DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA

INGENIERA EN BIOTECNOLOGA
Biologa Molecular III

Nombres: Pozo Santiago, Quimbita Jairo, Ruperti Helen, Tupiza Miguel.

Fecha: viernes, 01 de diciembre de 2017

TEMA: Endonucleasa Sau3A

INTRODUCCIN:
Las enzimas de restriccin juegan un papel importante en la ingeniera gentica, pues
gracias a ellas ha sido posible la transgnesis, la creacin de los mapas de restriccin, la
electroforesis de DNA digerido, la produccin de fragmentos digeridos para producir
clones, entre otros (Tortora, Funke, & Case, 2007) (Curtis & Schnek, 2008). Por ello,
estudiar su origen, comportamiento y cules son sus principales aplicaciones en la
actualidad es clave para la manipulacin de las mismas as como para hacer la mejor
eleccin en el momento de comprar endonucleasas de restriccin. En el presente
documento se analizarn los aspectos descritos anteriormente, mediante artculos
cientficos que nos darn una idea acerca de cules son las reas de investigacin en las
cuales se utilizan enzimas de restriccin como la Sau3A.

OBJETIVO GENERAL:
Redactar informacin bibliogrfica del origen, tipo de corte y
aplicaciones de la enzima de restriccin Sau3A.
OBJETIVOS ESPECFICOS:
Determinar la implicacin de la familia Sau3A en cromosomas humanos.

DESARROLLO:
ORIGEN
La endonucleasa de restriccin Sau3A, proviene de Staphylococcus aureus, cepa 3A
(Keshav, 1990) (Glover, 2013). MboI, Bsp143I, DpnI, DpnII y NdeII son isosquizomeros
de esta enzima, pues ambos reconocen la secuencia GATC (Saunders, 2012).

TIPO DE CORTE
La endonucleasa Sau3A genera fragmentos con terminales pegajosas 5 que contienen
la secuencia tetranucletida GATC (Govil, Aggarwal, & Sharma, 2017), compatible con
los extremos generados por BamH I, Bcl I, Bgl II y Xho II (Saunders, 2012).
Una digestin parcial realizada por Sau3A tendr fragmentos de DNA lo suficientemente
largos para contener todas las secuencias reguladoras y de iniciacin de la transcripcin
y traduccin en el caso de las levaduras (Wu, Grossman, & Moldave, 1989)
La especificidad de la secuencia Sau3A disminuye a baja intensidad inica o cuando se
adiciona glicerol a la mezcla de incubacin. As, cuando experimenta actividad estrella,
reconoce tambin secuencias GAGC o CATC (Roche, 2012).

APLICACIONES

ESTUDIOS SOBRE UNA NUEVA LIPASA A RECOMBINANTE DE BACILLUS SUBTILIS FS2

(Thu, Hong, & Nam, 2008)

En este estudio se aisl de una fuente de pescado tradicional, una cepa de Bacillus
subtilis FS2 y se demostr que produca una enzima que posee actividad de lipasa A
como de gelatinasa al ser cultivada en agar con tributirina y gelatina. El gen que codifica
a la lipasa A fue aislado de la muestra y expresado en E. coli BL21. La enzima mostr una
actividad enzimtica ptima a pH de 10. Como resultado final se obtuvo una actividad
enzimtica de 19814 U/mg para lipasa y 1245 U/mg para gelatinasa.

La salsa de pescado vietnamita y su actividad gelatinosa se detect en placas de agar

que contenan 0,3% gelatina. Durante el aislamiento del gen que codifica para la
gelatinasa de una biblioteca genmica de B. subtilis FS2, un fragmento de ADN de 3,2
kb que contena 4 marcos de lectura abiertos (ORFs) fue descubierto, en el que se
encontr un ORF de 600 pb codificando para un LipA. Sin embargo, utilizando
delimitaciones de fragmentos de ADN para descubrir la extensin del gen estructural,
descubrieron accidentalmente que el ORF que codificaba LipA fue de hecho tambin
responsable de la actividad de la gelatinasa.

