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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN MARTIN
OFICINA DE INVESTIGACIN Y CAPACITACION
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
FACULTAD DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

INFORME FINAL

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACTERIAS FIJADORAS DE

NITRGENO EN ASOCIACION CON CAA DE AZUCAR
(Saccharum officinarum L.)

INVESTIGADORES:

Blgo. M.Sc. Winston Franz Rios Ruiz

Ing. Nelson Garca Garay

TARAPOTO

JULIO - 2004
2
3
 AGRADECIMIENTOS

A la Universidad Nacional de San Martn, a travs de la Oficina de Investigacin,

por brindar el apoyo financiero para la realizacin del presente trabajo.
A las Facultades de Ciencias Agrarias e Ingeniera Agroindustrial por las facilidades
para la instalacin del experimento de campo en el fundo Miraflores y utilizacin de la
infraestructura y materiales de sus laboratorios.
A los Agricultores de los Distritos de Carhuapoma, Nazareth, Maceda, Rumizapa y
Cacatachi por colaborar con la entrega de muestras de plantas de caa de azcar.

4
 INDICE
Pgs.
RESUMEN ......................................................................................................... 4
ABSTRACT .. 5
I. INTRODUCCIN ...................................................................................... 6
II. REVISIN DE LITERATURA ................................................................ 8
2.1 Fijacin Biolgica del Nitrgeno 8
2.2 Bacterias Fijadoras del Nitrgeno en gramneas ........................ 8
2.3 Cultivo de la caa de azcar .. ........................................ 12
III. MATERIALES Y METODOS ................................................................ 13
3.1.Obtencin de muestras .................................................................................. 13
3.2 Aislamiento de bacterias fijadoras de nitrgeno en caa de azcar............... 14
3.3 Produccin del inoculante.............................................................................. 17
3.4 Prueba de campo: determinacin de la eficiencia del inoculante............... 19
3.5 Parmetros evaluados . 22
IV. RESULTADOS Y DISCUSIN ............................................................... 23
4.1 Identificacin de la bacteria fijadora de nitrgeno....................................... 23
4.2 Cantidad de nmero de microorganismos y de inoculante aplicado............. 23
4.3 Nmero de brotes . 24
4.4 Altura de las plantas . 25
4.5 Anlisis de Nitrgeno .. 27
4.6 Anlisis de Carbono 28
4.7 Anlisis de Sacarosa 28
V. CONCLUSIONES ...................................................................................... 29
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ..................................................... 30
ANEXO ............................................................................................................... 32

5
 AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACTERIAS FIJADORAS DE
NITRGENO EN ASOCIACION CON CAA DE AZUCAR
(Saccharum officinarum L.)

INVESTIGADORES:
Blgo. M. Sc. Winston Franz Rios Ruiz
Ing. Nelson Garca Garay

RESUMEN

Durante el proceso de fijacin biolgica del nitrgeno, llevado a cabo por

organismos procariticos, el N2 es reducido a amonio e incorporado a la biosfera. Este
proceso puede realizarse en forma libre, en simbiosis o por asociacin, siendo esta ltima,
realizada por bacterias diazotrficas endofticas en asociacin con gramneas, entre ellas la
caa de azcar. En este trabajo se presentan los resultados del aislamiento e identificacin
de Gluconacetobacter diazotrophicus aislado de caa de azcar, variedades Azul
Casagrande y POJ. Para determinar la eficiencia en la fijacin de N2 por esta bacteria, en
condiciones de campo, se instal el experimento factorial 2 x 2 con 2 testigos (6
tratamientos) y 3 repeticiones, siendo 2 las variedades de caa (Azul Casagrande (V1) y
POJ (V2)) y 2 los inoculantes (Inoculante 1 (I1) obtenido de la variedad Azul Casagrande e
inoculante 2 (I2) obtenido de la variedad POJ), adaptado al Diseo en Bloques
Completamente al Azar. Los testigos fueron las variedades V1 y V2 sin inoculantes. Se
tuvieron 3 bloques, constituyendo un total de 18 unidades experimentales. La cantidad de
inoculante aplicado por semilla fue de 50 gr., representando 3.3 x 107 bacterias. El
tratamiento constituido por la variedad Azul Casagrande y el inoculante POJ present
mayor porcentaje de nitrgeno, demostrando la eficiencia de la bacteria aislada en la
fijacin de este elemento.

6
 AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACTERIAS FIJADORAS DE
NITRGENO EN ASOCIACION CON CAA DE AZUCAR
(Saccharum officinarum L.)

INVESTIGADORES:
Blgo. M. Sc. Winston Franz Ros Ruiz
Ing. Nelson Garca Garay

ABSTRACT

During the process of biological nitrogen fixation, led to end for organisms
procariotics, the N2 is reduced to amonio and incorporated into the biosphere. This process
can be realized in free form, in symbiosis or for association, being the latter, realized by
bacterial endophitic diazotrophs in association with gramineas, between them the
sugarcane. In this work appear the results of the isolation and identification of
Gluconacetobacter diazotrophicus isolated of sugarcane, varieties Blue Casagrande and
POJ. To determine the efficiency in the fixation of N2 for this bacterium, in field
conditions, the experiment installed to itself factorial 2 x 2 with 2 witnesses (6 treatments)
and 3 repetitions, being 2 the varieties of sugarcane (Blue Casagrande (V1) and POJ (V2))
and 2 the inoculantes (Inoculante 1 (I1) obtained of the variety Blue Casagrande and
inoculante 2 (I2) obtained of the variety POJ), adapted to the Design in Blocks completely
at random. The witnesses were the varieties V1 and V2 without inoculantes. 3 blocks were
had, constituting a whole of 18 experimental units. The quantity of inoculante applied by
seed was of 50 gr., representing 3.3 x 107 bacteria. The treatment constituted by the variety
Blue Casagrande and the inoculante POJ presented major percentage of nitrogen,
demonstrating the efficiency of the bacterium isolated in the fixation of this element.

