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Instituto Tecnolgico de

Morelia

Alumno: Osmar Wilebaldo Sols Morales

Profesor: Juan Carlos Gonzlez Hernndez

Materia: Cintica Qumica Biolgica

Unidad: IV

Trabajo: Inmovilizacin de enzimas


ndice

Introduccin

Contenido
1.-) Aspectos generales sobre la inmovilizacin de enzimas.
2.-) Ventajas e inconvenientes.
3.-) Mtodos de inmovilizacin.
4.-) Soportes de inmovilizacin.
5.-) Adsorcin.
5.1.-) adsorcin por interaccin hidrofbicas.
5.2.-) adsorcin por interacciones inicas.
5.3.-) adsorcin por afinidad.
5.4.-) adsorcin por coordinacin a un metal.
6.-) Atrapamiento.
7.-) Unin covalente.
7.1.-) Formacin de enlaces diazo.
7.2.-) Formacin de enlaces tipo peptdico.
7.3.-) Formacin de enlaces de Schiff.
7.4.-) mtodo de alquilacin o arilacin.
7.5.-) Reacciones de intercambio tio-disulfuro.
8.-) Entrecruzamiento o Reticulado.
9.-) Comparacin entre los mtodos de inmovilizacin.
10.-) Eleccin del mtodo.
11.-) Propiedades de las enzimas inmovilizadas.
12.-) Actividad cataltica.
13.-) Especificidad por el sustrato.
14.-) Constantes cinticas.
14.1.-) Constante de Michaelis (Km).
14.2.-) Velocidad mxima (Vmax).
15.-) Temperatura y pH.
16.-) Estabilidad.
17.-) Aplicacin de las enzimas inmovilizadas.

Referencias
Introduccin En 1985 se llev a cabo la
inmovilizacin de mltiples
Las enzimas son biomolculas enzimas para su uso, por ejemplo
especializadas en la catlisis de las en la produccin de L-aminocidos
reacciones quimias que tiene lugar a partir de ceto-cidos a partir de
la clula. Son muy eficaces como reactores de membrana.
catalizadores ya que son capaces
Los componentes principales de un
de aumentar la velocidad de las
sistema de inmovilizacin
reacciones qumicas mucho ms
enzimtico son la enzima, la
que cualquier catalizador artificial
matriz o soporte y el mtodo
conocido, y adems son altamente
de fijacin. Alguna de sus
especficos ya que cada uno de
propiedades como la actividad
ellos induce la transformacin de
cataltica o la estabilidad trmica
un solo tipo de sustancia y no de
llegan a ser alteradas, sin
otras que se pueden encontrar en
embargo puede conservar su
el medio de reaccin.
funcionalidad durante varios ciclos.
La estabilidad estructural de las
enzimas durante las reacciones
bioqumicas son algunos de los
desafo principales en el estudio de
los biocatalizadores. Se han
desarrollado diferentes tcnicas
con el fin de inmovilizar las
enzimas que contengan un
Figura 1. Componentes de un sistema de
eficiencia funcional y mayor
inmovilizacin: enzima, soporte y tcnica de
reproducibilidad.
inmovilizacin.
De esta manera la inmovilizacin
de enzimas se refiere al hecho de Debe tener en cuenta el
limitar o retardar el movimiento. conocimiento de las propiedades
La enzima inmovilizada es aquella de los materiales del soporte y los
que esta confinada en un espacio procesos de inmovilizacin.
definido, que retiene su actividad
1.-) Aspectos generales sobre
cataltica y puede ser reutilizada
la inmovilizacin de enzimas.
de forma continua.
Segn IUPAC la inmovilizacin es
La inmovilizacin se remonta al
una tcnica utilizadas para
estudio de las biopelculas, las
conseguir la fijacin fsica o
cuales son una superficie de
qumica de clulas, orgnulos,
conexiones de comunidades
enzimas u otras protenas en un
microbianas que consisten en
soporte slido, una matriz solida o
mltiples capas de clula
mediante retencin de una
incrustada en matrices hidratadas.
membrana, con el fin de aumentar
su estabilidad y hacer posible su
uso repetido o continuado
Concretamente las enzimas El biocatalizador es ms
inmovilizadas pueden ser definidas caro que la enzima nativa.
como enzimas fsicamente
confinadas o localizadas en una
cierta regin definida del espacio
con retencin de su actividad
cataltica y que puede ser usadas
repetidamente y de modo
continuo (Chibata, 1978)

2.-) Ventajas e inconvenientes

Como ventajas del empleo de


enzimas inmovilizadas podemos
destacar:

El aumento de la estabilidad
de la enzima.
La posible reutilizacin del
derivado, por lo que
disminuye los costes del
proceso.
La posibilidad de disear un
reactor enzimtico de fcil
manejo y control, adaptado
a la aplicacin de la enzima
inmovilizada.