Materiales y Mtodos
Se utilizaron enzimas de restriccin, T4 ligasa y Tag-DNA polimerasa. Adicional para
probar la actividad, se emple colgeno y afluirina. La cepa B. subtilis FS2 fue obtenida
del Instituto de Tecnologa de Alimentos-Biotecnologa, Universidad Tecnolgica de Ha
Noi (Vietnam), y se utiliz para el aislamiento del gen LipA. Se utiliz la cepa E. coli BL21
(DE3) para la expresin de protenas.
El DNA DE B. subtilis F2, fue digerido con Sau3A y se aislaron fragmentos de 4-7 kb. Estos
fragmentos de ADN fueron ligados en vectores pUC18 para construir una biblioteca
genmica en E. coli DH5. Luego se realiz la clonacin del gen LipA, se indujo la expresin
de la protena lipasa A y se purific la enzima para medir la actividad enzimtica.
El gen LipA de 600 pb sin secuencia peptdica de seal fue amplificado por PCR.
Para medir la actividad lipsica de la LipA purificada se monitoriz mediante el ensayo
de lipasa fluorescente. Obteniendo los resultados mediante la medicin de la absorcin
a 340/470 nm (exitacin/emisin). La actividad de la gelatinasa se determin midiendo
la liberacin del conjugado fluorescente.
Construccin del ADN genmico de B. subtilis FS2: El ADN de B. subtilis FS2 fue
parcialmente digerido con Sau3A I en pequeos fragmentos de 4 a 7 kb. Estos
fragmentos de ADN fueron insertados en el sitio BamH I del vector PUC18 y el ADN
ligado fue insertado en clulas E. coli DH5 para producir una biblioteca genmica.

SDS-PAGE mostr una sola banda de

protena correspondiente a un peso
molecular de aproximadamente 24
kDa en la fraccin con 600 mM de
imidazol (Fig. 2).

Actividad especfica de la LipA

Las actividades de lipasa y gelatinasa de lipA de B. subtilis FS2 fueron demostradas en
agar con un 0,1% de afluentesirina y un 0,3% de gelatina. La actividad especfica para la
lipasa fue de19814 U/mg y para la gelatinasa de 1245 U/mg.

Caracterizacin de la enzima
Se evalu el efecto de la temperatura, el pH y de la presencia de iones metlicos en la
actividad de la lipasa y la gelatinasa. Los resultados se muestran a continuacin.
Aislamiento y purificacin de ADN de comunidad microbiana del suelo naturalmente
enriquecido con quitina
(Pullabhotla V.S.R.N. Sarma, 2012)

En este estudio se ha desarrollado un mtodo modificado de aislamiento y purificacin para la

extraccin de ADN metagenmico del suelo de vertederos industriales con una historia de 10
aos en la produccin de quitina para enriquecer an mas la diversidad gnica de la quitinasa.
Materiales y mtodos:
Las muestras se tomaron de vertederos de una compaa productora de quitina, Mahtani
Chitosan (MC) Pvt., Ltd., se tomaron 6 muestras y se almacenaron a 4C.
Aislamiento de ADN metagenmico del suelo
El aislamiento del ADN de muestras de suelo se bas en un anlisis directo (mtodo de lisis) con
modificaciones.
La muestra se lav inicialmente en tampn (previo a la lisis), se centrifug y el sedimento se
suspendi en 5mL de tampn de extraccin de DNA.
Purificacin rpida mediante electroforesis en gel de polivinilpirrolidona-agarosa
Para la purificacin se prepar un gel de agarosa al 0,8% con 2% de polivinilpirrolidona (PVP).
Todas las electroforesis en gel de agarosa se llevaron a cabo usando tampn de borato de sodio
10 mM. La electroforesis se realiz en el mismo tampn a 20 V / cm durante 20-25 min.
Pureza y determinacin de rendimiento
La pureza del ADN extrado se determin utilizando la absorbancia con relacin a 260/230 nm y
260/280 nm con Espectrofotmetro Nanodrop. Calidad e integridad
del ADN aislado se verific en gel de agarosa al 0,8%.
Restriccin Sau3A del ADN metagenmico
La digestin del DNA se realiz con 0,4 U de enzima Sau3A para 5 g de ADN purificado a 37 C
por 30 min. Las muestras digeridas se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%
durante 25 min.
Amplificacin de los genes 16S rRNA y quitinasa A
Los genes diana para la amplificacin por PCR fueron para el gen 16S rRNA: 372F: 5'-
TACGGGAGGCAGCAG-3 'y 1491R: 5'-TACCTTGTTACGACTTCA-3 ' y para la quitinasa A: F: 5'-
ACGGCGTGGACATCGAYTGGGART-3 'y R: -5'-CCCAGGCGCCGTAGARRTCRTARSWCA-3'.
Amplificacin de la regin V3 (16S rDNA) y gradiente desnaturalizante en gel de
electroforesis
Los cebadores bacterianos universales dirigidos a 16S rDNA V3 son: F338gc y R518 los cuales se
usaron para amplificar fragmentos con un tamao de aproximadamente 200 pb. La GCclamp se
agreg al cebador F338gc para permitir la desnaturalizacin, luego se ejecut la PCR.
Se realiz una alcuota de 5 L del producto de PCR en gel de agarosa al 1,5% a 300 V durante
20 min.
DGGE se llev a cabo utilizando un instrumento DCode Universal Detection System de acuerdo
con las especificaciones del fabricante.
Los geles se corrieron en 0.5X TAE durante 16 h a 70 C. luego se tieron con bromuro de etidio
(0.5 g / mL) y se documentaron las imgenes utilizando el sistema de documentacin UVP-Gel
(UK).
Resultados:
Se obtuvo ADN metagenmico de alta calidad a partir de suelos MC con una banda clara a 23
kb, tanto antes (Figura 1a) como despus
de la purificacin (Figura 1b). Dado que la
presencia de contaminantes interferira
con las aplicaciones posteriores, se evalu
la pureza del ADN metagenmico. El ADN
crudo aislado se someti a una purificacin
rpida en gel de agarosa PVP al 0, 8%
usando tampn de borato de sodio para
electroforesis (Fig. 1c).

