MICROORGANISMOS DE IMPORTANCIA AGROINDUSTRIAL

La microbiologa industrial puede definirse diciendo que es parte de la Microbiologa

que se ocupa de las aplicaciones agroindustriales de los microorganismos, esta se ocupa
de la produccin de bienes y servicios con clulas microbianas, por lo tanto esta
representa una parte seguramente la ms importante de la biotecnologa. La
biotecnologa es una actividad multidisciplinaria que comprende la aplicacin de los
principios cientficos de la ingeniera al procesamiento de materiales por agente
biolgicos, estos pueden ser clulas microbianas, animales, vegetales enzimas, estos
bienes se extienden a cualquier producto industrial relacionado con alimentos, bebidas,
productos medicinales, etc. Y por servicios a aquellos vinculados a la purificacin de
aguas y tratamientos de efluentes.

TINCION GRAM
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con
el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el
medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de
colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o
para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos,
esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas,
proceso llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente,
aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehido, cidos y
alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el colorante, no se producen ulteriores
cambios estructurales en el protoplasma. La fijacin se realiza habitualmente en clulas
que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador,
y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el
encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan
mayores que lo que es realmente, de manera que las medidas de las clulas que han
sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin.

La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad
especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son
molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los
polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal
violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones)
y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como
muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo.
Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se
combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la
localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble
es el negro Sudn.

Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con
otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina
mordiente; un mordiente habitual es el cido tnico. El mordiente se combina con un
constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr atacar el colorante.

Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son

suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen
colorante simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no
produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til
para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor
parte del material no celular no se tie.

La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan
sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es
el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco
que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las
clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de partculas de carbono coloidal)
o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tincin negativa es un modo
satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la microscopia ptica, pero su
mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de las clulas
bacterianas.

Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin,
ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones
precipitados o agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son
formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales
estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener
la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una
estructura realmente existente.

METODO DE TINCION GRAN USADA EN LA AGROINDUSTRIAL PARA EL

RECONOCIMINETO DE:
BACTERIAS EN LOS ALIMENTOS
Las bacterias se identifican a travs de un examen microscopio para determinar la forma,
el tamao, agregacin, estructura y reaccin de tincin. Las bacterias son organismos
unicelulares aunque dependiendo del medio donde estn creciendo puede unirse unas
a otras formando colonias y pelculas inmersas en una especie de baba pegajosa que las
fija al sustrato y las protege de agresiones externas.
Las caractersticas fisiolgicas de las bacterias desde el punto de vista agroindustrial se
hacen necesarias conocer el crecimiento y actividad de las bacterias en los alimentos
que acompaan de cambios qumicos. Las reacciones de xido reduccin son utilizadas
por las bacterias para extraer energa de los alimentos originando a su vez alcoholes,
cidos orgnicos, aldehdos y cetonas. Los factores que influyen en el crecimiento
bacteriano, los factores que favorecen o inhiben el crecimiento y actividad microbiana
son por ejemplo: nutrientes, humedad, temperatura y concentracin.
La humedad que necesitan las bacterias, disponer de ms agua que las levaduras y
mohos, la importancia de esto determina el lmite del crecimiento, o sea crecen a bajas
concentraciones de azucares o sal.
La temperatura ptima es aquella a la cual mejor crecen los microorganismos, las
Psicrfilas crecen a temperatura de refrigeracin 0 y -5 C, la mayora son Mesfilas con
temperaturas que varan en 20 y 45 C, y son Termfilas a las que supera los 45 C. La
importancia de las bacterias en la industria prestando atencin a su utilizacin, podemos
nombrar:
Genero Pseudomonas: son capaces de efectuar alteraciones en los alimentos.
Genero Lactobacillus: fermentan azucares dando cido lctico como producto principal.
Genero Gluconobacter: su capacidad de oxidar el etanol a cido actico, de utilidad en
la fabricacin del vinagre.