Como inconvenientes del


proceso de inmovilizacin:

La alteracin de la
conformacin de la enzima
respecto de su estado
nativo.
La gran heterogeneidad del
sistema enzima-soporte
donde pueden existir
distintas fracciones de
protenas inmovilizadas con
un diferente nmero de Tabla 1. Ventajas e inconvenientes del
uniones. sistema de inmovilizacin de enzimas.
Siempre suele haber una
prdida de inactividad de la
enzima durante la
inmovilizacin.
3.-) Mtodos de inmovilizacin.

Los numerosos mtodos Existen cinco mtodos principales


empleados para llevar a cabo la para inmovilizacin de enzimas o
inmovilizacin de enzimas se han clulas: adsorcin, unin
clasificado atendiendo a diversos covalente, entrecruzamiento,
criterios, como por ejemplo, la encapsulamiento y
naturaleza fsica o qumica de la atrapamiento.
inmovilizacin (arroyo, 1998) o su
carcter reversible o irreversible Los mtodos ms utilizados de
(brena y batista-viera, 2006). inmovilizacin son:

Algunos grupos funcionales de la Adsorcin


enzima pueden dar lugar a fuertes
enlaces covalentes que la unan a
un soporte o a otras molculas de
la enzima, la inmovilizacin
tambin puede ocurrir por
adsorcin de la enzima a un
soporte. Las enzimas pueden ser
inmovilizadas por atrapamiento,
donde la enzima no da lugar a
ningn tipo de enlace si no que
esta retenida fsicamente. Todos
estos mtodos se detallaran a Figura 2. Mtodo de
continuacin. adsorcin.

Atrapamiento

Tabla 2. Clasificacin de los distintos mtodos de Figura 3. Mtodo de


inmovilizacin de enzimas. Atrapamiento
Unin covalente Buena resistencia tanto al
pH como a la presin.
Buena disponibilidad.
Bajo coste.

Dependiendo de las caractersticas


fsicas del soporte:

Dimetro de partcula
Resistencia mecnica.
Compresin.

Tambin conociendo el tipo de


reactor:
Figura 4. Mtodo de unin
covalente. Tanque agitado.
Lecho empaquetado.
Tanque continuo o
El proceso de inmovilizacin ideal
descontinuo.
para una enzima es aquel que le
permite conservar una alta Los soportes de inmovilizacin se
actividad cataltica en el paso del pueden clasificar en dos grupos:
tiempo para ser utilizada soportes orgnicos y soportes
continuamente. inorgnicos. Los soportes de
inmovilizacin inorgnicos
Dependiendo de la estructura de la
presentan una alta estabilidad
protena y del material, as como
mecnica, qumica y frente a los
de las condiciones de reaccin
ataques bacterianos. Mientras que
ser el mtodo de inmovilizacin a
los soportes orgnicos son mas
utilizar.
verstiles, pueden ser diseados y
4.-) Soportes de sintetizados en el laboratorio para
inmovilizacin. provocar el tipo de interaccin
enzima-soporte deseado, la
La naturaleza de los soportes de mayora de los soportes de
inmovilizacin y el tipo de unin inmovilizacin empleados en
de la enzima con estos afecta de aplicaciones industriales son de
modo determinante al este tipo orgnicos.
comportamiento de la enzima
inmovilizada. Algunas de las
caractersticas ideales de las que
debera constar un buen soporte
de inmovilizacin son:

Buena estabilidad mecnica.


Adecuado tamao de
partcula y porosidad.