7
I. INTRODUCCIN

A travs de la aplicacin de tecnologas adecuadas desarrolladas y recomendadas por

los investigadores, como el empleo de cultivares adecuados para cada regin, aplicacin
equilibrada de abonos, prcticas de conservacin del suelo y control fitosanitario permitirn
un aumento de la productividad de diferentes especies cultivadas en la regin, entre ellas la
caa de azcar.
El nitrgeno constituye el macroelemento mas limitante en la productividad de la
mayoria de los cultivos. En varios suelos tropicales, debido al bajo intercambio de iones y a
la mnima retencin de agua de la fraccin mineral, la fertilidad del suelo est
estrechamente relacionada con el contenido de materia orgnica del suelo (Cardoso et al.,
1992). Como el N2 es el elemento que con mayor facilidad se pierde cuando la
mineralizacin de la materia orgnica del suelo es estimulada por el arado del suelo, es
frecuente que este elemento controle la materia orgnica del suelo y, por lo tanto, su
fertilidad.
Los fertilizantes nitrogenados representan el mayor costo entre los fertilizantes ya que
su compra no es subsidiada y la cantidad requerida por las plantas es una de las mayores
comparada con otros nutrientes, adems de que muchos suelos presentan baja fertilidad
natural. Este escenario en otros pases como Brasil, orient al descubrimiento de nuevas
especies de bacterias asociadas a gramneas tanto en la rizsfera como en el interior de las
plantas. Hoy se considera a la poblacin de bacterias diazotrficas subdivididas entre las de
vida libre y las asociativas, donde la relacin con el hospedero puede ser ms restricta como
en el caso de leguminosas. Este segundo grupo ha sido denominado por la comunidad
cientfica como un endfito, necesitando del vegetal para completar su ciclo de vida y
mantenerse viable en el ambiente. En este grupo se encuentran las especies descritas por
EMBRAPA Agrobiologia, las cuales son el blanco de sus investigaciones actuales. Esta
institucin manifiesta que el genotipo tanto de la planta como del microorganismo se
diferencian evolucionariamente o por la accin del hombre. El potencial mximo de
expresin de cualquier caracterstica benfica es el resultado de las interacciones entre la

8
planta, el suelo, el ambiente y la poblacin microbiana relacionada en este proceso
biolgico (Baldani et al., 1997).
Considerando el potencial agrcola de nuestra regin y comprometidos con su
desarrollo socio econmico, planteamos la ejecucin del presente proyecto, sobre todo, por
la importancia que en la actualidad representa el cultivo de la caa de azcar y el uso
ecolgicamente correcto del medio ambiente donde la comunidad microbiana del suelo
desempea un papel importante en la nutricin vegetal.
En este sentido, el objetivo del presente trabajo fue aislar e identificar bacterias
fijadoras de nitrgeno y a su vez determinar su eficiencia en la fijacin biolgica de este
elemento.

9
II. REVISIN DE LITERATURA

2.1 Fijacin biolgica del nitrgeno

Segn James, 2000, el nitrgeno (N) es un elemento qumico presente en forma

abundante en su forma ms estable en la atmsfera. La estabilidad del gas N2 se debe a la
presencia de un fuerte enlace triple entre las dos molculas de N. Infelizmente la mayora
de los organismos animales y vegetales, no consigue incorporar esta forma de nitrgeno en
esqueletos de carbono. Es necesario que esta unin se rompa y el nitrgeno pase a la forma
de amonio. Algunas especies de bacterias, un grupo de organismos unicelulares y
procariticos, son capaces de realizar esta reaccin de reduccin de N2 a NH4+. Este
proceso biolgico es conocido como Fijacin Biolgica de Nitrgeno (FBN). Esto es
posible porque estos microorganismos poseen la enzima nitrogenasa, caracterizada como
un complejo enzimtico, responsable por el rompimiento del enlace triple usando energa
celular en la forma de adenosin trifosfato (ATP) (Neves & Rumjaneck, 1992).
La incorporacin del nitrgeno, via FBN, en los diferentes ecosistemas de nuestro
planeta, hace parte de los ciclos biogeoqumicos naturales. El entendimiento de este
processo biolgico pasa por los conocimientos de las especies capaces de fijar el nitrgeno
y su clasificacin filogentica. Pasa tambin por el entendimiento del sistema fisiolgico de
equilibrio entre la enzima nitrogenase y su mayor enemigo, el oxgeno, y por la
comprensin de los procesos enzimticos ligados a la asimilacin del nitrgeno fijado en
las clulas microbianas y su interaccin con la nitrogenasa (Siquiera & Franco, 1988).

