM (2010)
CENAM (2010)
68
Figura No.7 Diagrama de Ishikawa para evaluar las posibles causas de la
incertidumbre del mtodo
69
IV. Presentacin y Anlisis de resultados
Homogenizar
muestra
Preparacin de
pyrogallol en etanol
Enfriar a temperatura
ambiente, trasvasar a
una ampolla de
decantacin
70
Lectura en el
equipo HPLC
Abrir el programa
ChemStation, colocar
Abrir la vlvula de purga
en el mtodo de
Vitamina A
Activar la bomba
durante 15 min.
Desactivar la bomba, y
cerrar la vlvula de
purga.
71
Limpieza del
equipo
Desactivar la bomba, y
cambiar el frasco de
fase mvil por el de
limpieza
72
4.2 Diagrama del proceso de validacin
Validacin del
mtodo analtico
Determinar el mtodo
para validar, verificar el
procedimiento
Determinar los
parmetros para evaluar
Seleccionar la matriz y
el material de referencia
Determinar la
selectividad con un
blanco, material
certificado y referencia.
73
Evaluar la linealidad con
6 repeticiones y 6
puntos para realizar la
curva
Medir reproducibilidad y
repetibilidad con el
material certificado 6
veces con dos analistas
Determinar la robustez
del mtodo cambiando
3 variables
74
4.3 Parmetros de Desempeo
75
Grfica No.1 Determinacin de la Curva de Calibracin, para evaluacin de la
linealidad del mtodo
Concentracin de Acetato de
Retinol vrs rea
1400.00
1200.00
1000.00
rea(mAU)
800.00
600.00 y = 125.64x + 1.3933
R = 0.9999
400.00
200.00
0.00
0 2 4 6 8 10 12
Concentracin de Acetato de Retinol (ppm)
76
Tabla No.13 Reproducibilidad
Corrida Concentracin de Acetato de Retinol
(gER/ml)
1 10.07
2 9.93
3 10.00
4 10.04
5 9.97
6 10.30
Media 10.05
Desviacin estndar 0.13
CV% 1.30
CV Horwitz 11.31
Factor HorRat 0.12
77
Tabla No.16 Datos calculados para la determinacin de la robustez
Contenido de Vitamina A
Corrida en frmula para
lactantes gER/100g
1 446.34
2 438.23
3 405.89
4 401.45
Media 422.98
Desviacin estndar 22.61
2 5.85
& '
Valor 38.62 1.83
78
Tabla No.20 Incertidumbre para la determinacin de vitamina A en Guayaba Fresa
Media 39.60 gER/100g
Desviacin estndar 2.14 gER/100g
Incertidumbre 1.37 gER/100g
combinada
Incertidumbre expandida 2.73 gER/100g
79
V. Discusin
80
El tiempo y temperatura de saponificacin tambin fueron vitales, si no se realizaba
en 30 min y a 70C se poda incurrir en prdidas del analito, ya que la vitamina se
encuentra disuelta en los lpidos del alimento, al no saponificar completamente, la
vitamina no se encuentra libre para ser extrada con el solvente apropiado. La
vitamina ms los lpidos saponificables fueron extrados por medio de una
extraccin lquido-lquido con hexano el cual es un solvente apolar, afn a la
vitamina, esta fue la segunda etapa importante dentro de la cuantificacin de
vitamina A.
81
Tambin se debe resaltar que tanto el estndar como la frmula infantil se
saponificaron para determinar el contenido de Vitamina A bajo las mismas
condiciones y como se mencion anteriormente, la saponificacin y extraccin son
parte fundamental del anlisis, es por esto que se realiz todo el procedimiento de
la misma forma.
82
Dentro del comportamiento y limitantes del equipo cromatogrfico, los picos que se
mostraron fueron definidos sin interferencias, variando levemente en cada corrida
por la fase mvil, o la forma de inyeccin. Para establecer el tiempo de retencin se
realizaron 6 corridas de la curva de calibracin, la cual se hizo con 6
concentraciones diferentes para lograr determinar la linealidad del mtodo. Las
repeticiones se realizaron en tres das diferentes ya que el equipo no cuenta con
inyector automtico, limitando el tiempo la cantidad de repeticiones por da.
Con los datos obtenidos se determinaron las reas promedio para cada
concentracin (10 gER/ml, 7.5 gER/ml, 5 gER/ml, 2.5 gER/ml, 1 gER/ml, y
0.1 gER/ml), y con ellos se grafic la curva de calibracin (Ver Grfica No.1),
determinando la ecuacin de la recta por medio de Excel, y=125.64x+1.3933, con
un coeficiente de correlacin de 0.999, el cual se encuentra dentro del rango
aceptable para establecer que es lineal, de acuerdo a lo mencionado en la Gua
No.1 del ISPCH (2010). Adems de comprobar la linealidad con la ecuacin y el
coeficiente de correlacin, se determin la prueba de t de Student, se plante como
hiptesis nula que no existe correlacin entre x,y, si el valor de t calculado era
mayor al t crtico se rechazaba la hiptesis, afirmando la correlacin significativa.