Tabla 3. Clasificacin de los distintos soportes


de inmovilizacin.
5.-) Adsorcin. polares presentes en la enzima
y el soporte. La fortaleza de la
Es el mtodo ms simple de
adsorcin ser mayor cuanto
inmovilizacin, se basa en enlaces
dbiles aunque tiene cierta eficacia mayor sea el carcter
en los procesos. Intervienen las hidrofbico de ambos, el
fuerzas de Van der Waals, soporte y la enzima.
interacciones inicas, y puentes de
5.2.-) adsorcin por
hidrogeno.
interacciones inicas.
Esta tcnica es de bajo costo, fcil
preparacin, el soporte se puede La adsorcin de una enzima a
recargar, pero uno de los un soporte mediante
inconvenientes es que el enlace es interaccin inica est basada
reversible y solo se puede en los principios que rigen las
monitorear la reaccin en periodos interacciones de naturaleza
cortos. electrosttica. Las cargas de la
Otros de los inconvenientes por enzima interaccin con aquellas
mencionar son: hay fuga del de signo opuesto del soporte,
biocatalizador, enlace inestable, no dando lugar as a la
es posible controlar lo anterior y inmovilizacin de la enzima.
por lo tanto tiene un ndice de
reproducibilidad bajo. Cuando los soportes empleados
poseen un gran nmero de
Los soportes ms utilizados se cargas y los sustratos y
encuentran la productos de la reaccin
carboximetilcelulosa, el enzimtica tambin estn
almidn, el colgeno, sepharosa cargados, la cintica enzimtica
modificada, resinas de suele verse distorsionada y
intercambio inico, silica gel, pueden ocurrir problemas
oxido de aluminio, titanio, tierra difusionales.
de diatomeas, cermica,
hidroxiapatita, cermica, etc. 5.3.-) adsorcin por
afinidad.
Todos los soportes dan bajas
cantidades de protenas (1 El principio de afinidad entre
mg/g de soporte). biomolculas complementarias
se ha aplicado tambin a la
5.1.-) adsorcin por inmovilizacin de enzimas
interaccin hidrofbicas. (Brena y batista-viera, 2006).
La mayor ventaja de este
La adsorcin mediante
mtodo se encuentra en el alto
interacciones hidrofbicas tiene
grado de selectividad de la
lugar debido a la afinidad que
interaccin ligando-enzima. Sin
presenta entre si los grupos no
embargo se requiere la unin variable y los resultados no son
covalente al soporte o matriz de fcilmente reproducibles.
un ligando de afinidad que
6.-) Atrapamiento
suele ser caro. Este ligando
unido al soporte es selectivo y Esta tcnica consiste en la
se une por afinidad a la enzima, inclusin de la enzima por
quedando esta inmovilizada. unin covalente o no, dentro de
geles, fibras, matrices solidas
5.4.-) adsorcin por
porosas constituidas por
coordinacin a un metal.
prepolimeros
Al depositar sobre un soporte fotoentrucruzables o polmeros
solido ciertas sales o hidrxidos del tipo poliacrilamida,
de metales de transicin como colgeno, alginato, carraginato
mercurio, cobre, nquel, titanio o resinas de poliuretano.
o zirconio, se puede producir la
Adems minimiza la lixiviacin
coordinacin del metal a
de la enzima y mejora su
determinados grupos
estabilidad, pero con frecuencia
nucleofilicos del soporte y
resulta en limitaciones de
posteriormente a la enzima, a
transporte de sustrato/analito
este tipo de inmovilizacin se le
al sitio activo de la enzima.
conoce como inmovilizacin por
unin a un metal. Esta tcnica permite la
posibilidad de adaptar el
La precipitacin de estas sales
material de encapsulacin para
o hidrxidos de metales al
proporcionar el microambiente
soporte (celulosa, quitina, cido
ptimo para la enzima.
algnico, silicatos) suele llevar a
cabo mediante calentamiento o La encapsulacin eficiente se
neutralizacin. ha realizado empleando
alginato de calcio, que previene
El mtodo es bastante simple y
la perdida de la enzima y
la actividad especfica de las
aumenta la estabilidad
enzimas inmovilizadas por este
mecnica.
mtodo es bastante alta.
Adems, se trata de un mtodo El proceso de inmovilizacin se
reversible, pues la elucin de lleva a cabo mediante la
las protenas inmovilizadas se suspensin de la enzima en una
pueden conseguir fcilmente solucin monmera,
por competicin con ligando seguidamente se inicia la
solubles o disminuyendo el pH. polimerizacin por un cambio
Sin embargo, la estabilidad de temperatura o mediante la
operacional alcanzada es adicin de reactivo qumico. El
atrapamiento puede ser en casos, la enzima queda