2.2 Bacterias Fijadoras del Nitrgeno en gramneas

Los microorganismos que usan nitrgeno en forma de gas como substrato para la
enzima nitrogenasa son conocidos como fijadores de nitrgeno o diazotrficos. Estos
microorganismos pertenecen al grupo de las bacterias, siendo varios gneros descritos
durante ms de 30 aos de investigacin por la empresa Brasilera de investigacin

10
agropecuaria (EMBRAPA), realizando trabajos con bacterias diazotrficas asociadas
principalmente a cereales como: Trigo, arroz, maz y sorgo; a gramneas forrajeras del
gnero Braquiaria , y principalmente por investigaciones desarrolladas con caa de azcar
(Saccharum spp) liderados por Johanna Dobereiner (Dobereiner et al., 1995).
Kloepper et al. (1997), describe que bacterias endofticas son aquellas que pueden ser
aisladas de tejidos vegetales superficialmente desinfectados o extrados de la parte interna
de la planta, y que no causan daos visibles ni tampoco inducen sntomas en la planta. Esto
determina que las bacterias endofticas estn encuadradas en algunas reglas:
La bacteria debe ser capaz de invadir y proliferar en los tejidos de la planta hospedera,
desarrollando mecanismos para ultrapasar las barreras fsicas y qumicas desarrolladas por
la planta, estableciendo vas de infeccin y colonizacin as como los sitios de
establecimiento. La bacteria no debe inducir una respuesta drstica de la planta a la
infeccin (respuesta hipersensible), caracterizada por la rpida necrosis de las clulas
alrededor del punto de infeccin, impidiendo la colonizacin de los tejidos. La bacteria
debe poseer un padrn de colonizacin aceptado por la planta hospedera, una vez que la
multiplicacin masiva y/o la hiperactivacin de genes de virulencia, pueda colapsar los
tejidos, induciendo sntomas en la planta y consecuentemente estableciendo una interaccin
patognica . En el caso interacciones ms evolucionadas, la bacteria debe seguir el ciclo de
vida de la planta hospedera desarrollando mecanismos para colonizar semillas o estructuras
de propagacin vegetativa.
Baldani et al. (1997), propusieron la distincin de endfito facultativo y obligatorio,
diferenciando respectivamente bacterias capaces de sobrevivir en el suelo y establecerse en
las races, de aquellas con baja capacidad de sobrevivir en el suelo y capaces de colonizar
races y la parte area.
Estudios relacionados con el proceso de colonizacin e infeccin, vas de dispersin
sistmica, asi como los sitios de establecimiento y actividad de las bacterias diazotrficas
endofticas en gramneas son todava bastante escasos, principalmente con relacin a
plantas desarrolladas en condiciones de campo.
En la tabla N 1 se da a conocer los principales gneros y especies de bacterias
diazotrrficas en gramneas y otras especies no leguminosas, segn Reis & Dobereiner,
1998 y Reis et al., 2000.

11
Tabla N 01: Organismos fijadores de nitrgeno asociados a gramneas e otras especies no
leguminosas.

Gnero Especie Planta hospedera Referencia

1. Clase I
Proteobacteria subdivisin alfa

Azospirillum A. brasilense gramneas Tarrand et al., 1978

A. lipoferum gramneas Tarrand et al., 1978
gramneas Magalhes et al., 1986
A. amazonense
A. halopraeferens Kallar grass Reinhold et al., 1987
A. irakense Arroz Khammas et al., 1989
A. doebereinerae Miscanthus Eckert et al., 2001
Gluconacetobacter G. diazotrophicus caa de azcar, caf, Cavalcante & Dobereiner,
pia, papa dulce 1988, reclassificao feita por
Pennisetum y Eleusine Yamada et al., 1997
coracana
G. johannae rizosfera de caf (a) Fuentes-Ramrez et al., 2001
G. azotocaptans rizosfera de caf (a) Fuentes-Ramrez et al., 2001
Beijerinkia B. fluminensis caa de azcar Krieg, 1984 (b)
B. indica Arroz Sulaiman & Gaikwad, 1971
Derxia D. humosa caa de azcar Krieg, 1984

2. Clase II
Proteobacteria subdivisin beta

Burkholderia B. vietnamiensis Arroz Gillis et al., 1995

B. kururiensis acufero contaminado con Zhang et al., 2000
trichloroethylene (TCE) (c)
B. brasilensis * Baldani et al., 1997 b
arroz, yuca, papa dulce,
caa de azcar y maiz. primera citacin
B. tropicalis * caa de azcar Reis et al., 2000, primera
citacin
Herbaspirillum H. seropedicae Gramneas Baldani et al., 1986
H. rubrisubalbicans caa de azcar Baldani et al., 1996
H. frisingense Pennisetum, Miscanthus y Kirchhof et al., 2001
Spartina
Alcaligenes A. faecalis Arroz You et al., 1991

12
 A. latus Arroz Malik et al., 1981
A. paradoxus Arroz Kravchenko &
Kalininskaya, 1988.
Azoarcus A. indigens Kallar grass Reinhold et al.., 1993
A. communis Kallar grass Reinhold et al., 1993
Azovibrio ** A. restrictus Kallar grass Reinhold-Hurek et al., 2000
Azospira ** A. oryzae Kallar grass Reinhold-Hurek et al., 2000
Azonexus ** A. fungiphilus Kallar grass Reinhold-Hurek et al., 2000