Como se observa en la Tabla No.10, la t calculada fue mayor que la crtica,
rechazando la hiptesis nula, aceptando la correlacin de x,y.
83
El mtodo tambin es preciso y exacto, la precisin se determin por medio de la
evaluacin de la reproducibilidad y repetibilidad. Para la determinacin de
repetibilidad se realizaron 6 corridas con el estndar de referencia, para una misma
concentracin de 10 ER/ml, con un mismo analista.
La exactitud se determin por medio del sesgo, evaluando la frmula infantil, la cual
reporta en su etiqueta un valor de referencia para vitamina A de 450 ER/100g, de
acuerdo a la Tabla No.14, se obtuvo un valor medio de 444.89 ER/100g, con una
desviacin de 4.14. Se determin el valor de t comparando con el valor de
referencia, para este caso se acept el valor medio, al obtener una t mayor a la t
crtica, esto lo indica en Skoog (2007). Se debe resaltar que el valor medio del
contenido de vitamina A en la frmula infantil fue menor al de referencia, pero de
acuerdo al Reglamento Tcnico Centroamericano (67.01.60:10), el valor reportado
en el etiquetado nutricional para micronutrientes, debe al menos contener el 80% de
este valor, por lo que se acepta el valor obtenido pues representa el 98.86% del
84
valor reportado en la etiqueta. Adems se investig el valor de recuperacin que
maneja la empresa productora de la frmula infantil, la cual es del 85%,
comprobndose con dicho valor que el mtodo es apropiado para este tipo de
matriz, al obtener un porcentaje de recuperacin mayor.
85
El tiempo de desgasificacin no mostr sensibilidad como se observa en la Tabla
No.17, siendo el tiempo de desgasificacin un factor que no influye en el mtodo.
La incertidumbre del mtodo se determin por medio de dos tipos de errores, tipo A
y tipo B, el tipo A es aleatorio y se puede medir por medio de repeticiones y
estudios estadsticos, el tipo B se determina por medio de datos puntuales que el
fabricante aporta por medio de calibraciones de los equipos e instrumentos. Para el
caso de esta metodologa el tipo de error A se determin con las 6 repeticiones de
las ecuaciones de la curva de calibracin y con las 6 repeticiones para la medicin
de vitamina A en la frmula infantil. El error B se determin por medio del error
aportado por la balanza y la pipeta empleadas. En total se determinaron 4
incertidumbres las cuales al combinarse dio un resultado de 2.50 gER/100g y una
incertidumbre expandida de 4.99 gER/100g, esto para la medicin de la vitamina A
en la formula infantil. Para la guayaba fresa la incertidumbre combinada fue de 1.37
gER/100g y la incertidumbre expandida de 2.73 gER/100g. La incertidumbre
expandida se determin con un factor de cobertura de k=2, para obtener un nivel de
confianza del 95%.
86
matriz vegetal la cual contiene diversos carotenoides, algunos con actividad de
vitamina A. El presente mtodo no incluye la deteccin de carotenoides, debido a
que por su estructura pueden tener otro comportamiento con la fase mvil, fase
estacionaria y longitud de onda, adems de no ser comparable con el estndar de
acetato de retinol. El anlisis de los carotenoides no se encuentra dentro del
alcance de este estudio.
87
VI. Conclusiones
88
VII. Recomendaciones
89
VIII. Referencias bibliogrficas
91
IX. Anexos
92
Tabla No.23 Datos originales para la determinacin de Reproducibilidad
rea
Corrida
Acetato de Retinol
1 1267.00
2 1249.20
3 1257.50
4 1263.20
5 1253.40
6 1295.00
*Nota: Todos los valores de rea para cada muestra corresponden al valor
promedio obtenido de todas las inyecciones realizadas, adems de ser
adimensionales.
93
9.1 Muestra de Clculo
W
0.010W (XY ) A ZY BY [ A\
286.45 BY [ A\
]A\ 0.00872W BY [ A\
W
328.5 (XY ) A ZY BY [ A\
]A\
- Conversin de g a g
1,000,000W
0.008721W BY [ A\ 8,720W BY [ A\
1W
- Concentracin de acetato de retinol expresado en equivalentes de retinol
ER
94
8! 8!