geles o en fibras, que suelen retenida en los huecos
ser ms resistentes que los intersticiales del soporte
geles. En el primer caso, la polimrico. La tcnica consiste
enzima queda atrapada en el generalmente en disolver estos
interior de un gel, mientras que polmeros en agua, aadir la
en el segundo caso la enzima enzima desea en disolucin y
se encuentra ocluida dentro de posteriormente enfriar la
las microcavidades de una fibra mezcla.
sinttica.
En caso de los polmeros de
Como ventaja adicional, la acrilamida, la polimerizacin gel
enzima no sufre ninguna puede iniciarse a partir de un
alteracin en su estructura. reactivo qumico, directamente
Pero requiere de un control en presencia de la enzima.
riguroso de las condiciones de Tambin se puede llevar a cabo
polimerizacin, as como la en el atrapamiento de la
comprobacin de que la enzima en geles de slice
naturaleza del proceso no altera obtenidos mediante procesos
los grupos reactivos de la sol-gel, que consisten en la
protena. hidrolisis en agua de un
alcoxido de silicio y un proceso
El atrapamiento por medio de
posterior de policondensacin
nano materiales ha
(Gupta y Chaudhury, 2007;
revolucionado el rea de
Brady y Jordan, 2009).
inmovilizacin de enzimas y ha
ampliado el rango de aplicacin 6.-2) micro encapsulacin.
en el campo de la qumica fina,
La micro encapsulacin consiste
biomedicina, biocombustibles,
en rodear la enzima con una
biosensores y medicina.
membrana semipermeable que
6.-1) Atrapamientos en gel o permite el paso de molculas
fibras. de sustrato y de producto, pero
no de la propia enzima (Arroyo,
Uno de los mtodos ms
1998). Estas membranas
utilizados para lograr la
semipermeables pueden ser
inmovilizacin de una enzima
permeables o no permeables.
es su atrapamiento en n gel
polimrico. Los geles 7.-) Unin covalente
empleados mayoritariamente
La inmovilizacin por unin
son geles de carragenos,
covalente, se basa en el
alginato, agarosa y
entrecruzamiento de la enzima
poliacrilamida. En todos los
y el material del soporte estos ltimos son muy
produciendo un enlace fuerte y populares para la inmovilizacin
estable. Este enlace covalente de enzimas. La unin covalente
es formado entre el grupo requiere de dos pasos: la
funcional de la matriz del activacin del material de
soporte y la superficie de la soporte que se lleva a cabo por
enzima que contiene residuos la adicin de un compuesto
de aminocidos. reactivo y el segundo es la
modificacin del esqueleto del
Los residuos de aminocidos
polmero para activar la matriz.
que intervienen en la formacin
del enlace, son los grupos Hay que prestar especial
amino (NH2) de la lisina o atencin a que estos enlaces
arginina, el grupo carboxilo covalentes que se forman
(COOH) del cido asprtico o entre enzima y el soporte no
acido glutmico, los grupos afecten al centro activo de la
sulfhidrilos de cistena, los enzima, pues en caso de
grupos hidroxilos (OH) de la hacerlo podra perder su
serina o treonina. actividad cataltica. La
presencia de inhibidores u otros
De entre los 20 aminocidos
compuestos en el medio de
diferentes que se encuentran
reaccin puede ayudar a evitar
en la estructura de las enzimas,
la prdida de actividad, tambin
los ms empleados para la
son cruciales en el proceso de
formacin de enlaces con el
inmovilizacin parmetros
soporte son principalmente la
como el tiempo de reaccin, la
lisina, la arginina, la
temperatura, el pH o tampn
cistena, la tirosina y la
utilizado.
histidina, y en menor medida
la metionina, el triptfano, la La inmovilizacin de enzimas
arginina y el cido asprtico mediante unin covalente a un
y glutmico. El resto de soporte puede tener lugar
aminocidos, debido a su mediante enlaces de distinta
carcter hidrfobo, no se naturaleza (tipo diazo,
encuentran expuestos hacia el peptdico, base Schiff,
exterior de la superficie alquilacin, arilacion o
proteica, y no pueden intervenir disulfuro) y la con la
en la unin covalente. intervencin de diversos
reactivos, tal y como se
Los materiales utilizados en
muestra en la siguiente tabla 4.
esta tcnica incluyen la
poliacrilamida, agarosa y silica,
los polmeros de polisacridos,
Alguno de los soportes que se
han empleado para llevar a
cabo este tipo de inmovilizacin
han sido los derivados de
polisacridos como p-
aminobencil celulosa, m-
aminoanisol celulosa, m-
aminobencil-oximetil celulosa.