La restriccin de ADN metagenmico

aislado se confirm con digestin con
enzima Sau3A (figura 2a). La
amplificacin por PCR del ADNr 16S a
partir de muestras de ADN
metagenmico de MC dio como
resultado amplicones de 1,2 kb (figura
2b). Se us ADN aislado para la
amplificacin de la regin conservada
del gen Chi-A ya que la muestra de suelo
se enriquece constantemente para las
bacterias que degradan quitina. La PCR
produjo un producto de 250 pb que
coincide con el amplicn obtenido para la regin conservada de Chi-A de Bacillus cereus que
pertenece a la familia de glucsidos hidrolasa 18 (Fig. 2c).

La naturaleza metagenmica del ADN aislado fue confirmada por los amplicones de la regin
DGGE de V3 (16S rDNA) de la muestra MC, en 30-
70% de gradiente desnaturalizante gel (Fig. 3). El
patrn de DGGE y la variacin en las intensidades
de la banda indicaron la presencia de diferentes
tipos de organismos y su abundancia relativa en el
suelo.

Una familia de ADN repetitivo (familia Sau3A) en cromosomas humanos

(Ryoiti Kiyama, 1986)
En el paper se informa sobre una secuencia de ADN repetida en tndem que se
encuentra en los cromosomas humanos. La secuencia de ADN, que est presente en
1000 copias por genoma haploide, consiste en una base de 849 pares de bases (pb) de
longitud larga con una enzima de restriccin especfica (Sau3AI) en el sitio de corte.
Despus de la digestin de la enzima de restriccin, se encontr un grado considerable
de polimorfismo de ADN asociado con esta secuencia. Lo ms sorprendente es que las
porciones sustanciales de la secuencia de ADN estn presentes de forma heterloga
como monmeros y oligmeros de ADNc circular cerrado covalentemente en los seres
humanos. La unidad est compuesta adems por cinco subunidades, cada una = 170 pb
de longitud. Cuando se examinaron ADN de diversas fuentes mediante hibridacin
Southern usando el ADN repetitivo como sonda, se observ un grado considerable de
polimorfismo de la longitud del fragmento de restriccin. Adems, un porcentaje
sustancial (= 1,0%) de la misma secuencia de ADN tambin se encontr
extracromosmicamente en las clulas humanas cultivadas (HeLa) como monmeros y
oligmeros de la unidad bsica en forma de ADN circular cerrado covalentemente. Estos
resultados sugieren que el ADN repetitivo es inestable y propenso a ser extirpado de los
cromosomas mediante recombinacin homloga.

Los cromosomas de clulas humanas contienen una variedad de familias de ADN

repetitivas. Entre ellas, a la familia Alu especfica a los cromosomas de los primates y
consiste en 300 pares de bases (pb), que se encuentra dentro del cromosoma con hasta
300,000 copias por genoma haploide. El ADN de satlite parafiloide generalmente
consiste en una unidad bsica repetida en tndem de 340 o 680 pb (con subunidades de
-170 pb) y ocupa el = 2% de los cromosomas humanos. ADN recombinante con
caractersticas estructurales similares a elementos transponibles han sido reportados
recientemente. Se ha sugerido que algunas de las secuencias de ADN repetitivas son la
causa de la inestabilidad cromosmica y del polimorfismo del ADN en los cromosomas
humanos, demostraron que varias secuencias de ADN repetitivo en cromosomas
humanos son inestables, lo que produce polimorfismos de ADN asociados con las
secuencias de ADN. Sin embargo, incluso en la regin hipervariable, las frecuencias de
la formacin de las secuencias de ADN alteradas, detectadas como polimorfismo de
longitud de fragmentos de restriccin (RFLP), son demasiado bajas para permitir
estudios de biologa molecular ms dinmicos. sobre el mecanismo de inestabilidad del
ADN y la reorganizacin en cromosomas humanos.

