Universidad de Chile

Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas

Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular
Curso de Bioqumica II

Pptidos no ribosomales
Mecanismo de sntesis y aplicaciones biotecnolgicas

Jess Guerrero Muoz

Bastin Quilaleo Cuevas
Sebastin Roque Ramrez

Viernes 25 de mayo, 2017

Resumen
Los pptidos no ribosomales son metabolitos secundarios producidos por
microorganismos como bacterias u hongos. Son sintetizados por grandes
complejos multienzimticos llamados pptido sintasas que se organizan
en mdulos que presentan distintos dominios, cada uno con una funcin
especfica. El manejo in vitro de estos mdulos puede aplicarse para
sintetizar pptidos de inters. El uso hospederos heterlogos o la
construccin de genes hbridos son otras maneras de comenzar o
aumentar la produccin de un pptido especfico.
Gramicidina es un conjunto de pptidos no ribosomales con propiedades
antimicrobianas, de los que cuales los ms estudiados son la Gramicidina
D y la S. La primera es una mezcla de isoformas de pptidos lineales de
15 aminocidos entre las que se encuentran Gramicidina A (la ms
estudiada), B y C, que acta formando poros en la membrana de las
bacterias que afecta. Por otro lado, Gramicidina S es un ciclodecapptido
catinico anfiflico cuya sntesis depende de la accin conjunta de dos
enzimas, la Gramicidina sintetasa I (GS1) y la Gramicidina sintetasa II
(GS2). Su accin antibitica se basa destruir la membrana celular,
alterando su estructura y su permeabilidad. Tambin se ha descubierto
que es capaz de inhibir la formacin de agregados de -amiloides.
Abstract
Non-ribosomal peptides are secondary metabolites produced by
microorganisms such as bacteria or fungi. They are synthesized by large
multienzymatic complexes called peptide synthases that are organized
into modules that have different domains, each with a specific function.
The in vitro handling of these modules can be applied to synthesize
peptides of interest. The use of heterologous hosts or the construction of
hybrid genes are another way to start or increase the production of a
specific peptide.
Gramicidin is a set of non-ribosomal peptides with antimicrobial
properties, of which the most studied are Gramicidin D and S. The first is
a mixture of isoforms of linear peptides of 15 amino acids including
Gramicidin A (the most studied), B and C, which acts by forming pores in
the membrane of the bacteria that affects. On the other hand, Gramicidin
S is an amphiphilic cationic cyclodecapeptide whose synthesis depends on
the combined action of two enzymes, Gramicidin synthetase I (GS1) and
Gramicidin synthetase II (GS2). Its antibiotic action is based on
destroying the cell membrane, altering its structure and its permeability.
It has also been found to be capable of inhibiting the formation of -
amyloid aggregates.
1. Pptidos no ribosomales y su mecanismo de sntesis
A. Los pptidos no ribosomales
Los pptidos no ribosomales (Nonribosomal peptides, o NRP) son
metabolitos secundarios producidos por microorganismos (principalmente
de bacterias y hongos) (Schwarzer y cols., 2003), que presentan gran
diversidad tanto en su estructura qumica como en su actividad biolgica
(Stachelhaus y cols., 1995). Su sntesis depende de grandes enzimas
multifuncionales llamadas Pptido Sintasa (NRPS).
Por lo general, los NRP no superan los 3kDa, stos pueden ser lineales,
cclicos o ramificados. En su estructura es frecuente la presencia de
aminocidos inusuales como los hidroxiaminocidos, -aminocidos, D-
aminocidos y derivados de N-metilo (Fierro & Vergara, 2011).
En las dcadas posteriores a su descubrimiento, sta va de sntesis
peptdica ha ganado notoriedad dentro de la comunidad cientfica, lo que
se observa a travs del gran aumento de las publicaciones relacionadas
con este tema en el ltimo tiempo. Este conocimiento puede resultar de Comentado [SIRR(1]: Se puede citar esto? Se afirma
utilidad en distintas reas, como, por ejemplo, en la medicina, ya que segn las estadsticas que aparecen en pubmen

algunos frmacos de gran importancia, como los antibiticos - Comentado [DSH2]: Poco cientfico. Una cosa es no saber,
lactmicos, algunos antitumorales como bleomicina, o inmunosupresores otra es un misterio