7.2.-) Formacin de enlaces


tipo peptdico.

Tabla 4. Clasificacin de los distintos tipos de Este mtodo de inmovilizacin


unin covalente a un soporte est basado en la formacin de
enlaces peptdicos o de
7.1.-) Formacin de enlaces naturaleza similar entre el
diazo. soporte de inmovilizacin y la
enzima. Se trata de unir la
Este mtodo consiste en la enzima al soporte, mediante el
funcionalizacin del soporte con mismo tipo de enlace que
grupos diazonio capaces de existe entre los distintos
enlazarse con restos amino, aminocidos que forman a la
tirosil o histidil de la enzima. El protena.
soporte debe contener grupos
amino aromtico, que pueden Para ello, es necesario llevar a
ser introducidos mediante un cabo la activacin del soporte
espaciador, de modo que estos de inmovilizacin, mediante el
grupos amino se diazotan con uso de reactivos como:
cido nitroso como paso precio bromuro de ciangeno, carbonil
a la inmovilizacin. dimidazol y cloroformiato en el
caso de que le soporte
contenga grupos hidroxilo, o
reactivos tipo carbodimida si el
soporte contiene grupos
carboxilo.

Existen otros reactivos, no tan


empleados debido a su
Figura 5. Acoplamiento diazo entre el soporte toxicidad o inestabilidad de los
de inmovilizacin y la enzima derivados generados, que
tambin permiten la activacin
de determinados soportes que
contienen grupos carboxilos o
amino para dar lugar a la
formacin de enlaces peptdicos
con la enzima.

Figura 6. Diversos mtodos de inmovilizacin enzimtica mediante la


formacin de enlaces tipo peptdicos.
7.3.-) Formacin de enlaces La activacin del soporte se
de Schiff. puede conseguir mediante
oxidacin con peryodato, en el
Este mtodo de inmovilizacin
caso de determinados
est basado en la formacin de
polisacridos o soportes
bases de Schiff y posterior
activados previamente con
reduccin de los mismos. Para
glicidol. Otro mtodo muy
ellos es necesario activar el
empleado consiste en utilizar
soporte de inmovilizacin de
un dialdehdo, cuando se desea
modo que se obtengan grupos
lograr la inmovilizacin de la
carbonilo capaces de reaccionar
enzima en soportes que
con los grupos amino
contienen grupos amino
presentes en la estructura de la
enzima. Figura 7. Diversos mtodos de
inmovilizacin enzimtica mediante la
formacin de bases de Schiff y posterior
reduccin. (E= enzima)
7.4.-) mtodo de alquilacin
o arilacin.

Este mtodo se basa en la


inmovilizacin de una enzima
mediante la alquilacin o
arilacin de sus grupos amino,
fenol o sulfhidrilos utilizando
para ello reactivos espaciadores
que se unen al soporte y a la
enzima. Estos reactivos pueden
ser oxiranos, divinilsulfona,
haluros de sulfonio y triazina tal
y como se detalla en la
siguiente figura.