3. Clase III
Proteobacteria subdivisin gamma

Azotobacter A. paspali Paspalum notatum Krieg, 1984

K. pneunoniae maiz, caa de azcar, papa Krieg, 1984
Klebsiella dulce, trigo
K. oxytoca Arroz, trigo Kovttunovych et al., 1999
K. planticola Arroz, trigo Ladha et al., 1983
K. terrigena Gramneas Haahtela et al., 1988
Pantoea P. agglomerans Trigo Ruppel et al., 1992

4. Filo BXIII Firmicutes phy. nov.

Clase III Bacilli

Paenobacillus P. azotofixans Gramneas Seldin et al., 1984

(a) Descripcin reciente, descripcin basada en las estirpes aisladas de un nico hospedeiro.
(b) Primera versin de Bergeys Manual. (c) Descrito recientemente, cuya estirpe padrn
fue verificada como diazotrfica. Indica que el organismo fue propuesto. * Baldani et
al., en preparacin. ** No fue incluido en la actualizacin de Bergeys Manual, disponible
en 2002.

Gluconacetobacter diazotrophicus, anteriormente denominada Acetobacter

diazotrophicus, es una bacteria gram negativa que mide de 0.7 a 0.8 x 2 a 4 m, aerbica,
sin movimiento espiralado. En medio semislido libre de N con 100 g /L de sacarosa ocurre
la formacin de una pelcula, que se torna densa despus de 7 a 10 dias, resultando con un
pH por debajo de 3.0. El crecimiento y la fijacin de nitrgeno continua en este pH por
varios dias. En medio batata-agar con 100 g/L de sacarosa son formadas colonias marrn
oscuras, y en medio slido, pobre en nitrgeno mineral (0.02 g/L de extracto de levadura) y

13
con 100 g/L de sacarosa y azul de bromotimol, las colonias son anaranjadas. La bacteria no
posee nitrato reductasa y la fijacin de N2 no es afectada aun con altos niveles de NO3-
(25mM) y tambin, la presencia de NH4+ causa solamente inhibicin parcial de la
Nitrogenasa (Boddey et al., 1991).
G. diazotrophicus es la nica especie del gnero capaz de fijar N2. Su ocurrencia es
bastante restringida, estando principalmente asociada a plantas ricas en azcar, como la
caa de azcar, la cual se propaga vegetativamente (Dobereiner et al., 1995).

2.3 Cultivo de la caa de azcar

Segn Helfgottt (1997), la caa de azcar es uno de los cultivos agroindustriales de

mayor importancia en el Per, despus del algodn, caf y maiz; la India y el Brasil con
una produccin de 150 millones de toneladas y Cuba con casi 70 millones, son los
principales productores. En el Per existen 90,000 has. sembradas de caa, 70,000 has. son
destinados para azcar. En la Regin San Martn existen aproximadamente 2,500 has. bajo
el sistema de siembra semitecnificado, ubicados en suelos de ladera siendo el producto final
el aguardiente y la chancaca, MINAG, 2002.
A inicios del ao 2000, la Direccin Regional Agraria San Martn del Ministerio de
Agricultura inicia la conduccin del Proyecto de Caa de Azcar como una alternativa para
la diversificacin de los cultivos en la Regin, con la finalidad de mejorar los ingresos en
los productores de caa. En una primera etapa se instalaron semilleros para extender las
reas de caa con el propsito de producir chancaca y azcar rubia artesanal, pero
posteriormente la inversin privada se interes por la produccin de biomasa para la
obtencin de etanol y generacin de energa.
Segn la Oficina de Informacin Agraria OIA (1999), la caa de azcar que se cultiva
actualmente es un hbrido complejo de dos o ms de las cinco especies originarias de la
India, Nueva Guinea y Asia. En el Per, en una primera fase se introdujo la variedad POJ
2878; en una segunda fase, la variedad PCG 12745 (Azul Casagrande). Actualmente, las
variedades son seleccionadas segn los nichos ecolgicos especficos de cada regin,
considerando diferentes aspectos genticos y culturales. La utilizacin de bacterias
fijadoras de nitrgeno en este cultivo se constituye como una alternativa ecolgica, ante la

14
gran cantidad de fuente de nitrgeno inorgnico utilizado, de all la importancia de la
realizacin del presente trabajo.
III. MATERIALES Y METODOS

3.1 Obtencin de muestras

Se realiz la toma de muestras de tallo, raz y suelo de reas de cultivo de caa de azcar
establecidas en los distritos de Cacatachi, Rumizapa, Maceda, Tabalosos y Poblado de
Nazareth, asi como en el Poblado de Carhuapoma (distrito de Bellavista) en el
Departamento de San Martn, obtenindose muestras de cuatro variedades de caa entre
ellas: Chicama 32, Chicama 37, Azul Casagrande y POJ. Las Fotos N 01 y N 02 muestran
las reas de cultivo en el Poblado de Carhuapoma y la toma de muestras.

Foto N 01. Investigadores junto a las reas de cultivo de caa de azcar ubicadas en el
Poblado de Carhuapoma.