V1=x
C1=872 gER/ml
V2=25ml
C2=10 gER/ml
25]\ 10gER/ml
8 0.29]\
872gER/ml
242.60 1.3933
!A XY )X[ ZY 8[ )][ ) ( 1.92gER/ml
125.64
gER ! i
!A Y [ZA ZY 8[ )][ ) ( 100
100g ]
Dnde:
C=Concentracin de vitamina A en gER/ml
F=Factor de dilucin, para este caso siempre se diluy en 10ml de hexano.
m=Cantidad en gramos de la muestra analizada.
pqrs
jklm n .o v =E6
tu
!A Y [ZA ZY 8[ )][ ) ( 100 446.38WaB/100W
==k ..-= ->
95
*El mismo procedimiento se realiz para determinar el contenido de vitamina A en
la frmula infantil y el la guayaba fresa, cambiando la cantidad en gramos de
muestra.
| | 2
1
Fuente: ISPCH (2010)
Dnde:
tr = Valor del estimador t Student obtenido para el coeficiente de correlacin
|r| = Valor absoluto del coeficiente de correlacin
n 2 = Nmero de grados de libertad
r2 = Valor del coeficiente de determinacin.
|0.999|6 2
63.23
1 0.999
5 & &
s=sesgo
x=Valor obtenido en cada medicin
96
5 448.32WaB/100W 450WaB/100W 1.68WaB/100W
450wW/100W 444.89wW/100W
6 3.02
wWaB
4.14 /6
100W
1.29
@A B) 0.12
11.31
97
- Clculo de robustez por medio del test de Youden y Steiner y la diferencia
de medias entre dos analistas
Se determin el promedio de cada variacin, con el valor alto y el valor bajo, de los
valores obtenidos del contenido de vitamina A en una muestra de frmula infantil,
ejemplo para el factor del tiempo de saponificacin:
10.04 10.05
0.14
6,6
0.12H
6"6
Fuente: Skoog (2007)
Dnde:
X1=Media del analista No.1
X2=Media del analista No.2
Scombinada=Desviacin estndar combinada. (Calculada por medio del programa
Excel)
n1=Nmero de rplicas por el analista No.1
n2=Nmero de rplicas por el analista No.2
98
- Clculo de t para la prueba de hiptesis del contenido de vitamina A en
guayaba fresa.
& K
Dnde:
X=Media o valor determinado
u=Media obtenida del valor terico
S=Desviacin de los valores obtenidos
n=Nmero de repeticiones de los datos obtenidos
39.60WaB/100W 32WaB/100W
6.14
2.14WaB/100W
3
*Nota: Los valores del promedio, desviacin estndar y coeficiente de variacin
para cada repeticin fueron determinados por medio del programa Excel.
- Clculo de incertidumbre
gER ! i
!A Y [ZA ZY 8[ )][ ) ( " 100
100g ]
Dnde:
C=concentracin de vitamina A, en gER/ml
F=Factor de dilucin
m=Cantidad en gramos de muestra
99
Para determinar la incertidumbre aportada por la concentracin se calcul el error
a partir de la ecuacin de la recta, a partir de las 6 repeticiones para la evaluacin
de la linealidad del mtodo, siendo un error tipo A.
Incertidumbre de pendiente:
KON GN N
0.85
KON GN N 0.349
6
Incertidumbre de ordenada:
K: GN G
1.79
K: GN G 0.726
6
100
- Propagacin de error para la concentracin:
0.0001W
KF 6 < 0.00005W
2
0.02]\/2
KO ON 0.000408]\
6
gER
4.14 gER
100g
K NON F 6 G G 1.6901
6 100g
101
- Incertidumbre combinada
gER gER
gER 0.00785 0.00005W 0.00408]\ 1.6901
ml ~ , C 100g
K :EF G 444.89 " |} D ,C D ,
100g gER 4.3008W 10]\ gER
1.91 444.89
ml 100g
gER
K :EF G 2.4961
100g
Incertidumbre expandida:
gER
KN O GG 2 " 2.4961
100g
102
9.2 Glosario
Acetato de retinol: ester del retinol, (Vitamina A), polvo cristalino amarillo, punto de
fusin (57C-60C), 328.5g/mol. Sche. (2014).
103
Decantacin: transferencia del lquido sobrenadante y las aguas de lavado desde
un recipiente hacia un filtro sin alterar el slido precipitado en el recipiente. Skoog
(2007).
Fase mvil: en cromatografa, un lquido o gas que transporta los analitos a travs
de una fase estacionaria slida o lquida. Skoog (2007).
104
Test t: prueba estadstica que se emplea para decidir si un valor experimental es
igual a un valor terico conocido, o si dos o ms valores experimentales son
idnticos con un nivel dado de confianza, se utiliza con la desviacin estndar y la
media. Skoog (2007).
105
Figura No.10 Tabla de datos para la distribucin normal t-Student, dos colas
106
Figura No.11 Diagrama de Flujo para realizar el procedimiento de validacin
107
Figura No.12 Cromatograma para la concentracin de 10gER/ml
108
Figura No.14 Cromatograma para la concentracin de 5gER/ml
109
Figura No.16 Cromatograma para la concentracin de 1gER/ml
110
Figura No.18 Cromatograma para el blanco
111