Figura 8. Diversos mtodos de inmovilizacin enzimtica mediante el mtodo de


alquilacin o arilacin. (E= enzima)
7.5.-) Reacciones de mercaptohidroxipropieter-2-
intercambio tio-disulfuro. pirdil disulfuro y agarosa-cido
adpico hidracina-N-acetil-
El intercambio tio-disulfuro se
homocisteina-2piridil disulfuro.
produce entre grupos tiol
presentes en la enzima y los Entre enzimas inmovilizadas
residuos disulfuro mixtos del por enlaces disulfuro podemos
soporte. En primer lugar, se encontrar: anhidrasa
hace reaccionar un soporte que Carbonica, -galactosidasa,
contiene grupos tiol con 2,2,- penicilina G-acilasa y lipasa.
dipiridildisulfuro obteniendo asi
un derivado con enlaces
disulfuro.

Posteriormente, la enzima se
enlasa por medio de sus grupos
tiol y ocurre la liberacin de 2-
tiopiridona. La caracterstica
principal de este enlace es su
reversibilidad, pues a pesar de Figura 9. Inmovilizacin enzimtica mediante
su carcter covalente, existen reacciones de intercambio tiol-disulfuro. (E=
reactivos como ditiotreitol enzima)
(DTT) que en condiciones 8.-) Entrecruzamiento o
suaves pueden romper esos Reticulado.
puentes disulfuro establecidos
La inmovilizacin por
entre la enzima y el soporte
entrecruzamiento o reticulado
(Brena y Batista-Viera, 2006).
ocurre en ausencia de un
En este mtodo aporta la soporte slido y consiste en la
ventaja como la posibilidad de formacin de enlaces
reutilizar el soporte, una vez intermoleculares entre
que la actividad enzimtica diferentes molculas de enzima
haya cado, eliminando la por medio de reactivos bi-o
enzima agotada y multifuncionales. Estos
sustituyndola por enzima reactivos pueden ser
nueva. glutaraldheido,
bisdiazobenzidina, entre otros
Como soportes de
que dan lugar a
inmovilizacin ha sido
entrecruzamiento mediante
empleados la agarosa-
formacin de bases de Schiff,
glutation-2-piridil disulfuro
acoplamientos diazo, alquilacin
(llamada sefarosa tol-
o enlaces peptdicos
activada), agaraso-
respectivamente. De todos ellos
el ms usado es el deber realizarse en base a la
entrecruzamiento mediante enzima concreta a inmovilizar
glutaraldhedo. y a la aplicacin posterior que
se le va a dar a la preparacin
Entre las ventajas de este
final obtenida.
mtodo se encuentran su
simplicidad, y la disponibilidad Otros factores como la
de controlar el tamao de naturaleza del sustrato,
partcula y las propiedades del producto o tipo de reactor a
producto final. Como emplear tambin son
inconvenientes podemos citar determinantes en la eleccin
que las reacciones se realizan del mtodo de inmovilizacion.
en condiciones relativamente
En la siguiente tabla se muestra
severas, con lo que la
un resumen de las
conformacin del centro activo
caractersticas generales de
de la enzima puede verse
cada mtodo de inmovilizacin
afectada, provocando una
(fortaleza del enlace, dificultad,
importante prdida de
regeneracin del soporte,
actividad.
validez del mtodo y coste del
proceso), as como de las
propiedades generales de las
enzimas inmovilizadas por
dicho mtodo (actividad
enzimtica y estabilidad).

No obstante pueden existir


excepciones a estas tendencias
generales debido a que un
Figura 10. Inmovilizacin enzimtica por
determinado tipo de enzima con
entrecruzamiento con glutaraldehdo.
un determinado tipo de soporte
9.-) Comparacin entre los puede originar la aparicin de
mtodos de inmovilizacin. caractersticas especiales
Todos los mtodos de distintas a las esperadas.
inmovilizacin presentan
ventajas e inconvenientes con
respecto al resto. No existe un
mtodo ideal y general para la
inmovilizacin de cualquier
enzima (Arroyo, 1998). Por lo
tanto, la eleccin del mtodo y
condiciones de inmovilizacin
Tabla 5. Comparacin entre los distintos
establecida por el Working on
mtodos de inmovilizacin.
Immobilized Biocatalysis:

10.-) Eleccin del mtodo.

La eleccin a detener en cuenta


las condiciones de la reaccin
biocatalizada, el tipo de reactor
que se vaya a utilizar, el tipo de
sustrato que se tenga que ser
procesado y otros factores.