como la ciclosporina A, son ejemplos de pptidos no ribosomales (Walsh,

2007). Comentado [SIRR(3]: Cual era este paper

B. Mecanismo, funcin fisiolgica, e importancia evolutiva de las

Pptido Sintasas.
Las pptido sintasas son grandes complejos multienzimticos organizadas
en mdulos proteicos que realizan la sntesis de estos polmeros de
manera muy similar a la forma en la que se realiza la sntesis ribosomal,
y a la vez sirven como molde para definir la secuencia y la longitud de la
cadena aminoacdica (Schwarzer y cols., 2003; Weber y cols., 1994).
Cada mdulo es una protena que posee varios dominios con distintas
funciones. Los principales son:
Dominio de Activacin (Dominio A): Reconoce de manera muy
especfica al aminocido que unir a la secuencia (Stachelhaus y cols.,
1995), y lo activa mediante la unin de AMP a partir de ATP, formando un
aducto aminoacil-O-AMP. Debido a su gran especificidad de
reconocimiento de sustrato, son los que definen la secuencia del pptido
a sintetizar.
Dominio de tiolacin o PCP (Peptidyl Carrier Protein) (Dominio T
o PCP): Poseen un grupo prosttico 4-fosfopanteteneil (4-PP) enlazado
a un residuo absolutamente conservado de serina. El grupo 4-PP contiene
un grupo terminal cisteinamino tiol que permite la formacin de un enlace
covalente con el sustrato activado (aminoacil-O-AMP), para formar un
intermediario aminoacil-S-fosfopanteteina. El dominio se puede encontrar
en dos formas: holo-PCP (con grupo prosttico) y apo-PCP (sin grupo
prosttico), y la interconversin entre stas es catalizada por una enzima Comentado [SIRR(4]: Era esta la diferencia?
llamada fosfopanteteinil transferasa (Stachelhaus y cols., 1996).
Dominio de Condensacin (Dominio C): Cataliza la formacin del
enlace peptdico entre un donante peptidil-S-fosfopateteina ro arriba y
un aceptor aminoacil-S-fosfopanteteina rio abajo. El sitio activo de este
dominio contiene un motivo altamente conservado de aminocidos
HHXXXDG, del cual la segunda histidina resulta ser la responsable de la
catlisis de la formacin del enlace peptdico (Stachelhaus y cols., 1996).
Se ha demostrado que los dominios C no poseen una gran especificidad
en el reconocimiento de sustratos, por lo que son capaces de catalizar la
formacin de enlaces entre cualquier aminocido y cualquier cadena
peptdica (Belshaw y cols., 1999).
El mecanismo general de la formacin de estos pptidos es similar al que
ocupan las polictido sintasas (PKS) (Stachelhaus y cols., 1995), e implica
los siguientes pasos: (1) Activacin del aminocido que se unir a la
cadena (formacin del aducto aa-O-AMP); (2) Transferencia del grupo
aminoacil desde el dominio A al dominio T mediante la formacin de un
grupo aminoacil-S-Ppant; y (3) Formacin del enlace peptdico entre el
aminocido y la cadena peptdica (n), para generar una nueva cadena con
un monmero ms (n+1). Este ltimo proceso es catalizado por el
dominio C. El proceso en conjunto se explica en la figura 1.
Existen otros dominios participantes (alrededor de 13) (Sssmuth &
Mainz, 2017), conocidos como dominios modificadores (Figura 1), los
que realizan modificaciones tanto a los aminocidos que ingresan a la
cadena, como al residuo aminoacdico del extremo C-terminal, y que, por
lo tanto, permiten la existencia de la amplia variedad estructural que
presentan los pptidos no ribosomales. Algunos ejemplos de lo anterior
son el dominio de epimerizacin (E), o el de metilacin (M) (Weber y cols.,
1994).
Es posible establecer una relacin entre la sntesis ribosomal y no
ribosomal de pptidos: en ambas existe un cdigo que indica la secuencia
en la que deben agregarse los aminocidos a la cadena peptdica (en la
sntesis ribosomal est definido por el mRNA, mientras que en la no
ribosomal est definido por la secuencia de dominios A), tambin tienen
en comn la formacin del aducto aminoacil-O-AMP, que luego ser
transferido a otra molcula (en el caso de la sntesis ribosomal, tRNA) o
dominio (en el caso de la sntesis no ribosomal, dominio T), formndose
un enlace ster (en el tRNA) o tioeter (dominio T). Finalmente, en ambas
existe una tercera molcula (ribosoma) o dominio (dominio C) que
cataliza la sntesis de enlaces peptdico de manera sumamente
inespecfica. A partir de algunas de las similitudes comentadas, algunos
autores han propuesto la posibilidad de que los tRNA hayan evolucionado
desde los dominios A de las NRPS (Belshaw y cols., 1999). Comentado [DSH5]: esterasa? enzimas de tailoring?

