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Medicin del crecimiento microbiano

Recuento directo y densitometra


Aguilar Danny, Arratea Rosario, Gallegos Jacob, Guerra Rubn
Huaman Alex, Torpoco Elas, Nieto Patricia
EP Ingeniera Ambiental
UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
Universidad del Per, DECANA DE AMRICA
Lima, Per

I. Introduccin cuya superficie de vidrio est marcada una rejilla con


pequeos cuadrados de rea conocida. (Biologa de
En el pasado informe, se hizo un anlisis de los microorganismos, 2009)
microorganismos para evaluar la calidad del agua. En
el presente paper, se ver el recuento de El mtodo indirecto, en cambio, se basa en la
microorganismos de muestras especficas, bajo medida de algn parmetro de cultivo que nos permite
mtodos de cuantificacin aprobados. deducir la informacin sobre la evolucin del nmero
de microorganismos. Entre los mtodos indirectos,
En microbiologa, la palabra crecimiento se define uno de los ms utilizados es la medicin de turbidez
como un incremento en el nmero de clulas. La de los cultivos, o tambin llamado densitometra.
clula microbiana tiene un perodo de vida finito y la (Manual de Prcticas, laboratorio de Microbiologa
especie slo se mantiene como resultado del ambiental, 2004)
crecimiento continuo de la poblacin. Adems de la
comprensin de aspectos bsicos del crecimiento II. Descripcin del mtodo
microbiano, muchas situaciones prcticas hacen
necesario el control del crecimiento microbiano. El
conocimiento de cmo las poblaciones bacterianas A. Cmara de Neubauer
crecen rpidamente es muy til para el diseo de Se trata de una gruesa placa de cristal con forma
mtodos de control del crecimiento microbiano. de portaobjetos, de unos 30 x 70 mm y unos 4 mm de
(Biologa de los microorganismos, 2009) grosor. En una cmara simple, la porcin central, que
es donde se realiza el conteo, est dividida en 3 partes.
Existen diversos mtodos para evaluar el tamao En la parte central se encuentra grabada una retcula
de la poblacin bacteriana presente en una muestra cuadrangular. En el caso de cmaras dobles, que son
determinada, adecuados para diferentes organismos o las ms comunes, existen 2 zonas de conteo, una
diferentes situaciones. Algunos de ellos son directos y superior y otra inferior al eje longitudinal de la
otros indirectos, en funcin de que cuenten cmara. La retcula completa mide 3 mm x 3 mm de
microorganismos o calculen otros parmetros a partir lado. Subdividida a su vez en 9 cuadrados de 1mm de
de los cuales se puede inducir la magnitud de la lado cada uno.
poblacin microbiana. En esta ocasin, nos
enfocaremos en el recuento directo (mtodo directo) y Errores de hasta 20% y 30% son comunes con este
densitometra (mtodo indirecto). mtodo de recuento debido al pipeteo, a los errores
estadsticos por ser la muestra poco representativa,
El recuento directo es el ms frecuente para errores del volumen de muestra realmente introducido
determinar el nmero de clulas totales. El contaje en la cmara, etc. Sin embargo, el hematocitmetro o
microscpico directo se puede hacer en muestras cmara de Neubauer sigue siendo uno de los mtodos
secas sobre porta o en muestras lquidas. Las muestras ms ampliamente utilizados en los laboratorios de
secas se pueden teir para aumentar el contraste entre todo el mundo por ser econmico y de fcil
las clulas y el fondo. Con muestras lquidas se manipulacin. (Conteo celular con Hematocitmetro,
emplean cmaras de recuento especiales, que en 2015).
esencia son portas excavados y modificados sobre
vacunas. En 1907, McFarland desarroll una serie de
1. Materiales: soluciones de sulfato de bario para calcular
aproximadamente el nmero de bacterias en
Microscopio soluciones de turbidez equivalente, segn lo
Muestra de chicha de morada determinado por los recuentos en placa.
Cmara de Neubauer
Laminilla La realizacin de pruebas de sensibilidad requiere
Pipeta Pasteur el uso de inculos estndar. El patrn 0.5 de
McFarland se utiliza para la preparacin de inculos
2. Procedimiento: en dilucin de agar estandarizado, procedimientos de
macro y microdilucin de caldo, de difusin en disco
Tomar una alcuota de la muestra con ayuda de la y pruebas de sensibilidad para organismos anaerobios.
pipeta Pasteur de punta fina y depositar una gota Las normas de turbidez se preparan mezclando
evitando el exceso, cubrir con el cubre objetos, productos qumicos que generan precipitacin para
dejando que se expanda sin la formacin de formar una solucin de turbidez reproducible. Los
burbujas. Dejar reposar unos minutos y colocarlo patrones de McFarland se preparan aadiendo cido
bajo la cmara del microscopio. sulfrico a una solucin acuosa de cloruro de bario
que produce la formacin de un precipitado de sulfato
Observamos en objetivo 10X ubicando el de bario suspendido. (Patrn de turbidez BBL
cuadrado del centro de 1.0 mm, para luego pasar a preparado, 2005)
40X observando 25 cuadrados de 0.2 mm cada
uno que a su vez estn divididos en 16 cuadrados 1. Materiales
de 0.05 mm.
Tubos de la escala de McFarland.
La cuantificacin se realiza con el objetivo de
40X, contando el nmero de clulas que se Tubos con cultivos para E. Coli.
localizan en el cuadrado central 1x1 mm. Se
empieza a contar desde la parte superior hasta la Un cuadro con lneas de fondo, para ver la
base. Si la clula toca los lmites superior o turbidez.
izquierdo la clula debe contabilizarse, pero en
caso sea el lmite inferior o derecho, no se Nmero de clulas cuantificadas 95
contabiliza. Nmero de cuadrado 0.2 x 0.2 mm 5
analizado
Volumen de cada cuadrado 0.2 x 0.04 ml
0.2 mm