En general, los mtodos de


preparacin difcil y de mayor
coste proporcionan
biocatalizadores ms estables y Tabla 6. Caracterizacin de un derivado
duraderos; en cambio aquellos inmovilizado.
mtodos ms sencillos como el
atrapamiento o la adsorcin, 11.-) Propiedades de las
donde la unin de la enzima enzimas inmovilizadas.
con el soporte es dbil, origina
derivados inmovilizados que Cuando se inmoviliza una
presentan perdidas de actividad enzima se producen cambios en
y que deben ser repuestos algunas de sus propiedades
continuamente. Una vez elegido como pueden ser la actividad
el mtodo ms conveniente, los cataltica o estabilidad trmica
derivados que preparemos (Brena y Batista-Viera, 2006).
deben estar caracterizados Estas modificaciones pueden
segn las indicaciones ser debidas a varios factores. Al
interaccionar la enzima con el enzimtica debido a factores
soporte de inmovilizacin como que: la enzima al
pueden producirse cambios inmovilizarse lo haga de tal
conformacionales en la forma que quede impedido el
estructura tridimensional de la paso del sustrato al centro
protena que afectan a su activo, algn grupo del soporte
centro activo. reaccione con el aminocido del
centro activo esencial para la
Adems, las interacciones que
actividad cataltica, ocurra un
surgen entre el soporte y el
cambio conformacional durante
sustrato, ya sean de naturaleza
la inmovilizacin que da lugar a
electrosttica, hidrofbicas o
una forma inactiva o las
impedimentos estricos,
condiciones del proceso
contribuyen a que la interaccin
ocasiones la desnaturalizacin
entre la enzima inmovilizada y
de la enzima (Arroyo, 1998).
el sustrato tengan lugar en un
microentorno diferente al de la Cuando la enzima mantiene su
solucin. actividad despus de la
inmovilizacin, los cambios
Todos estos factores actan
(disminucin o aumento de la
conjuntamente, dando lugar a
actividad enzimtica) se deber
la modificacin de las
principalmente a efectos
propiedades de la enzima
difusionales, electrostticos,
inmovilizada, y resulta difcil
estricos y/o del microentorno.
determinar que factor provoca
un determinada cambio. 13.-) Especificidad por el
sustrato.
12.-) Actividad cataltica.
Cuando se lleva a cabo la
La actividad cataltica de las
inmovilizacin de una enzima la
enzimas generalmente se ve
especificidad por su sustrato
afectada tras el proceso de
puede cambiar. En general, al
inmovilizacin (Garca-Glan et
inmovilizar una enzima sobre
al, 20011). Para que un mtodo
un soporte polimrico, su
de inmovilizacin sea til la
actividad hacia sustratos de
enzima debe mantener su
elevado peso molecular
actividad cataltica tras la
disminuye debido a
inmovilizacin, aunque a
impedimentos estricos,
menudo esta disminuye.
especialmente en el caso de
En algunas ocasiones puede inmovilizacin por
llegar a perderse atrapamientos; mientras que si
completamente la actividad el sustrato es de bajo peso
molecular no suele observarse
cambios en la actividad valores aparentes debido a
enzimtica tras la efectos de difusin y otros
inmovilizacin . factores fsicos que tiene lugar.