C. Diseo de pptidos no ribosomales sintticos.

Es posible que el conocimiento de los distintos mdulos enzimticos
nombrados anteriormente de paso al desarrollo de mtodos para disear
nuevas molculas con aplicaciones biotecnolgicas que se discutirn ms
adelante. Esta afirmacin se sustenta en investigaciones que han
permitido, por ejemplo, la creacin de bibliotecas de un mismo antibitico,
facilitando el estudio del mecanismo mediante el cual ste acta (Nguyen
y cols., 2006), e incluso, la produccin de anlogos estructurales de
pptidos no ribosomales mediante la introduccin mutaciones en el
dominio A de un mdulo especfico con el fin de que este active un
aminocido sinttico en vez de activar el aminocido original (Thirlway y
cols., 2012).
I. Mtodos de prediccin del sustrato del dominio A
A fines del siglo pasado, Stachelhaus et al (1999) a partir de la
cristalografa de rayos X de un dominio A unido a su sustrato definieron
ciertas reglas que guan a estos dominios en el reconocimiento de sus
sustratos. Alrededor de la misma poca, se determinaron los aminocidos
altamente conservados que permiten la alineacin del sustrato con los
aminocidos del sitio de unin. A partir de este conocimiento se pudieron
predecir certeramente los sustratos de la mayora de los dominios A
conocidos hasta la fecha. (Challis y cols., 2000).
A partir de los descubrimientos relacionados con la especificidad modular
de reconocimiento de aminocidos de las NRPSs, se han desarrollado
mtodos bioinformticos que permiten la prediccin del sustrato de los
dominios A de las enzimas. Por ejemplo, se ha desarrollado una biblioteca
virtual de libre acceso que utiliza los descubrimientos mencionados
anteriormente en complemento con un mtodo estadstico conocido como
el mtodo oculto de Markov (HMM por sus siglas en ingls) para la
prediccin del sustrato. La direccin de esta biblioteca es Comentado [SIRR(6]: Redactar mejor
www.nrpssp.com. (Prieto y cols., 2012).
II. Construccin de genes hbridos de NRPSs.
La construccin de genes hbridos que codifican sintetasas de pptidos
con alteraciones de las especificidades de los aminocidos permite la
generacin in vivo de pptidos no ribosomales. Esto se puede realizar
introduciendo por recombinacin homloga en el sitio blanco del opern
de biosntesis del antibitico deseado, lo cual causa una alteracin
programada dentro del producto peptdico, como se ha visto en el caso
del antibitico lipopeptdico surfactina en Bacillus subtilis (Stachelhaus y
cols., 1995).
III. Procesamiento
La escisin proteoltica de protenas es una caracterstica muy recurrente
en la biologa, ya sea para la activacin de estas o cuando existe una
pptido seal que es cortada de la protena cuando llega a su destino final.
Sin embargo, se ha comprobado que esta no es solo una caracterstica de
los pptidos sintetizados por ribosomas, sino que tambin se ve en
pptidos no ribosomales. Como es en el caso de la xenocoumacina en la
cual se produce una escisin en D-asparagina acilada, produciendo as el
frmaco xenocoumacina, a partir de, su forma inactivada,
prexenocoumacina (Reimer y cols., 2011).
D. Uso de hospederos para la produccin in vivo de NRPs
Es necesario ahora hablar de la importancia de la Escherichia coli en la
biotecnologa relacionada a los pptidos no ribosomales. Al ver todas las
aplicaciones diversas que pueden tener estos pptidos se ha puesto
especial inters en disear mtodos de manipulacin gentica para
controlar sus vas de biosntesis. Los genes que controlan la produccin
de estos metabolitos secundarios en el caso de las bacterias estn
organizados generalmente en clusters de operones policistrnicos en el
cromosoma bacteriano, por lo que son estos clusters los objetivos de la
manipulacin gentica. El principal problema al tratar de poner esto en
prctica son los obstculos que se presentan al trabajar con el
microorganismo que es el productor natural del pptido. Debido a esto se
lleg a la posibilidad de utilizar a la E. coli como hospedero heterlogo de
estos clusters para permitir la biosntesis de estos productos por su rpido
crecimiento y por su facilidad para manipulacin gentica (Challis y cols.,
2006).
De todas las estrategias que han sido descritas para la produccin de
pptidos no ribosomales destaca el aislamiento del cluster de genes
biosintticos de equinomicina a partir del plsmidio lineal de
Streptomyces lasaliensis. Esta aproximacin facilita la manipulacin de
estos clusters, adems permitir examinar la funcin individual de cada
uno de los genes codificados en ellos (Watanabe y cols., 2006). Comentado [DSH7]: Esto es una tcnica de manip.
Gentica, no tiene relacin con el tema Amerita dedicarle
2. Aplicaciones biotecnologas de los pptidos no ribosomales un prrafo?