15
 Foto N 02. Toma de muestras de tallo, raiz y suelo de cultivo de caa de azcar.

3.2. Aislamiento de bacterias fijadoras de nitrgeno en caa de azcar

Las muestras recolectadas en los lugares indicados, fueron trasladadas al laboratorio de

Biologa de nuestra Universidad, donde se realiz la siembra en un medio de cultivo
selectivo para el desarrollo de bacterias fijadoras de nitrgeno en caa de azcar conocido
como LGI-P (Hungra & Araujo, 1994), el mismo que se detalla a continuacin:

Medio de cultivo para Acetobacter diazotrficos (LGI-P)

Sacarosa o azcar cristal 100 g

K2HPO4 0,2 g
KH2PO4 0,6 g
CaCl2.2H2O 0,02 g
MgSO7.2H2O 0,2 g
Na2MoO4.2H2O 0,002 g
FeCl3.6H2O 0,01 g
Azul de bromotimol (solucin a 0,5% en 0,2N de KOH) 5 ml
Solucin de vitaminas * 1 ml
Agua destilada 1.000 ml
Extracto de levadura 50 mg
Medio semi slido 2,0 g de agar/L
Medio slido 15 g de agar/L
pH 5,5; utilizar cido actico (solucin a 10%) para alcanzar el pH necesario.

16
* Solucin de Vitaminas
Biotina 10 mg
Piridoxina HCl 20 mg
Agua destilada 100 ml
Disolver en bao mara y mantener en la refrigeradora.
Esterilizar por filtracin para incorporacin al medio de cultivo.

Medio caldo (jugo de caa)

Adicionar 1% de jugo de caa de azcar al medio LGI-P y despus disolver el agar.

Medio batata-P

Obtener la infusin, luego de hervir 200 g de papa/300 ml de agua, por 30 min.

Adicionar 100 g de azcar
2 ml de solucin de micronutrientes **
1 ml de solucin de vitaminas
completar el volumen para 1000 ml con agua destilada
ajustar el pH a 5,5 con cido actico al 10%
adicionar 25 g de agar por litro.

** Solucin de micronutrientes
Na2MoO4.2H2O 0,2 g
MnSO4.H2O 0,235 g
H3BO3 0,28 g
CuSO4.5H2O 0,008 g
Agua destilada 1000 ml

Se procedi a colocar pedazos de tallo, races y suelo del cultivo de caa de azcar en
matraces de 500 ml de capacidad, conteniendo 250 ml del medio selectivo LGI-P, semi-
slido, con 1% de jugo de caa de azcar, como se muestra en la Foto N 03.
Posteriormente fueron incubados a 29 C por 10 dias, aguardando la formacin de una
pelcula caracterstica blanca, con fondo amarillo en la superficie del medio. Luego se
repic para LGI-P, semi-slido, sin caldo, Foto N 04. Despus de siete das, se volvi a
repicar los cultivos con crecimiento puro para placas de LGI-P slido con 50 mg de
extracto de levadura. En este medio, las colonias fueron pequeas, irregulares y de color
naranja-rojizo, como se muestra en la Foto N 05. Las colonias aisladas volvieron a ser
repicadas para medio LGI-P semi-slido sin caldo y, despus de 5 das de inoculacin, la

17
pureza fue verificada en medio batata slido por la presencia de coloracin marrn oscura
de las colonias.

Foto N 03 Matraces conteniendo medio LGI-P y muestras de tallo, raiz y suelo de cultivo
de caa de azcar de las variedades Chicama 32, Chicama 37, Azul
Casagrande y POJ, respectivamente.

Foto N 04. Siembra y aislamiento de bacterias fijadoras de nitrgeno asociadas con caa
de azcar.

18
 Foto N 05. Colonias de color anaranjadas en medio LGI-P slido.

El aislamiento e identificacin de las bacterias fijadoras de nitrgeno se llev a cabo

para 2 variedades: Azul Casagrande y POJ. La identificacin se realiz teniendo en cuenta
las condiciones semiselectivas del medio LGI-P utilizado para el aislamiento (Hungria &
Araujo, 1994), contando con el apoyo de la Dra. Vernica Reis de la Universidad Rural de
Rio de Janeiro Brasil, institucin que viene desarrollando trabajos en esta rea.

3.3 Produccin del inoculante

Previo a la produccin del inoculante se determin la curva de desarrollo de las

bacterias aisladas mediante el procedimiento de diluciones y recuento de colonias en
placas, (Hungria & Araujo, 1994). La Foto N 06 muestra parte del proceso.
Esta actividad nos permiti conocer el nmero de bacterias por ml de medio de
cultivo, en cada una de las fases de desarrollo bacteriano. Conociendo el nmero de
bacterias/ml se procedi a preparar los inoculantes tanto de bacterias aisladas de la variedad
Azul Casagrande (I1) como de POJ (I2), utilizndose substrato constituido por bagazo
picado estril, como se muestra en la Foto N 07.

19
 Foto N 06. Siembra en placas de las diluciones realizadas.

Foto N 07: Preparacin del inoculante. Accin de vaciado del medio de cultivo
conteniendo bacterias fijadoras de nitrgeno de la variedad de caa Azul
Casagrande (I1) sobre el bagazo picado estril, procedindose de igual
manera para la variedad POJ (I2).

20
3.4. Prueba de campo: determinacin de la eficiencia del inoculante

Paralelamente a las etapas finales de laboratorio, se llev a cabo la preparacin del

rea de terreno, Foto N 08, para la instalacin del experimento de campo, ubicado en el
Fundo Miraflores, propiedad de la Universidad Nacional de San Martn.

Foto N 08: Preparacin del rea de terreno, ubicado en el Fundo Miraflores.

