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Separao e Purificao de Protenas

Cromatografia de afinidade com metal imobilizado


e suas variantes

baseada na afinidade das protenas


Amin Karmali pelos metais de transio. Esta
Laboratrio de Engenharia Bioqumica
tcnica foi denominada
Seco de Biotecnologia do Departamento de Engenharia Qumica cromatografia de afinidade com
metal imobilizado , do ingls,
Instituto Superior de Engenharia de Lisboa.
Immobilized Metal Affinity
Rua Conselheiro Emdio Navarro Chromatography (IMAC). O
1900 Lisboa Portugal princpio fundamental do IMAC
consiste na interaco entre as
Tel : 21-8317052 Fax: 21-8317267 protenas em soluo e os ies
e-mail: akarmali@ scientist.com. metlicos imobilizados num suporte
slido. Estes suportes contendo ies
de Cu2+ ,Ni2+ , Zn2+ ou Co2+ so
Resumo activadas por metais e apropriados (adequados) para o
metaloenzimas); 2- suporte e fraccionamento de protenas com
Neste artigo so abordados os estrutural ( protenas constituintes de base no seu contedo relativo de
conceitos bsicos da cromatografia membranas celulares, tecidos e resduos de histidina, cistena,
de afinidade com metal imobilizado cartilagens) e 3 - transporte cadeias laterais aromticas de
(IMAC) em termos de mecanismos (hemoglobina) entre outras. aminocidos e de grupos N-terminal
de reteno de protenas, tipo de acessveis de aminocidos (Porath,
resduos aminoacdicos envolvidos, 1992). Estes resduos devem estar
seleco do metal, introduo de 2. Cromatografia de disponveis superfcie das protenas
caudas de resduos de histidina afinidade com metal com vista formao de interaces
nas protenas e metodologia com os metais de transio (Cu 2+
experimental. As vantagens e
imobilizado (IMAC) ,Ni2+ , Zn2+ ou Co2+). Assim, esta
inconvenientes do IMAC em relao Em 1975 Porath e colaboradores tcnica permite no s a purificao
cromatografia de afinidade (AC) apresentaram uma tcnica de de protenas com base na presena
so discutidas. Algumas variantes da separao e purificao de protenas destes resduos sua superfcie como
tcnica do IMAC so apresentadas
nomeadamente, a partio por
afinidade com metal imobilizado
(IMAP), electroforese em gel de
afinidade com metal imobilizado
(IMAGE) e electroforese capilar de
afinidade com metal imobilizado
(IMACE). Os princpios bsicos
destas tcnicas so referidos bem
como as suas vantagens e
desvantagens em relao ao IMAC.
Introduo

1. Introduo
A afinidade das protenas pelos ies
metlicos j conhecida h mais de
um sculo. A habilidade das
protenas se ligarem aos ies
metlicos largamente explorada nos
sistemas biolgicos para
desempenhar vrias funes a seguir
discriminadas: 1- catlise (enzimas Figura 1. Sntese de Sepharose 4B- epox-activada-IDA como adsorvente do IMAC.

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tambm uma anlise estrutural utilizao destas interaces para fins longo brao espaador hidrfilo
topolgica detalhada das protenas. cromatogrficos requer que o io (Figura 1).
metlico seja imobilizado num
O brao espaador assegura que o
suporte insolvel. Esta imobilizao
2.1. Mecanismo de reteno de metal quelante est totalmente
pode ser efectuada ligando um grupo
protenas acessvel para todos os centros de
quelante matriz cromatogrfica.
ligao disponveis numa protena
O princpio do IMAC baseia-se no Existem vrios agentes quelantes
(Figura 2).
facto de que os metais de transio usados no IMAC sendo o cido
(Cu 2+ , Ni2+ , Zn2+ e Co2+) podem iminodiactico (IDA) o mais Como os metais podero coordenar
coordenar com alguns aminocidos utilizado . Este composto pode ser com 4 a 6 ligandos, os restantes
tais como a histidina, cistena e acoplado a vrias matrizes centros de coordenao esto
triptofano, atravs dos grupos cromatogrficas nomeadamente a ocupados com molculas de H20 ou
dadores de electres nas cadeias Sepharose 6B, Sepharose 4B ou ies de solues tampes que podem
laterais desses aminocidos . A Sephadex G-100 atravs de um ser removidos ou desalojados por
grupos funcionais apropriados da
protena. Como est ilustrado na
Figura 3, o Cu(II)-IDA coordena
com o tomo de azoto oude um
resduo de histidina disponvel
superfcie da protena. A formao
de um complexo ternrio entre o
quelato com o seu io metlico
ligado e a protena provoca reteno
no IMAC.