La gramicidina es un conjunto de pptidos no ribosomales sintetizados

por el organismo procarionte Aneurinibacillus migulanus (anteriormente
llamada Bacillus Brevis) (Mogi y cols, 2009). Dentro de las ms estudiadas
podemos destacar la gramicidina D y la gramicidina S. Ambos poseen
propiedades antimicrobianas, a partir de las que se derivan posibles
aplicaciones biotecnolgicas.
Gramicidina D
La gramicidina D (gD) es una mezcla de isoformas de pptidos lineales de
15 residuos aminoacdicos, sus secuencias son: formilo-L-Val-D-Gly-L-
Ala-D-Leu-L-Ala-D-Val-L-Val-D-Val-L-Trp-D-Leu-L-Xxx-D-Leu-L-Trp-D-
Leu-L-Trp-etanolamina, donde Xxx es Trp en gramicidina A (gA), Phe en
gramicidina B (gB), y Tyr en gramicidina C (gC) (Townsley y cols., 2001).
La composicin de la gD vara, pero una mezcla tpica de gramicidina
contiene aproximadamente 72% de gA (Trp11), 9% de gB (Phe11) y 19%
de gC (Tyr11), adems, cada una de estas especies contienen tambin
aproximadamente entre 5 y 15% de isoleucina en lugar de valina en la
posicin 1 (Stankovic y cols., 1990). Estos pptidos actan formando
poros inicos en las membranas blanco, hacindolas permeables a
pequeos cationes e incapaces de soportar gradientes de
transmembranas sustentadores de la vida (Liu & Caffrey, 2005). Las
estructuras de los canales de estas gramicidinas son equivalentes, debido
a la capacidad que tienen para formar canales hibridos entre s. Las
diferencias que presentan estos canales se ven en las propiedades de
conductancia y duracin media, y son causadas por las diferencias en las
propiedades fisicoqumicas de los residuos aromticos en la posicin 11
(Sawyer y cols., 1990).
El mecanismo que presentan estos pptidos antimicrobianos (AMP) de
interrupcin de la membrana plasmtica en las clulas bacterianas, hace
que sea difcil que las bacterias generen resistencia contra la gramicidina,
aun as, el desarrollo de estos AMP en antibiticos sintticos se ha visto
dificultado, debido a su toxicidad, baja eficacia y distribucin limitada de
tejidos (Wang y cols., 2011).
Una de las gramicidinas ms estudiadas es la de isoforma A la cual se
pliega en una hlice con un poro interno (Figura 2A), produciendo un
canal transmembrana de dimetro de 4 (Figura 2B). Es utilizado como
ingrediente activo de un ungento antibitico, pero este NRP es algo
insoluble en agua y adems induce hemolisis a concentraciones
necesarias para causar la muerte celular. Por esta razn se han
desarrollado investigaciones para generar mutantes de gA, obteniendo
resultados satisfactorios al hacer que la formacin de canales ionicos sea
bacterioespecifico, aumentar su solubilidad en agua, ganar actividad
antibitica contra bacterias Gram negativo y disminuir la actividad
hemolitica posicionndolos como antibiticos sistmicos prometedores
(Wang y cols., 2011; Zerfas y cols., 2016).
Gramicidina S (GS)
Es un pptido catinico anfiflico (CAP) producido como parte del sistema
de defensa de A. migulanus: le permite suprimir el crecimiento de
competidores en un mismo nicho ecolgico (Peschel & Sahl, 2006).
I. Estructura
Su estructura primaria es (ciclo-(Val-Orn-Leu-D-Phe-Pro)2), mientras que
su estructura secundaria consiste en un anillo formado por hojas
antiparalelas, las cuales estn soportadas con dos -turns tipo II. Las
cadenas laterales cargadas de los dos residuos de ornitina y los anillos de
los residuos de D-fenilalanina se proyectan hacia un lado de la molcula,
mientras que las cadenas laterales de los dos residuos de valina y de
leucina se proyectan hacia el lado contrario, lo que le otorga un carcter
anfiflico a la molcula completa (Hull y cols., 1978)
La estructura cclica en este tipo de molculas resulta fundamental,
puesto que se ha observado que en pptidos bsicos lineales con
estructura hoja , la actividad antimicrobial se pierde completamente
(Ono y cols., 1990).
II. Sntesis no ribosomal
La sntesis de la Gramicidina S ocurre gracias a la accin conjunta de dos
enzimas, la Gramicidin S sintetasa I (GS1), que consta de un mdulo, y
la Gramicidin S sintetasa II (GS2), que consta de cuatro mdulos, siendo
