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FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE TECNOLOGIA MEDICA
BIOQUIMICA
PRACTICO N1:
ESPECTROFOTOMETRIA
1.- INTRODUCCIN
La energa de una onda electromagntica est dada por la ecuacin: E = h, donde h es la constante
de Planck y v es el nmero de onda (el recproco de la longitud de onda ).
Si una luz blanca pasa a travs de una solucin que contiene compuestos que actan como
cromforos, ciertas longitudes de onda son absorbidas selectivamente. El color resultante de la
solucin se debe a la luz transmitida.
La absorcin de luz por parte de una sustancia es una propiedad caracterstica de ella, que puede ser
utilizada para su identificacin y cuantificacin, ya que un compuesto determinado tiene un
espectro de absorcin caracterstico, por lo tanto la comparacin del espectro de este compuesto
puro con los espectros de compuestos conocidos permitir su identificacin.
Se refieren a las relaciones existentes entre la cantidad de absorbente y el grado con el que es
absorbida la energa radiante. En trminos generales, puede decirse que hay dos variables capaces
de afectar al grado de absorcin: la concentracin del absorbente y la longitud del trayecto que el
rayo luminoso recorre a travs de la solucin.
A=lc
Cuando las medidas se efectan utilizando siempre la misma cubeta (o bien un grupo de cubetas
estandarizadas que posean un paso de luz constante) y los efectos pticos debidos a la cubeta son
reproducibles, el trmino l de la expresin de la absorbancia se hace constante. Dado que , es
tambin constante para un determinado absorbente y una concreta longitud de onda, resulta
entonces que la absorbancia es directamente proporcional a la concentracin:
A=kc (k = l).
Posee una fuente de luz capaz de emitir luz a las longitudes de onda que se quiere medir. El
selector de longitud de onda permite el paso de la luz a la longitud de onda deseada. Una rendija
u orificio define la intensidad de luz incidente sobre la muestra dispuesta en una celda o cubeta
que posee un dimetro de 1 cm y no interfiere con el paso de la luz, y finalmente, la luz emitida
despus de su paso por la celda es cuantificada por un detector.
La fuente de luz emite un rango continuo de longitudes de onda y es regulada por voltaje.
Generalmente, la luz del rango visible es emitida por una lmpara de tungsteno (340-900 nm) y la
luz UV es emitida por una lmpara de deuterio (200-360). Las cubetas empleadas son de vidrio para
el rango visible y de cuarzo para el rango UV (el vidrio no es transparente a la luz UV).
A = 2 - log % T
100
80
% 60 Absorbancia
Transmitancia 40
20
concentracin (g/l) concentracin (g/l)
Curvas de calibracin
Una curva de calibracin relaciona las A %T con las concentraciones y su empleo es necesario en
los trabajos cuantitativos en los que hay que calcular la concentracin del absorbente. Siempre que
sea posible, es aconsejable la construccin de una curva de calibracin que cubra la zona de
concentraciones que se van a encontrar en la prctica.
A1 / A2 = C1/ C2
Donde:
l. Encendido de lmparas:
1.1.- Lmpara de tungsteno (Zona del visible, 900 a 340 nm), encendido instantneo
1.2.- Lmpara de Deuterio (Zona del UV, 340 a 200 nm aprox), encienda el equipo 30 min
antes de usarlo
2. Oprima la tecla A/T/C para accionar el modo absorbancia
3. Seleccionar la longitud de onda con el mando correspondiente.
4. Inserte el blanco en el portaceldas y cierre la puerta del compartimiento de muestras
5. Oprima la tecla 0 ABS para llevar a cero absorbancia
6. Saque el blanco e inserte la muestra problema en el portaceldas, cierre la puerta del
compartimiento.
7. Lea la medicin de absorbancia en la pantalla.
425 575
450 600
475 625
500 650
525 675
Cuando tenga el espectro determine la longitud de onda del mximo de absorcin y calibre el
equipo a dicha longitud de onda ( mx).
Prepare 5 diluciones seriadas de su colorante (1/2, 1/4, 1/8 y 1/16) y mida la absorbancia. No
necesita recalibrar el equipo al no cambiar la longitud de onda.
Grafique en papel milimetrado absorbancia v/s concentracin y determine el coeficiente de
extincin molar de su colorante.