2.2 Os aminocidos envolvidos


na ligao ao metal.

Nas metaloprotenas, um elevado


nmero de grupos funcionais
participam na ligao ao metal
nomeadamente os resduos de Glu,
Tyr, Cys, His, Arg, Asp, e Met.
Contudo, no IMAC as cadeias
laterais da histidina dominam a
Figura 2. Representao diagramtica de um adsorvente de IMAC (gel de IDA-Me).
ligao das protenas aos quelatos de
Representao das letras Me, P e X: Me metal; P suporte cromatogrfico insolvel e X - H20, metal imobilizados (Yip et. al.,
ies de soluo tampo ou resduo aminoacdico da protena (Adaptado de Porath e Olin, 1983). 1994). Embora as cistenas livres
possam ligar-se aos quelatos de
metal, na prtica estes resduos esto
raramente disponveis no estado
reduzido apropriado. Com efeito, os
resduos de cistena expostos
superfcie da protena so
rapidamente oxidados na presena de
ies Cu2+ com a formao de pontes
dissulfureto (Arnold, 1991; Sousa e
Karmali, 1998). Os grupos N-
terminal das protenas tambm se
ligam aos quelatos de metais a
valores de pH a partir de 8.0 quando
esto na forma no-protonada
(Tabela 1).
Os aminocidos contribuem na
ligao aos quelatos de metal de duas
formas: 1- ligao directa ao metal e
Figura 3. Resduo de histidina coordenado ao Cu(II)-IDA que est imobilizado a um suporte 2- indirectamente, devido ao seu
cromatogrfico insolvel (Adaptado de Arnold, 1991).

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elevado grau de pureza e rendimento


Tabela 1. Mecanismos de ligao de protenas aos quelatos de de actividade biolgica.
metal imobilizados [Cu(II), Ni(II) e Zn(II)-IDA]; contribuies relativas
das cadeias laterais de aminocidos e do N-terminal de protenas.
2.5. Metodologia experimental