codificadas respectivamente por los genes grsA y grsB contenidos en el
opern grs.
La GS1 (127 kDa) se encarga de la activacin (Conti y cols., 1997) y
racemizacin del aminocido fenilalanina, pasando este de L-Phe a D-Phe.
Una vez hecho esto permite el inicio de la elongacin del pptido al
interactuar con GS2 (508 kDa). Esta ltima enzima permite la activacin
de los aminocidos L-Pro, L-Val, L-Orn y L-Leu en ese orden, la que ocurre
particularmente en cada uno de los cuatro mdulos que presenta GS2.
Adems, contina con la elongacin de la cadena proteica formando el
enlace peptdico entre dos aminocidos en el dominio de condensacin
presente en cada mdulo. De esta manera se forman dos pptidos
idnticos que se ensamblan de manera antiparalela en la terminacin de
la sntesis (von Dhren y cols.,1997).
Cada mdulo, tanto de GS1 como de GS2 presenta tres dominios
(Stachelhaus & Marahiel, 1995), uno de adenilacin, un dominio carrier y
un dominio de epimerizacin en el caso de GS1 o de condensacin en el
caso de GS2 (Figura 3). El primer dominio permite la activacin de su
aminocido especfico mediante adenilacin, utilizando ATP (activacin
del grupo carboxilo). El segundo dominio es muy importante para la
elongacin del pptido, ya que interacta con transferasas que permiten
la acilacin del aminocido cognado para permitir la formacin de un
tioester relativamente estable, este paso es esencial para la posterior
formacin del enlace peptdico. Adems, interacta con los dominios de
condensacin de manera de promover la elongacin de manera dirigida,
siendo necesaria la presencia del cofactor 4-fosfospantetena para la
formacin del pantetinil carrier que permitir la translocacin de los
aminocidos. En el caso de GS1, sta presenta un dominio de
epimerizacin el cual produce el cambio de L-Phe a D-Phe. En cambio,
GS2 presenta los dominios de condensacin que permitirn la formacin
del enlace peptdico, adems de un dominio de terminacin presente en
el ltimo mdulo que permite la ciclacin antiparalela que dar como
resultado la gramicidina S final.
El mecanismo tiotemplado mediante el cual ocurre la sntesis de la
gramicidina S requiere un funcionamiento coordinado de las dos enzimas
participantes, lo cual es permitido bajo el correcto funcionamiento de los
dominios presentes en cada uno de los mdulos. El primer paso es la
activacin de los aminocidos gracias a la accin del dominio de
adenilacin, seguido de la formacin del tioester estable mediante
acilacin en el dominio carrier. El cofactor 4-fosfopantetena permite la
transferencia del aminocido al dominio de condensacin. La elongacin
comienza con la interaccin entre GS1 y GS2, formando un complejo de
iniciacin. Una vez realiza la epimerizacin de la D-Phe se forma el enlace
peptdico entre esta ltima y L-Pro, esto se produce por un ataque
nucleoflico del grupo amino de L-Pro al grupo carboxilo activado de D-
Phe. Una vez armado el dipptido inicial y gracias a interacciones
sucesivas entre los dominios de condensacin de cada mdulo se va
elongando la molcula hasta tener dos pentapptidos iguales, los que
sern ciclados en el dominio de terminacin del mdulo final mediante un
mecanismo que an se desconoce (von Dhren y cols., 1997).
III. Mecanismo antimicrobiano y toxignico
Su mecanismo de accin consiste en destruir la membrana celular, altera
su estructura y disminuye su permeabilidad. La gS es capaz de interactuar
con varias membranas (de bacterias, eritrocitos, mitocondria, entre
otras), y para estas interacciones, las cargas positivas de la molcula son
fundamentales.
Posee una gran actividad antibitica: se ha encontrado actividad
antimicrobiana contra bacterias Gram positivo cultivadas en placas de
agar (Ando y cols., 1993). Tambin posee la habilidad de lisar clulas
eucariticas, lo que representa un aspecto negativo de esta molcula en
su uso farmacolgico. Por esta razn su uso se restringe al de antibitico
tpico (Kondejewski y cols., 1996), como, por ejemplo, en el tratamiento Comentado [SIRR(8]: Revisar este paper, sale la ref
de la infeccin de odos (O'Grady y cols., 1997). original de lo de la estructura (7,8)