2. Procedimiento

Tabla 2. Composicin de la turbidez estndar de McFarland


Nmero Cloruro de cido Densidad de
de la bario di sulfrico bacteria
turbidez hidratado (1%) aproximada
estndar (1,175%) correspondiente
0.5 0.5 mL 99.5 mL 1 x 108
1 0.1 mL 9.9 mL 3 x 108
2 0.2 mL 9.8 mL 6 x 108
B. Estndares de turbidez de McFarland 3 0.3 mL 9.7 mL 9 x 108
4 0.4 mL 9.6 mL 12 x 108
5 0.5 mL 9.5 mL 15 x 108
Los patrones de McFarland se utilizan como 6 0.6 mL 9.4 mL 18 x 108
patrones de turbidez en la preparacin de 7 0.7 mL 9.3 mL 21 x 108
suspensiones de microorganismos. 8 0.8 mL 9.2 mL 24 x 108
9 0.9 mL 9.1 mL 27 x 108
Uno de los primeros usos de la turbidez fue para 10 1.0 mL 9.0 mL 30 108
clculo de poblaciones bacterianas fue la preparacin
El objetivo de este procedimiento es determinar el
nmero de bacterias por mL de fluido. 9
( )=
.
Se realiz una siembra de Escherichia Coli con
anterioridad, en un determinado agar favorable

para el crecimiento de esta bacteria. ( ) = . /

Se determin por observaciones macroscpicas Con los resultados ya listos, podemos concluir que
(turbidez) la presencia del desarrollo de colonias la cantidad de levadura por ml de la chicha morada
en el tubo de ensayo, donde se realiz el cultivo fermentada aproximadamente por 3 semanas es de
de la bacteria E. Coli. .7 2 . Esta cifra no es del 100% segura. Si bien
esta tcnica es la ms usada, an existe un 20 o 30%
Luego de verificar que hubo desarrollo de de error, especialmente al momento de contabilizar las
colonias, se pas a calcular la cantidad clulas o bien que la muestra usada no es
aproximada de U.F.C./mL (unidades formadoras representativa (para lograr que fuera representativa,
de colonias por mililitro), a travs de una homogenizamos antes de obtener el inculo). Adems
comparacin de turbidez entre el tubo de E. Coli poseemos el nmero de levaduras, pero no obtenemos
y los tubos de McFarland. el nmero de clulas viables.
Para realizar la comparacin, se recomienda que B. Estndares de turbidez de McFarland
sea de manera ordenada, ya sea ascendente o
descendente, es decir, compararlo desde el tubo En el mtodo de estndares de turbidez
de menor turbidez hasta el tubo de mayor turbidez de McFarland, al final de todo el procedimiento, se
o viceversa. lleg a la conclusin de que el tubo de ensayo con E.
Coli, posea una suspensin bacteriana equivalente en
Finalmente, al concluir la comparacin, se revis turbidez a la turbidez estndar de 0.5 de la escala de
la escala de McFarland y se pudo obtener una McFarland, con lo cual podemos afirmar que contiene
aproximacin de la densidad de bacterias que aproximadamente 8 bacterias por mL. Esto es
haba en el tubo de E. Coli. compatible, con el documento presentado por la BD
de patrn de turbidez BBL preparado, en el que nos
dice, que el patrn de 0.5 de McFarland corresponde
aproximadamente a una suspensin homognea de
Escherichia coli de 1,5 x 108 clulas por mL3.