Una vez preparado el rea se tomaron muestras de suelo para su anlisis respectivo
en el laboratorio de suelos de la Universidad Nacional de San Martn, cuyos resultados se
muestran en el Anexo N 01.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se procedi a fertilizar el rea con
fsforo y potasio, segn las necesidades requeridas para el cultivo de caa de azcar, datos
proporcionados por el Ing. Max Pezo Perea. Se utiliz Superfosfato Triple y Cloruro de
Potasio, respectivamente, a una proporcin de 1,300 gr. de Superfosfato Triple para cada
parcela de 32.5 m2 y 1,190 gr. de Cloruro de Potasio por parcela de rea similar. No se
agreg ninguna fuente de nitrgeno por ser uno de los parmetros a ser evaluados en
relacin con la actividad de las bacterias fijadoras de nitrgeno, aplicados con el inoculante
respectivo.

21
 Habindose preparado el rea y los inoculantes respectivos, se procedi a instalar el
experimento de campo utilizando un diseo factorial 2 x 2 con 2 testigos (6 tratamientos) y
3 repeticiones, siendo 2 los niveles del factor variedad de caa (Azul Casagrande (V1) y
POJ (V2)) y 2 los niveles del factor inoculantes (Inoculante 1 (I1) obtenido de la variedad
Azul Casagrande e inoculante 2 (I2) obtenido de la variedad POJ), adaptado al Diseo en
Bloques Completamente al Azar. Los testigos fueron las variedades V1 y V2 sin
inoculantes. Se tuvieron 3 bloques, constituyendo un total de 18 unidades experimentales.
La unidad experimental estuvo constituida por una parcela de 32.5 m2, como se indica en
los Anexos 02 y 03. Para efectos de comparacin y anlisis de los datos se realiz la prueba
de Tuckey.
El Cuadro N 01, representa el anlisis de varianza del experimento.

Cuadro N 01: ANVA para el experimento en estudio.

Fuente de Variacin Grados de Libertad
Bloques (r1) 2
Tratamientos (t-1) 5
Error (r-1)(t-1) 10
Total rt-1 17
Fuente: Rojas, 1991.

La siembra se realiz el 20-11-2003. En las Fotos N 09 y N 10 se muestran a

alumnos del curso de Microbiologa de la Facultad de Ciencias Agrarias al lado de estacas
(semillas) de las 2 variedades de caa de azcar a ser sembradas (Azul Casagrande y CP 74
2005) y el momento de la siembra de los diferentes tratamientos. La Foto N 11, muestra la
forma de cmo se agreg el inoculante en los tratamientos respectivos.

22
Foto N 9: Alumnos del curso de Microbiologia FCA, junto a las variedades de
caa CP 74 2005 y Azul Casagrande.

Foto N 10: Participacin de los alumnos en la siembra de las variedades de caa en

los diferentes tratamientos.

23
 Foto N 11: Estaca (semilla) de caa de azcar con el inoculante respectivo.

3.5 Parmetros evaluados

Se evalu la emergencia de brotes, contando el nmero de brotes que emergieron de

las estacas sembradas por cada tratamiento. Se evaluaron 4 cepas por parcela al tercer y
sexto mes despus de la siembra.
Se evalu adems, la altura de plantas en centmetros, Se evaluaron 4 cepas de cada
tratamiento al tercer y sexto mes despus de la siembra, midindose desde la base del tallo
hasta el extremo superior de la ltima hoja floral.
Para el anlisis de Nitrgeno y Carbono, se tomaron muestras de hojas de cada
tratamiento. Las muestras tomadas en cada tratamiento de cada bloque, se unieron de tal
manera que se tuvo 6 muestras representativas. Estas fueron remitidas al laboratorio de
anlisis de suelos, plantas, aguas y fertilizantes de la Universidad Agraria La Molina, en
Lima.
Para el anlisis de sacarosa, se tomaron muestras de tallos de cada tratamiento,
aproximadamente 20 a 25 cm de la parte central de la altura del tallo, Las muestras tomadas
en cada tratamiento de cada bloque, se unieron de tal manera que se tuvo 6 muestras
representativas. Las muestras fueron analizadas en el laboratorio de anlisis fsico qumico
de alimentos de la Facultad de Industrias Alimentarias de la Universidad Agraria La
Molina, en Lima.

24
IV. RESULTADOS Y DISCUSION

4.1 Identificacin de la bacteria fijadora de nitrgeno

La utilizacin del medio selectivo LGI-P determin el desarrollo de bacterias fijadoras

de nitrgeno aisladas segn lo explicado en el Captulo anterior. Posteriormente la siembra
en medio batata P slido, determin el desarrollo de colonias marrn oscuras como se
aprecia en la Foto N 12, confirmando la identificacin de la Bacteria Gluconacetobacter
diazotrophicus, que es semejante a lo reportado por la Dra. Vernica Reis, investigadora de
la Universidad Rural de Rio de Janeiro Brasil, Institucin que viene desarrollando
trabajos en esta rea..

Foto N 12. Colonias marrn-oscuras de Gluconacetobacter diazotrophicus en medio

batata P slido.

4.2 Cantidad de nmero de microorganismos y de inoculante aplicado

Con los datos obtenidos mediante el procedimiento de diluciones y recuento de colonias

en placas, se determin la cantidad de 1x108 bacterias/ml en la fase logartmica. Fue
necesario contar con 2 litros de medio de cultivo bacteriano (1 x 107 bacterias/ml) para 3 kg

25
de bagazo picado estril, para cada inoculante (I1, I2). Se aplic la cantidad de 50 gr por
estaca (semilla), existiendo por tanto 3.3 x 107 bacterias por semilla.