Grupo funcional Contribuio Mecanismo A metodologia experimental bsica


do IMAC bastante simples. Esta
Cadeias laterais
tcnica envolve trs passos
His ++++ directo principais: 1 carregamento da
Cys ++++* directo coluna com o metal apropriado; 2-
adsoro das protenas coluna e 3-
Asp, Glu - indirecto
eluio das protenas (Pacheco e
Lys, Arg + Indirecto** Karmali, 1998).
Trp, Tyr, Phe + indirecto De uma maneira geral, o
N-terminal ++ directo carregamento da coluna do IMAC
envolve a passagem da soluo de
* Um resduo de cistena ir ligar-se no IMAC apenas na forma reduzida. Os metais catalisam a um sal de metal (ZnCl2, CuS04 ou
oxidao da Cys. NiCl2) sobre a coluna que est
** O mecanismo torna-se directo a altos valores de pH (Adaptado de Arnold, 1991). previamente empacotada com o gel
efeito na acessibilidade dos resduos no contm grupos funcionais (His, (Sepharose 6B-epoxi-activada
de histidina. As cadeias laterais Trp e Phe) disponveis superfcie IDA). Seguidamente, a coluna
aromticas de aminocidos (Trp, para coordenao de metais, podem lavada com H20 para remoo de
Phe, and Tyr) aparentemente ser modificadas atravs da ies Cu(II) em excesso e equilibrada
contribuem na reteno de protenas tecnologia da engenharia gentica de com uma soluo tampo apropriada.
no IMAC devido a um efeito forma a apresentar afinidade por De uma maneira geral, usa-se o
indirecto que aumenta e fortalece as quelatos de metal imobilizados tampo fosfatos 50mM contendo
interaces Cu2+-residuos de (Gaberc-Porekar et. al, 1999; Muller NaCl 1M a pH 7.0.
histidina bem como a estabilidade et. al., 1998). Assim, uma cauda de A prxima etapa consiste na
destes complexos (Arnold, 1991). resduos de His pode ser introduzida aplicao da amostra contendo a
no N-ou C-terminal de uma protena protena a purificar a um caudal de
sendo esta protena produzida na 10 a 20 cm3/h. A coluna lavada
2.3. Seleco do metal
forma recombinante contendo um com a soluo tampo de
A afinidade aparente de uma protena pequeno peptido de 4 a 6 residuos de equilibrao at a A280 apresentar um
para um quelato de metal depende His no respectivo terminal. Estas valor inferior a 0.05 e seguidamente
fortemente do io metlico envolvido protenas geneticamente manipuladas procede-se eluio da protena
na coordenao. A reteno de uma contendo um peptido com afinidade adsorvida na coluna. A eluio de
protena nos diferentes metais est de pelos quelatos de metal podem ser protena pode ser efectuada por
acordo com a afinidade do metal pelo purificadas por IMAC sendo o vrios mtodos nomeadamente
imidazole. Assim, quer a reteno de pptido removido da protena atravs atravs de: 1- gradiente decrescente
protenas quer as constantes de da aco de uma protease obtendo- de pH; 2- gradiente crescente de um
estabilidade dos complexos com se assim a protena na forma nativa e ligando competitivo (ex: imidazole) e
imidazole obedecem seguinte biologicamente activa. 3- gradiente crescente de um agente
ordem : Cu2+ > Ni2+ > Zn2+ ~Co2+ Esta estratgia foi usada com sucesso quelante (ex. EDTA). Contudo o
(Arnold, 1991). na purificao num s passo mtodo de eluio mais usado no
cromatogrfico por IMAC de vrias IMAC consiste num gradiente linear
protenas de interesse industrial e de imidazole (0-30mM) no mesmo
2.4. Introduo de caudas de sistema de tampo. Por fim, a coluna
His nas protenas teraputico, nomeadamente a
interleuquina 1 humana (Patwardhan pode ser regenerada com uma
recombinantes soluo de EDTA 50mM, carregada
et. al., 1997), -galactosidase e
Na ltima dcada , tem-se observado transcriptase reversa do HIV novamente com o metal apropriado
um crescente interesse na engenharia (Vosters et. al, 1992). Por e equilibrada com uma soluo
de centros de ligao de metais nas conseguinte, esta tcnica poder ser tampo apropriado para uma nova
protenas para a catlise, regulao til na montagem de um mtodo corrida cromatogrfica.
da actividade enzimtica, universal de purificao de
reconhecimento e purificao de protenas recombinantes num s
protenas. As protenas nativas que passo cromatogrfico , com um

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2.6 IMAC e cromatografia de 3. Partio por afinidade vrias protenas nomeademante,