HOGOS EN LOS ALIMENTOS

Son hongos multicelulares, filamentosos. Son de color blanco o bien de colores oscuros,
la mayora de los mohos necesitan menos humedad que las bacterias y las levaduras, la
temperatura de la mayora de los hongos, es decir que viven entre 25 y 30 C hasta unos
35 y 37 C. otros son psicrfilos, es decir viven alrededor de 0 C y algunos por debajo
de 0 C, otros son termfilos los que requieren temperaturas entre 45 y 60 C. los mohos
de importancia industrial, tenemos los: Phycomycetes; el phyticum, es el responsable
de la podredumbre de las hortalizas y adems es responsable de enfermar varias
especies vegetales. Mucor; este altera los alimentos y a la vez sirve para elaborar otros
tipos de alimentos por ejemplo: el Mucor Rouxxi interviene en el proceso de maduracin
del queso del tipo Gammelost. En el gnero Rhizopus Nigricans u hongo del pan altera
frutillas y hortalizas. Otro el Thamnidium por ejemplo Thamnidium Elegans lo
encontramos en las carnes refrigeradas.
EXAMEN DE MUESTRAS AL MICROSCOPIO
Segn la manipulacin que efectuemos sobre la muestra a observar y segn los colorantes que
empleemos durante el proceso, podemos hablar de diferentes modalidades de tincin.

Examen microscpico directo de las muestras clnicas Sin Tincin

No se utiliza ningn tipo de colorante.

Es el montaje directo hmedo o examen en fresco: las

muestras se extienden directamente sobre la superficie de
un portaobjetos para su observacin. El material que es
demasiado espeso para permitir la diferenciacin de sus
elementos puede diluirse con igual volumen de solucin
salina fisiolgica estril. Se deposita suavemente un
cubreobjetos sobre la superficie del material.

Este tipo de preparacin se emplea para detectar trofozotos mviles de parsitos intestinales
como Giardia, Entamoeba, huevos y quistes de otros parsitos, larvas y gusanos
adultos, Trichomonas, hifas de hongos, etc

En la imagen: Candida sp en un examen en fresco.

Examen microscpico de las muestras clnicas levemente modificadas

Tincin Simple

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras

celulares se tien con la misma tonalidad (Tinta china, Azul
Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).

El Hidrxido de potasio al 10% (solucin de KOH) permite ver

elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los
componentes proteicos, por ejemplo de la clula husped,
pero no acta sobre los polisacridos de las paredes
celulares de los hongos.

La tinta china o Nigrosina permite observar clulas levaduriformes capsuladas (Cryptococcus),

sobre todo en LCR. Los polisacridos capsulares rechazan la tinta china y la cpsula aparece
como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede
agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos.

En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tincin con tinta china.

Examen microscpico de las muestras clnicas muy modificadas Tincin
Diferencial

Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras

celulares se diferencian en funcin de los diferentes
colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitucin
qumica.

Los ejemplos clsicos sera la tincin de GRAM o la de Ziehl-

Neelsen

En la imagen: BGN y levaduras en una tincin GRAM

EXAMEN DE MUESTRAS AL MICROSCOPIO: LA TINCIN

GRAM
La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio
bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad
prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del Laboratorio de Microbiologa
las referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc) se
basan justamente en la tincin de GRAM

Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la

siguiente: el Frotis fijado con calor se tie 1 min con Violeta
Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin Yodada
durante 1 min y se lava de nuevo con agua, decolorar con
mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y cubrir con
Safranina (color de contraste) durante 20 seg. Lavar y secar.

Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans

Christian Gram, quien la desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram,
las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los
trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente
designan dos grupos morfologicos distintos de bacterias).

Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias
constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula bacteriana sirve
para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material de
la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula gram-
positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano as como algo
de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es
peptidoglicano. La pared de la clula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho
ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior
compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la
clula gram-negativa es peptidoglicano.

Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de

la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu con algn detalle la tincin de
Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqu de su funcionamiento.

Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de cristal
violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el
exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las grampositivas como las
gramnegativas, estn teidas de azul.

El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El ingrediente

activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma
un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas grampositivas
como las gramnegativas se encuentran en la misma situacin.

Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla

de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el
complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos
(grampositivos) no se decoloran, mientras que otros
(gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos
dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la
decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al
hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas, la
mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared
de la clula (y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano).
La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la
clula se decolora. Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas
(tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente ya que ste
deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas y
provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular.
Despus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava azules, pero las gramnegativas
son incoloras.

Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de
la coloracin de contraste las clulas gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas
permanecen azules.

Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram:

1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo
tiene poca afinidad con las clulas.
2) La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las clulas
grampositivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del
tiempo para obtener resultados satisfactorios.

3) Cultivos ms viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal

violeta - yodo.

El carcter de grampositivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. Algunos organismos

son ms grampositivos que otros y algunos son gram-variables, es decir, unas veces
grampositivos y otras gramnegativos.

REFERENCIAS
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm
Universidad Nacional de La Rioja Sede Santa Rita de Catuna Microbiologa
Industrial:http://www.academia.edu/14239154/Microbiolog%C3%ADa_In
dustrial_-_Ingenier%C3%ADa_AgroIndustrial