Ando y cols (1993) han clarificado como el tamao del anillo y la carga de
la molcula afectan tanto a la actividad antimicrobiana como a su
capacidad ltica. Esta investigacin se llev a cabo mediante el uso de
anlogos de gramicidina S que mantienen su estructura antiparalela
estabilizada por turns tipo II, pero que varan en su cantidad de
aminocidos, tamao del anillo y en su carga neta (proporcional a
residuos de Orn). Los resultados indican que el tamao del anillo se Comentado [SIRR(9]: Muy antiguo quizs?
relaciona con la capacidad de la molcula de formar estructuras de hoja
con turns. Cuando el anillo es de mayor tamao, la formacin del
mismo es menos estable en soluciones acuosas, pero puede ser asistida
mediante la presencia de membranas anfifilicas. Los anillos pequeos se
encuentran estabilizados por interacciones tipo puente de hidrgeno. Por
otro lado, se observ que a medida que aumentaba la carga de la
molcula, el espectro de actividad variaba, disminuyendo la actividad
antimicrobiana sobre Gram positivo, y aumentando sobre Gram
negativos.
Estudios han demostrado que se puede disminuir la actividad hemoltica
de la gS al introducir aminocidos hidrofbicos en su estructura, haciendo
a este compuesto menos toxico en humanos, a la vez que se mantiene
una alta actividad antibacteriana (Kapoerchan y cols., 2012)
 IV. Otras aplicaciones
Adems de su actividad antibitica, estudios han demostrado a travs de
estudios in vitro e in silico que la gramicidina S es capaz de inhibir la
agregacin de pptidos -amiloides (molculas implicadas en la
enfermedad de Alzheimer). Se midi la formacin de agregados de -
amiloide en ausencia de gS, y en presencia de distintas concentraciones
del antimicrobiano mediante dos ensayos distintos: fluorescencia de ThT
y AFM. En ambos casos se observ que la agregacin de -amiloide fue
inhibida en presencia de gS, e incluso, a mayor concentracin de ste, se
observ una menor agregacin. Los autores proponen que el pptido no
solo tiene efecto preventivo en la formacin de agregados de -amiloide
fibrilar, sino que tambin disuelve parcialmente las fibrillas (Luo y cols,
2013).
Discusin y conclusiones. Comentado [DSH10]: En toda esta seccin no hay
discusin del tema tratado en la seccin de desarrollo
Hemos expuesto las notables similitudes que encontramos entre la
sntesis ribosomal y no ribosomal de pptidos. Desde las observaciones
de que ambas rutas ocupan mecanismos muy similares para la
polimerizacin, de la amplia versatilidad en la utilizacin de aminocidos
por parte de las NRPS (mucho mayor que la acotada gama que es capaz
de utilizar la ruta ribosomal), de los aminocidos sintetizados por las NRPS
son bastante pequeos en general, mientras que los ribosomas son
capaces de generar grandes complejos proteicos, y de lo que proponen
algunos autores sobre la evolucin de los tRNAs a partir de dominio T de
las NRPS, nos atrevemos pensar que la ruta no ribosomal de sntesis es
un antecesor muy ancestral de la ruta ribosomal.
Descubrimientos recientes respecto al mecanismo de sntesis no
ribosomal han permitido a los investigadores ensayar la modificacin de
los dominios A, incluso siendo capaces de insertar aminocidos sintticos,
y adems, crear en ciertos casos bibliotecas enteras de anlogos
estructurales de un mismo pptido. Esta nueva capacidad de modificacin