afinidade (AC) com metal imobilizado isoenzimas de lactato e malato
desidrogenases (Otto and
Atravs das consideraes tecidas (IMAP)
Birkenmeier, 1993; Pesliakas et. al.,
nos pontos anteriores, podemos 1994) bem como na separao de
O sistema de duas fases aquosas
constatar que o IMAC uma tcnica vrios tipos de clulas animais
uma tcnica poderosssima de
poderosssima de separao e (Laboureau and Vijayalashmi, 1997;
separao e purificao de protenas
purificao de protenas com Nanak et. al., 1995).
(Karmali and Serralheiro, 1988;
aplicao potencial escala
Huddleston et. al., 1991). Baseando- Alm da possibilidade de se efectuar
industrial. O IMAC apresenta
se na teoria do IMAC, foi a separao de vrios tipos de
algumas semelhanas tcnica
demonstrado que a introduo do clulas, esta tcnica apresenta uma
convencional de cromatografia de
Cu(II)-IDA-polietileno glicol (PEG) vantagem em relao tcnica
afinidade (AC) e a Tabela 2
no sistema de duas fases aquosas de convencional do IMAC na medida
(Adaptado de Arnold, 1991) resume
PEG-dextrano aumenta a partio de em que permite a purificao de
as principais vantagens e
protenas contendo resduos de protenas directamente a partir do
inconvenientes destas duas tcnicas.
histidina acessveis sua superfcie extracto celular bruto contendo
na fase superior rica em PEG fragmentos e detritos celulares.
2.7 Aplicaes do IMAC (Pesliakas et. al., 1994). De uma
maneira geral, o mecanismo de
O IMAC uma tcnica de separao reteno de protenas observado no
e purificao de protenas largamente 4. Electroforese em gel de
IMAC tambm se mantm, na
usada no isolamento de enzimas e partio de afinidade com metal
afinidade com metal
anticorpos num s passo imobilizado, do ingls, Immobilized imobilizado (IMAGE)
cromatogrfico.(Boden et. al., 1995; Metal Affinity Partitioning (IMAP).
Pacheco e Karmali, 1998; Chaga et. A electroforese em gel de afinidade
Alm da separao e purificao de
al., 1999). Estas protenas so com metal imobilizado, do ingls,
protenas, esta tcnica tambm foi
purificadas com um elevado Immobilized Metal Affinity Gel
usada na separao de vrios tipos de
rendimento de actividade biolgica e Eletrophoresis (IMAGE) um dos
clulas nomeadamente eritrcitos
apresentam elevado grau de pureza mtodos derivado do (IMAC).
humanos e de coelho (Botros et. al.,
(Sousa e Karmali, 1998; Martinho et. Assim, o quelato de metal (IDA-
1991), linfcitos B e T e monocitos
al., 1998). As caractersticas desta Cu(II)) ligado covalentemente a
(Laboureau et. al., 1996). O
tecnologia permitem que seja usada um polmero (PEG 5000) e
mecanismo bsico de reteno de
escala industrial para isolamento de incorporado na agarose solvel como
protenas observado no IMAC
protenas de interesse comercial. matriz de separao electrofortica
tambm se aplica, de uma maneira
(Goubran-Botros et. al., 1992). Os
Por outro lado, o IMAC apresenta geral, neste sistema celular de IMAP
resultados demonstraram claramente
aplicaes interessantes na anlise na medida em que ocorrem
que o mecanismo de reteno de
topolgica de protenas podendo interaces entre os resduos de
protenas no IMAC se mantinha na
diferenciar protenas mutantes ou histidina acessveis superfcie das
variante de IMAGE. Efectivamente,
alteradas com uma nica substituio protenas membranares dos
as protenas padro contendo n s
aminoacdica na cadeia polipeptdica eritrcitos e o quelato de metal em
crescentes de residuos de histidina
(Hemdan et. al., 1989; Martins, et. soluo. Esta variante do IMAC foi
disponveis superfcie
al., 2000). usada com sucesso na purificao de
apresentavam uma forte ligao aos
quelatos de metal obtendo-se baixos
Tabela 2. Estudo comparativo do IMAC e da cromatografia de valores de constante de dissociao
(Kd). Esta tcnica de IMAGE
afinidade (AC). apresenta uma vantagem em relao
ao IMAC na medida em que uma
IMAC AC tcnica essencialmente analtica
Estabilidade do ligando elevada baixa permitindo a quantificao de
interaces das protenas com os
Capacidade da coluna elevada baixa quelatos de metal atravs da
Condies de eluio suaves drsticas determinao de Kd (Baek et. al.,
1996). Contudo, apresenta alguns
Recuperao do ligando geral/incomplet
aps regenerao
completa
a inconvenientes nomeadamente as
condies do IMAC (fora inica,
Selectividade baixa-mdia elevada pH, agentes no quelantes) devem
Custo baixo elevada