4.3 Nmero de brotes

En el Cuadro N 02 se muestra el anlisis de varianza de los resultados del nmero de

brotes, evaluado en los diferentes tratamientos, tres meses despus de la siembra.

Cuadro N 02: ANVA del nmero de brotes evaluado tres meses despus de la siembra.
Fuente de Variabilidad G.L. S.C. C.M. F.C. Significacin
Bloques 2 4.47 2.23 0.62
Tratamientos 5 12.94 2.59 0.72 No significativo
Error 10 35.87 3.59
Total 17 53.28
R2 = 33% CV = 23% X = 8.61

No se observa diferencia significativa entre los tratamientos, lo que nos ndica que
durante este tiempo las variedades en estudio con y sin inoculantes se adaptaron y
desarrollaron teniendo en cuenta los nutrientes existentes en la semilla y en parte los
presentes en el suelo, aportando los requerimientos necesarios para la emisin de los brotes,
comportndose en forma semejante en los diferentes tratamientos.
El Cuadro N 03 muestra el anlisis de varianza de los resultados del nmero de brotes,
evaluado en los diferentes tratamientos, seis meses despus de la siembra, donde si se
observa diferencia significativa entre los tratamientos, procedindose a realizar la prueba
mltiple de Tuckey, que se muestra en el Cuadro N 04.

Cuadro N 03: ANVA del Nmero de brotes evaluado en los diferentes tratamientos, seis
meses despus de la siembra.
Fuente de Variabilidad G.L. S.C. C.M. F.C. Significacin
Bloques 2 31.86 15.93 2.11
Tratamientos 5 395.78 79.16 10.49 Significativo
Error 10 75.43 7.54
Total 17 503.07
R2 = 85% CV = 15.64% X = 17.55

26
Cuadro N 04: Prueba de Tuckey del nmero de brotes evaluado seis meses despus de la
siembra.
Tratamientos Numero de brotes Significancia
sexto mes
T6 (V2) 23.333 a
T1 (V2I2) 22.833 a
T2 (V2I1) 20.083 ab
T4 (V1) 14.083 bc
T5 (V1I1) 13.250 bc
T3 (V1I2) 11.750 c
Medias seguidas por letras distintas difieren entre s al nivel de 5% de significancia.

En el Cuadro N 04, podemos observar que no existe diferencia significativa con

respecto a los tratamientos de una misma variedad, sin embargo, s existe diferencia
significativa entre los tratamientos con variedades diferentes, Azul Casagrande (V1) y
CP74 2005 (V2), lo que implica que el nmero de brotes estara influenciado por
caractersticas propias de cada variedad, como el periodo vegetativo de cada una de ellas,
ya que la variedad CP74 2005 es muy precoz, presentndose en muchas cepas, a este
periodo de tiempo, inflorescencias.

4.4 Altura de las plantas

El Cuadro N 05 muestra el anlisis de varianza de los resultados de la altura de plantas

de caa de azcar, evaluado en los diferentes tratamientos, tres meses despus de la
siembra, donde se observa diferencia significativa entre los tratamientos, procedindose a
realizar la prueba mltiple de Tuckey, que se muestra en el Cuadro N 06.

Cuadro N 05: ANVA de la altura de plantas de caa de azcar en cm. tres meses despus
de la siembra.
Fuente de Variabilidad G.L. S.C. C.M. F.C. Significacin
Bloques 2 292.19 146.10 0.78
Tratamientos 5 6385.31 1277.06 6.84 Significativo
Error 10 1867.18 186.72
Total 17 8544.68
R2 = 78.14% CV = 7% X = 194.98

27
Cuadro N 06: Prueba de Tuckey de la altura de plantas, tres meses despus de la siembra.
Tratamientos Numero de brotes Significancia
tercer mes
T5 (V1I1) 216.25 a
T3 (V1I2) 212.08 ab
T4 (V1) 208.67 ab
T1 (V2I2) 191.17 abc
T2 (V2I1) 174.00 bc
T6 (V2) 167.75 c
Medias seguidas por letras distintas difieren entre s al nivel de 5% de significancia.
Los datos presentados en el Cuadro N 06, muestran que no existe diferencia
significativa entre tratamientos de la misma variedad con respecto a la altura de las plantas,
sin embargo los tratamientos inoculados presentan una mayor altura con respecto al no
inoculado (Testigo). Se observa adems, que s existe diferencia significativa entre
variedades, siendo la variedad Azul Casagrande que presenta mayor altura.
El Cuadro N 07 muestra el anlisis de varianza de los resultados de la altura de
plantas de caa de azcar, evaluado en los diferentes tratamientos, seis meses despus de la
siembra, donde se observa diferencia significativa entre los tratamientos, procedindose a
realizar la prueba mltiple de Tuckey, que se muestra en el Cuadro N 08.
Cuadro N 07: ANVA de la altura de plantas de caa de azcar en cm. seis meses despus
de la siembra.
Fuente de Variabilidad G.L. S.C. C.M. F.C. Significacin
Bloques 2 915.44 457.71 1.60
Tratamientos 5 17627.50 3525.50 12.31 Significativo
Error 10 2864.81 286.48
Total 17 21407.75
R2 = 86.61% CV = 5.42% X = 312

Cuadro N 08: Prueba de Tuckey de la altura de plantas, seis meses despus de la siembra.
Tratamientos Numero de brotes Significancia
sexto mes
T4 (V1) 345.08 a
T3 (V1I2) 344.00 a
T5 (V1I1) 339.25 a
T1 (V2I2) 288.50 b
T2 (V2I1) 287.50 b
T6 (V2) 269.08 B

28
 Los datos presentados en el Cuadro N 08, muestran que no existe diferencia
significativa entre tratamientos de la misma variedad, pero se observa que s existe
diferencia significativa entre variedades, siendo la variedad Azul Casagrande la que
presenta mayor altura, como se observa en la Foto N 13.