y almacenamiento de anlogos potencialmente permite una investigacin
ms rpida y detallada de los mecanismos de accin de esto pptidos, y
tambin puede facilitar la bsqueda de nuevas utilidades se pueden
encontrar para los mismos.
Estudios in vitro utilizando el dominio carrier y el de terminacin de la
GS2 (PCP-TE) de manera iterativa han demostrado la capacidad que tiene
este complejo de producir pptidos cclicos con distintos tamaos de
anillo. Estos trabajos abren la puerta para la posible creacin de una
biblioteca de pptidos con distintas funciones que puedan ser sintetizados
gracias a la ciclacin de dos pptidos elegidos al azar. Adems, se observ
que al bloquear la ciclacin producida por el complejo utilizando
monmeros impedidos para esta reaccin, PCP-TE tiene actividad ligasa
con una alta tolerancia a diferentes sustratos, por lo que determinar el
largo mximo de molcula que puede ser utilizado para esta reaccin
puede tener grandes implicancias en la produccin de nuevos pptidos de
inters (Hoyer, K., M., y cols, 2007). En vista de las posibles aplicaciones
que puede tener el uso de los dominios PCP-TE es necesario dilucidar
completamente el mecanismo de terminacin de GS2. Se han propuesto
dos mecanismos, una intramolecular que sugiere que la ciclacin ocurre
en el dominio de una sola enzima (Stoll, E., y cols, 1970) y otro
intermolecular donde se postula la interaccin de dos TE de distintas
enzimas (Roskoski, R., y cols, 1971). Aunque es ms aceptado el
mecanismo intermolecular ante la evidencia de que las NRPS suelen
actuar como monmeros (Sieber, S., A., y cols, 2002) dilucidar de manera
total el mecanismo puede permitir un mejor uso biotecnolgico de PCP-
TE.
Por otro lado, hemos descrito algunas investigaciones con resultados
exitosos relacionadas con el uso de la gramicidina S para la inhibicin de
la agregacin del pptido -amiloide (y la disolucin de los agregados del
mismo). Debido a que existen otras enfermedades con alto impacto
epidemiolgico que se relacionan con la agregacin de pptidos, tales
como Diabetes Mellitus Tipo 2, la enfermedad de Parkinson y de
Huntington, la gramicidina S podra resultar fundamental en el
tratamiento de las mismas.
Como hemos mencionado anteriormente, la gramicidina tambin es un
potente antimicrobiano, e, incluso, no se han encontrado cepas
resistentes a este pptido a pesar de que se ha utilizado por mucho
tiempo. Por esto, podra ser utilizada para remediar el actual problema
del surgimiento de cepas resistentes a mltiples drogas (MDR). Aun as,
hasta el momento no se han sintetizado exitosamente anlogos de
gramicidina que no resulten txicos en mamferos, y, como consecuencia,
no se han realizado investigaciones in vivo en bsqueda de demostrar los
efectos reales que tendra la gramicidina, tanto en el tratamiento de
enfermedades producidas por agregacin de protenas, como en el
tratamiento de enfermedades infecciosas. Este problema podra ser
solucionado con los conocimientos que se han obtenido sobre la
estructura y mecanismo de accin de esta molcula: al regular la
anfifilicidad de esta molcula agregando cargas o modificando el tamao
del anillo debiera ser posible obtener un anlogo que finalmente no sea
txico para mamferos.
Referencias
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