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Separao e Purificao de Protenas

ser mantidas e o uso de uma gama de de purificao de protenas. Por outro Immobilized metal ion affinity
pH entre 6.0 7.0. lado, estas tcnicas apresentam electrophoresis. A study with several
muitas potencialidades na anlise model proteins containing histidine. J.
estrutural de protenas mutantes ou Chromatography 597, 357-364.
5. Electroforese capilar de alteradas e protenas de espcies Haupt, K., Roy, F. and Vijayalakshmi,
diferentes. M.A.A (1996) Immobilized metal ion
afinidade com metal affinity capillary electrophoresis of
imobilizado (IMACE) proteins- a model for affinity capillary
Agradecimentos electrophoresis using soluble polymer-
Uma outra variante de IMAC foi supported ligands Anal. Biochem. 234,
desenvolvida que envolve a A. K. agradece Fundao para a 149-154.
utilizao de pequenos ligandos Cincia e Tecnologia pela atribuio
Hemdan, E. S., Zhao, Y., Sulkowski, E.
ligados covalentemente a uma matriz de bolsas PRAXIS (BTI) Carla and Porath, J. (1989) Surface tography
solvel e substituvel. O quelato de Sousa e Vanda Pacheco para a of histidine residues: A facile probe by
metal (IDA-Cu(II)-PEG) foi usado realizao do trabalho de immobilized metal ion affinity
num sistema modelo e as interaces investigao sobre o IMAC. chromatography Proc. Natl. Acad. Sci.
com diferentes protenas modelo foi USA 86, 1811-1815.
investigado (Haupt et. al., 1996). Huddleston, J., Veide, A, Kohler, K.,
Este mtodo permite a determinao Referncias Flanagan, J., Enfors, S. and Lyddiatt, A
de constantes de dissociao (Kd) (1991) The molecular basis of
que apresentam uma correlao com Arnold, F. H. (1991) Metal-affinity partitioning in aqueous two-phase
separations: a new dimension in protein
o n. de resduos de histidina systems Trends in Biotechnol. 9, 381-
processing Bio/Technology 9, 151-156. 388.
acessveis e o microambiente da
histidina na protena. O mecanismo Baek, W.O., Haupt, K., Colin, C. and Jiang, K. Y., Pitiot, O., Anissimova, M.,
bsico observado no IMAC tambm Vijayalakshmi, M. A. (1996) Adenier, H. and Vijayalakshmi, M. A
Immobilized metal ion affinity gel (1999) Structure-funtion relationship in
se mantinha nesta variante
electrophoresis: quantification of protein glycosylated alpha-chymotrypsin as
denominada electroforese capilar de
affinity to transition metal chelates. probed by IMAC and IMACE Biochim.
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Capillary Electrophoresis (IMACE).
Vijayalakshmi, M. and Porath, J. (1995) Improved purification and properties of
Esta variante do IMAC necessita de
Rapid one-step purification of goat glucose dehydrogenase from Bacillus
pequenssimas quantidades de immunoglobulins by immobilized metal
amostra e permite quantificar as subtilis. Biochimie 70, 1401-1409.
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Botros, H.G., Birkenmeier, G., Otto, A., (1996) Study of human cord blood
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entre a estrutura e funo de affinity partitioning of cells in aqueous B Biomed. Appl. 680, 189-195.
protenas (Haupt et. al., 1996; Jiang two-phase systems: erythrocytes as a
et. al., 1999). Contudo, esta tcnica model Biochim. Biophys. Acta 1074, Laboureau, E. and Vijayalaksmi, M. A
apresenta algumas desvantagens 69-73. (1997) Concerning the separation of
mammalian cells in immobilized metal
nomeadamente as condies do Chaga, G., Hopp, J. and Nelson, P. ion affinity partitioning systems: a matter
IMAC (fora inica, pH, agentes no (1999) Immobilized metal ion affinity of selectivity. J. Mol. Recognit. 10, 262-
quelantes) devem ser mantidas, uso chromatography on Co+- 268.
de uma gama de pH entre 6.0 7.0 e carboxymethylaspartate-agarose
Superflow, as demonstrated by one-step Martinho, F., Massano, F., Karmali, A.
elevado gradiente de potencial
purification of lactate dehydrogenase and Brown, P.R. (1998)
elctrico.
from chicken breast muscle Biotech. Chromatographic behaviour of amidases
Appl. Biochem. 29, 19-24. from strains of Pseudomonas aeruginosa
on immobilized metal chelates (1998)
6. Concluses Gaberc-Porekar, V., Menart, V., International J. Biochromatography 4,
Jevsevar, S., Vidensek, A and Stalc, A 101-114.
As consideraes apresentadas neste (1999) Histidines in affintiy tags and
surface clusters for immobilized metal- Martins, S., Pacheco, V., Pacheco, R.,
artigo permitem concluir que o Karmali, A and Brown, P.R. (2000)
ion affinity chromatography of trimeric
IMAC e suas variantes so tcnicas Differential chromatographic behaviour
tumor necrosis factor alpha J.
poderosssimas de separao de of recombinant wild-type and altered
Chromatography A 852, 117-128.
protenas e com o auxlio da amidases in immobilized metal chelates
engenharia de protenas ser Goubran-Botros, H., Nanak, E., Adbul International J. Biochromatography 6 (in
Nour, J., Birkenmeir, G. and press).
possvel, num futuro prximo,
Vijayalakshmi, M. A (1992)
desenvolver um mtodo universal