IV. Discusin grupal


Qu es un organismo viable? Ser posible su recuento
en la cmara de Neubauaer?

Un microorganismo viable es aquel microorganismo


vivo y cultivable en los medios de cultivo y en
condiciones ambientales especficas. (Reglamento
Tcnico Mercosur para productos de uso domisanitario a
III. Resultados base de bacterias, 2006).

A. Cmara de Neubauer El recuento de microorganismos viables no sera


posible en la cmara de Neubauer, ya que este es de
En el primer procedimiento de Cmara de recuento directo. Segn guas de laboratorio, este
Neubauer, los resultados son los siguientes: mtodo es tedioso pero es una forma rpida de estimar la
carga microbiana de una muestra. A pesar de ello el
mtodo tiene algunas limitaciones el de no distinguir
( )=

clulas muertas y vivas. (Manual prctico de [6] MERCOSUR. (22 de Junio de 2006). Reglamento
microbiologa ambiental, 2007). Tcnico Mercosur para productos de uso
domisanitario a base de bacterias. Obtenido de:
Pero s se podra dar si se realiza previamente un
http://www.sice.oas.org/Trade/MRCSRS/Resoluti
mtodo de tincin de azul de metileno. Las clulas vivas
contienen enzimas capaces de reducir el azul de metileno a ons/Res2506.pdf
compuestos incoloros. Cuando las clulas estn inmersas
en azul de metileno, este penetra dentro de las clulas y las [7] Ramos M., & Chabela M.(2004). Manual de
enzimas de las clulas vivas lo decoloran. Las clulas Prcticas, laboratorio de Microbiologa
mueras, donde la enzima es inactiva, esto no ocurre y, por ambiental. Mxico: Universidad Autnoma
consiguiente, permanecen azul. Metropolitana.
Tambin existe la tincin por eritrosina. La eritrosina es
un colorante que puede ser utilizado en el recuento en
cmara en lugar del azul de metileno, que se usa
convencionalmente. Una de las ventajas de esta es su fcil
y rpida preparacin, no mancha los materiales ni el
microscopio, y permite observar mejores contrastes ente
clulas vivas y muertas. (Anlisis comparativo de
colorantes vitales en el estudio de la viabilidad de
levaduras, 2016).

V. Referencias

[1] Bastidas O. (2015). Conteo celular con


Hematocitmetro. Obtenido de:
http://www.celeromics.com/es/resources/docs/Arti
cles/Conteo-Camara-Neubauer.pdf

[2] Becton, Dickinson and Company. (Febrero de


2005). Patrn de turbidez BBL preparado.
Obtenido de:
http://www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/
US/8808421%280205%29_es.pdf

[3] Madigan M., Martinko J., Dunlap, P., & Clark, D.


(2009). Biologa de los microorganismos. Madrid,
Espaa: PEARSON EDUCACIN.

[4] Manacorda, A., Cuadros P., & Alvarez A. (2007).


Manual prctico de Microbiologa Ambiental I.
Buenos Aires: Universidad Nacional del Comahue
- Escuela Superior de Salud y Ambiente.

[5] Martinez J., Crdenas G. & Gusils C. (Junio de


2016). Anlisis comparativo de colorantes vitales
en el estudio de la viabilidad de levaduras.
Obtenido de:
http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_artt
ext&pid=S1851-30182016000100005