Resultados y discusin
Una secuencia de ADN repetitivo en cromosomas humanos y polimorfismo de ADN
asociado. En la bsqueda de otra clase de familia de ADN humano, se ha observado un
nmero considerable de clones de ADN que observan sus patrones de hibridacin sur
con ADN humano digerido con enzimas de restriccin. Cuando uno de los clones (pHeS3-
45) aislado de AluIdiges de ADN de Heladas se usa como sonda, los patrones distintivos
de la secuencia de ADN repetitivo con algn grado de FFL se originan en el ADN de
diversas fuentes. La Fig. LA muestra ejemplos del RFLP observado en ADND digerido con
EcoRI aislado de linfocitos de dos individuos sanos (carriles 1 y 2), dos leucemias
humanas (K-562, carril 3; HL-60, carril 4) y Celos de HeLa (carril 5). Como se ve en la
figura, varias bandas hibridadas con Se observ polimorfismo de ADN entre las muestras
de ADN, especialmente entre las muestras de ADN de linfocitos de los dos individuos.
Por otro lado, cuando el ADN se digiri con una enzima de restriccin (Sau3AI) antes de
la electroforesis, las bandas de ADN hibridables se convirtieron en una banda mayor =
850 pb, aunque una de las muestras (lnea 2) derivada de los linfocitos exhibi una banda
adicional con un tamao molecular normal.

FIGURA 1. Anlisis Southernblot del ADN cromosmico humano

utilizando pHeS3-45 como sonda de ADN.Tenomicrogramas de todo el
ADN cromosmico purificado se digiri con EcoRI y Sau3AI, se
electrofor en geles de agarosa (A, 0,7%; B, 1,5%), se transfiri a
membranas de nailon y se hibrid con pHeS3-45 marcado con 32P. (A)
despus de la digestin con EcoRI.

FIGURA 2. Hibridacin de Sau3AfamilyDNA a ADN

cromosmico de humanos, chimpancs, monos y ratones.

Fig.3 Anlisis de transferencia Southern del ADN extracromosmico

usando pHeS3-45 como una sonda de ADN.

FIG. 4.
Secuencia de nucletidos de la unidad bsica de
la DNA familia Sau3AI. Uno de los clones (PSP3)
que contienen toda la longitud de la unidad fue la
secuenciacin del ADN a usar por.

FIG.5. Un mecanismo propuesto de generacin

deSau3Afamily. Los nmeros 1-5 indican las
subunidades ampliadas y diversas. Las
subunidades traseras se muestran como 1'-5
La significacin biolgica de la familia del ADN adictivo (familia Sau3) no est presente.
Sin embargo, la familia de ADN informada aqu puede proporcionar un sistema nico en
el que se puede estudiar el mecanismo de la instalacin cromosmica y la
recombinacin homloga en clulas humanas. El ADN extracromosmico ser un
bioqumico conveniente para analizar el estado dinmico de los cromosomas. La
secuencia de ADN repetitiva puede usarse como sonda para detectar polimorfismo de
ADN entre individuos.

Nuevos polimorfismos en el locus DXS98 y confirmacin de su ubicacin proximal a

FRAXA mediante hibridacin in situ. (Schnur, Ledbetter, Merry, & Nussbaum, 1989)

El locus en donde se encuentra es FRAXA y se localiza en el Xq27 en el cromosoma x en

el brazo largo , y se descubri en 1987 que los locus dxs52(st14),dxs15(dx513),f8 se
encuentra en 10-15 centimorgan y despus se fueron descubriendo locus ms cercanos
al FRAXA uno de los ms representativos es DXS98.
En este paper se descubri nuevos polimorfismos en el locus DXS98 y para confirmar la
su proximidad con FRAXA se realiz una hibridacin en situ
Materiales y mtodos
Obtencin de 4D8-3 y D8-15
A Linfoblastoide GM1416 se le extrajo el ADN y fue digerido con Sau3A obteniendo
fragmentos de 13-15Kb y se lo incorporo al vector BamHI los recombinantes se aislaron
por el por Spi posteriormente se aislo del recombinante las sondas de 4D8-3 y D8-
15
Deteccin de nuevos polimorfismos
Se utiliz Southern blot se utilizo como sonda 4D8-3 , se estimo una poblacin de 22
a 24 , se tomo 5 micro gramis de ADN de cada sujeto

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