6 Boletim de Biotecnologia
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Muller, K.M., Arndt, K.M., Bauer, K. Patwardhan, A V., Goud, G. N., Koepsel, affinity chromatography of Biomaterials.
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immobilized metal-ion affinity of optimum affinity tags from a phage- immobilized iron and nickel ions
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purification of His-tagged proteins- immobilized copper (II) affinity Sousa, C. and Karmali, A (1998) One-
evaluation of two anti-His-tag chromatography J. Chromatography A step purification of urease from
monoclonal antibodies Anal. Biochem. 787, 91-100. Canavalia ensiformis by immobilized
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Nanak, E., Vijayalakshmi, M. A and Baskeviciute, B. (1994) Immobilized International J. Biochromatography 4,
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Microbiol. and Biotech. 21, 57-64.

Bionotcias

O 27o Encontro da FEBS, em 2001, em Portugal, em Lisboa


actualidade e relevncia. Durante o Encontro, realizar-
O 27o Encontro da FEBS (Federation of European
se-o ainda vrias sesses de exibio de paineis,
Biochemical Societies) vai realizar-se, de 30 de Junho a
durante as quais ser favorecida a troca de ideias entre
6 de Julho de 2001, em Lisboa. Este Encontro da FEBS
os participantes e, entre os resumos dos trabalhos
organizado em colaborao com a PABMB (Pan-
submetidos para exibio em painel, sero
American Association for Biochemical and Molecular
seleccionados alguns para apresentao oral. Durante o
Biology). Informaes detalhadas sobre o Programa,
Encontro, decorrer ainda uma exposio de material
condies de inscrio e de candidatura a bolsas a
tcnico, por parte das principais empresas nacionais e
atribuir a jovens participantes, encontram-se no
internacionais. Pela iniciativa e ousadia, aqui se
seguinte web-site:
cumprimenta a Sociedade Portuguesa de Bioqumica e
http://www.itqb.unl.pt/FEBS2001/ a Comisso Organizadora FEBS 2001, na pessoa da
A realizao deste Encontro internacional em Portugal sua Presidente, a Prof Claudina Rodrigues-Pousada.
, simultaneamente, uma grande responsabilidade e Em nome da Comisso Organizadora, convida-se todos
uma grande oportunidade para a comunidade cientfica os que utilizam uma abordagem Bioqumica, na
Portuguesa que desenvolve a sua actividade em torno compreenso dos fenmenos biolgicos e suas
da Bioqumica. O FEBS 2001 representa uma aplicaes, a participar activamente neste Encontro
excelente oportunidade para essa comunidade internacional. Chama-se ainda a ateno para as
cientfica evidenciar o nvel atingido no seguintes datas importantes:
desenvolvimento dos seus programas de investigao.
Permitir ainda, principalmente aos mais jovens, Inscrio e submisso de Resumos:
usufruir, no seu Pas, da experincia e do contacto com at 28 de Fevereiro de 2001
um magnfico e diversificado conjunto de cientistas Submisso de Candidaturas a Bolsas:
convidados que participaro em 8 lies plenrias, 35 at 10 de Janeiro de 2001
simpsios e 14 Workshops, sob temas de grande
(continua na pgina 17)

Boletim de Biotecnologia 7