Foto N 13: Area experimental del cultivo de caa de azcar, seis meses despus de la
siembra, mostrando las variedades Azul Casagrande y CP742005.

4.5 Anlisis de Nitrgeno

Cuadro N 09: Anlisis de Nitrgeno determinado a los seis meses despus de la siembra.

Muestra/Tratamiento Nitrgeno (%)

F- 521 (V2I2) 0.98
F- 522 (V2I1) 0.84
F- 523 (V1I2) 1.29
F- 524 (V1) 0.84
F- 525 (V1I1) 1.01
F- 526 (V2) 0.78

Como se observa en el Cuadro N 08, los datos de la variedad Azul Casagrande con
inoculantes presentan mayor porcentaje de nitrgeno en relacin a los dems tratamientos,
siendo el tratamiento inoculado con inoculante POJ el que presenta mayor porcentaje. Esto
probablemente se debe a la mayor eficiencia en la fijacin de nitrgeno por parte de la
bacteria Gluconacetobacter diazotrophycus obtenida a partir de la variedad POJ, adaptada

29
en nuestra regin por un largo periodo de tiempo, permitiendo a la bacteria adquirir
caractersticas ptimas para su desarrollo.

4.6 Anlisis de Carbono

Cuadro N 10: Anlisis de Carbono determinado a los seis meses despus de la siembra.
Muestra/Tratamiento Carbono (%)
F- 521 (V2I2) 43.84
F- 522 (V2I1) 41.55
F- 523 (V1I2) 44.29
F- 524 (V1) 42.92
F- 525 (V1I1) 42.92
F- 526 (V2) 44.59

Como se observa en el Cuadro N 10, los datos demuestran la semejanza en el

porcentaje de carbono entre los diferentes tratamientos, lo que estara demostrando que
ambas variedades inoculadas y no inoculados tendran un comportamiento fisiolgico
semejante.

4.7 Anlisis de Sacarosa

Cuadro N 11: Anlisis de sacarosa determinado a los seis meses despus de la siembra.
Muestra/Tratamiento Sacarosa (%)
M1 (V1I1) 16.71
M2 (V2I2) 09.86
M3 (V2) 6.20
M4 (V1) 15.59
M5 (V1I2) 17.63
M6 (V2I1) 07.26

Como se observa en el Cuadro N 11, con respecto al porcentaje de sacarosa existe

una gran diferencia entre las variedades, siendo los tratamientos con la variedad Azul
Casagrande los que presentan mayor porcentaje. Teniendo en cuenta la precocidad (6
meses) de la variedad CP74 2005, es muy probable que el menor porcentaje encontrado en
esta variedad se deba al estado de madurez alcanzado por esta planta, donde la sacarosa se
invierte dando origen a monosacridos.

30
V. CONCLUSIONES

1. La bacteria aislada mediante la metodologa empleada fue identificada como

Gluconacetobacter diazotrophicus.

2. El tratamiento constituido por la variedad Azul Casagrande y el inoculante POJ

present mayor porcentaje de nitrgeno, demostrando la eficiencia de la bacteria aislada
en la fijacin de este elemento.

3. La cantidad de inoculante aplicado por semilla fue de 50 gr., representando 3.3 x 107
bacterias.

31
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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DOBEREINER, J.; BALDANI, I; BALDANI, V.L.D. Como isolar e identificar bactrias

diazotrficas de plantas no leguminosas. Brasilia: EMBRAPA, SPI.; Itagua:
EMBRAPA, CNPAB, 1995. 60p.

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http://www.cnpab.embrapa.br/pesquisas/projetos/

33
ANEXO

34
35
 ANEXO N 02: CROQUIS DEL EXPERIMENTO

23.5 m

6.5 m 2m
I II III

V1I1 V1I2 V2I2

5m

1m

V2I2 V2I2 V1

V1I2 V2I1 V1I1

35 m
V2I1 V1 V2

V1 V2 V2I1

V2 V1I1 V1I2

Area de bloque : 227.5 m2 Leyenda:

Area de parcela : 32.5 m2 V1 = Azul casagrande
Distancia entre bloque :2m V2 = CP74-2005
Distancia entre parcelas :1m I1 = Inoculante AC
Area total : 822.5 m2 I2 = Inoculante POJ

36
ANEXO N 03: DISEO DE PARCELA EXPERIMENTAL

6.5 m

1.5 m

o o o o
1m
o o
5m 2m
o o

o o o o

3m

Area de Parcela = 32.5 m2

Area a Evaluar = 6 m2
= Planta a Evaluar
ooo = Planta de borde

37
Resultados de anlisis de nitrgeno y carbono (UNAM)
Resultados de anlisis de sacarosa (UNAM)
Resultados de anlisis de suelos (UNSM)

38