Una solucin para minimizar 14.1.-) Constante de


estos impedimentos estricos Michaelis (Km).
es la introduccin de un brazo
En muchos casos, el valor de la
espaciador o cadena alqulica
constantes de Michaelis, Km,
de dos a ocho tomos de
aumenta tras la inmovilizacin,
carbono entre soporte y
lo que significa que disminuye
enzima. No obstante, se ha
la afinidad aparente de la
observado en algunos caso que
enzima inmovilizada por el
la accin de determinas
sustrato. En otras ocasiones, el
enzimas inmovilizadas frente a
cambio producido en el valor de
sustratos de levado peso
Km debido a la inmovilizacin es
molecular esta favorecida
pequeo o nulo, o incluso
respecto a sustratos de bajo
puede llegar a disminuir
peso molecular, probablemente
ocurriendo aparentemente un
debido a fuerzas atractivas
aumento de la afinidad de la
entre sustrato y soporte de
enzima por su sustrato.
inmovilizacin.
Algunas explicaciones dadas a
14.-) Constantes cinticas.
la modificacin de los valores
Por lo general, las constantes de Km hace referencia a
cinticas se ven alteras cuando cambios conformacionales de la
esta es inmovilizada. El estudio enzima, interacciones
cintico de la enzima tras la electroestticas entre soporte y
inmovilizacin resulta de vital el sustrato, adsorcin del
importancia para comprender sustrato al soporte y
como le ha afectado dicho limitaciones en la difusin del
proceso y cules son sus sustrato y/o producto,
caractersticas finales. especialmente en el caso de
inmovilizacin por
Hay que tener en cuenta que
atrapamiento.
las constantes cinticas
medidas con enzimas 14.2.-) Velocidad mxima
inmovilizadas no son verdades (Vmax).
constantes cinticas
Dependiendo al mtodo de
equivalentes a las obtenidas en
inmovilizacin escogido y de la
un medio de reaccin
naturaleza del soporte, la
homogneo con enzimas en
cantidad de enzima
disolucin, sino que se trata de
inmovilizada y su conformacin estabilizacin conformacional
puede variar afectando as la de la enzima (ocasionada por
velocidad mxima aparente, una mayor rigidez de su
Vmax, que muestra dicha estructura y prevencin de la
enzima al actuar sobre su disociacin de sus
sustrato. Existen casos en los subunidades), a la proteccin
que se ha descrito una mejor que ejerce el soporte frente a
de Vmax tras la inmovilizacin y proteasas del medio, a una
en otros muchos se ha descrito disminucin de los problemas
una disminucin. de agregacin intermolecular o
a la creacin artificial de un
Este parmetro nos da una
microentorno favorable para la
informacin limitada, pues
enzima como resultado de la
cuando ocurre un aumento de
inmovilizacin. Hay diferentes
Vmax no se puede saber si se
estabilidades dependiendo a la
debe a una mayor cantidad de
interaccin de algunos factores:
enzima inmovilizada o a un
aumento de su actividad, por lo Estabilidad hacia
que es difcil establecer reactivos.
comparaciones entre distintos Estabilidad hacia enzimas
mtodos de inmovilizacin o proteolticas.
diferentes soportes. Estabilidad Trmica.
Estabilidad operacional.
15.-) Temperatura y pH.
Estabilidad durante el
Cuando se lleva a cabo la almacenamiento.
inmovilizacin de una enzima, Estabilidad frente al pH
estos valores ptimos de
17.-) Aplicacin de las
temperatura y pH pueden verse
enzimas inmovilizadas.
alterados. Un buen mtodo de
inmovilizacin ser aquel que La inmovilizacin de enzimas ha
permita a la enzima actuar con dado lugar principalmente a
una actividad cataltica mxima aplicacin en los campos del
durante un mayor rango de anlisis, la medicina, la
temperaturas y pH. industria y el medioambiente.
Entre algunas aplicaciones se
16.-) Estabilidad.
encuentran:
En muchos casos se observa un
biosensores.
incremento en la estabilidad de
Tratamientos con enzimas
las enzimas despus de su
inmovilizadas.
inmovilizacin. Este fenmeno
Biocatalizadores
puede ser debido a una
Referencias:
http://www.bionova.org.es/biocast
/documentos/tema14.pdf

https://www.google.com.mx/url?s
a=t&rct=j&q=&esrc=s&source=we
b&cd=1&cad=rja&uact=8&sqi=2&
ved=0CBwQFjAA&url=http%3A%2
F%2Fwww.researchgate.net%2Fpr
ofile%2FMiguel_Arroyo%2Fpublica
tion%2F237564145_Inmovilizacin
_de_enzimas._Fundamentos_mtod
os_y_aplicaciones%2Flinks%2F00
b7d524d21ceec982000000.pdf&ei
=fyk8VbOUD8yoNtvygYgC&usg=A
FQjCNEPSChoeJQ8yJP4phr_XJnV8
Xbyqg&sig2=1NjGbOHfbrpfM9usA
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http://iqtma.cps.unizar.es//compo
nents/com_docman/dl2.php?archi
ve=0&file=SU5NT1ZJTElaQUNJX05
fREVfRU5aSU1BUy5wZGY=
http://sgpwe.izt.uam.mx/files/use
rs/uami/sho/Tema_10_Biotec_Enzi
mas.pdf