UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE

BIOTECNOLOGA

INFORME DE PRCTICAS PREPROFESIONALES I y II

(Del 20 de junio al 20 de agosto del 2016)

TECNOLOGA DE CULTIVO DE MICROALGA Ankistrodesmus sp.

(Chlorophyta) EN AGUAS RESIDUALES DE CAMAL Y
PROCESAMIENTO DE SU BIOMASA. LABORATORIO DE
BIOTECNOLOGA Y BIOENERGTICA, UNIVERSIDAD
CIENTFICA DEL PER IQUITOS

Autor:

Eymar Enrrique Correa Valverde

Asesor:

M. Sc. Willian Capa Robles

NUEVO CHIMBOTE PER, 2017

 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE

BIOTECNOLOGA

INFORME DE PRCTICAS PREPROFESIONALES I y II

(Del 20 de junio al 20 de agosto del 2016)

TECNOLOGA DE CULTIVO DE MICROALGA Ankistrodesmus sp.

(Chlorophyta) EN AGUAS RESIDUALES DE CAMAL Y
PROCESAMIENTO DE SU BIOMASA. LABORATORIO DE
BIOTECNOLOGA Y BIOENERGTICA, UNIVERSIDAD
CIENTFICA DEL PER IQUITOS

Autor:

Eymar Enrrique Correa Valverde

Revisado y Aprobado por el Asesor

____________________________

M. Sc. Willian Capa Robles

 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE

BIOTECNOLOGA

INFORME DE PRCTICAS PREPROFESIONALES I y II

(Del 20 de junio al 20 de agosto del 2016)

TECNOLOGA DE CULTIVO DE MICROALGA Ankistrodesmus sp.

(Chlorophyta) EN AGUAS RESIDUALES DE CAMAL Y
PROCESAMIENTO DE SU BIOMASA. LABORATORIO DE
BIOTECNOLOGA Y BIOENERGTICA, UNIVERSIDAD
CIENTFICA DEL PER IQUITOS

Autor:

Eymar Enrrique Correa Valverde

APROBADO POR EL JURADO CALIFICADOR INTEGRADO POR LOS

SEORES MIEMBROS

M. Sc Willian Capa Robles
Presidente

....
Dr. Carlos Azaero Daz Dr. Walter Reyes valos
Integrante Integrante
DEDICATORIA

A mis padres Dorotea y

Santiago, y a toda mi familia por
todo su amor, apoyo y
enseanzas.

A todas las personas que han

contribuido en mi formacin y

desarrollo acadmico,

profesional y humano.

i
 AGRADECIMIENTO

Agradezco a Dios por esta bendicin.

A Marianela Cobos, Dra., jefa del Laboratorio de Biotecnologa y Bioenergtica

de la Universidad Cientfica del Per, por brindarme la oportunidad de
desarrollar mis habilidades y por contribuir en ampliar mis conocimientos en el
campo de la Biotecnologa en microalgas.

A todo el personal y colaboradores ligados directa e indirectamente al

Laboratorio de Biotecnologa y Bioenergtica. Profesionales, tesistas y
practicantes por los gratos momentos compartidos dentro y fuera del
laboratorio.

Al M. Sc. Willian Capa Robles, por su asesoramiento en la redaccin de este

informe y por ser uno de los docentes ms importantes en mi formacin
profesional.

A mi familia por todo su cario, comprensin y apoyo brindado durante el

tiempo de labores y aprendizaje.

A Alisson, por su cario, apoyo y sonrisas.

ii
 PRESENTACIN

Dando cumplimiento a lo dispuesto en el reglamento de Prcticas

Preprofesionales de la Escuela Acadmico Profesional de Biotecnologa de la
Universidad Nacional del Santa para optar el grado acadmico de Bachiller en
Biotecnologa, presento ante ustedes seores miembros del Jurado Evaluador
el presente informe correspondiente a las prcticas I y II, titulado: Tecnologa
de Cultivo de Microalga Ankistrodesmus sp. (Chlorophyta) en Aguas
Residuales de Camal y Procesamiento de su Biomasa. Laboratorio de
Biotecnologa y Bioenergtica, Universidad Cientfica del PerIquitos,
realizado en el perodo comprendido del 20 de junio al 20 de agosto del 2016.

El presente informe est basado en una serie de experiencias y conocimientos

adquiridos durante el desarrollo de las prcticas preprofesionales I y II en el que
se plasma la descripcin de procedimientos realizados para aislar, cultivar,
producir e identificar microalgas para su uso en biorremediacin, produccin de
biomasa, extraccin de lpidos entre otros.

Con la satisfaccin de haber cumplido con los objetivos trazados someto a

vuestra consideracin el presente informe.

Eymar Enrrique Correa Valverde

iii
 NDICE

DEDICATORIA_________________________________________________ i
AGRADECIMIENTO_____________________________________________ii
PRESENTACIN_______________________________________________iii
NDICE_______________________________________________________iv
NDICE DE TABLAS_____________________________________________vi
INDICE DE FIGURAS___________________________________________vii

I. INTRODUCCIN_________________________ __________ ____1

II. OBJETIVOS_______________________________________ ____3
2.1 Objetivo general_____ _______________________________3
2.2 Objetivos especficos_____________________________ ____3
III. DESCRIPCIN GENERAL DEL CENTRO DE PRCTICAS______ 4
3.1 Generalidades del centro de prcticas______________ _ ___ __4
3.2 Objetivo____________________________________ ________4
3.3 Ubicacin geogrfica__________________________ ________4
3.4 Estructura organizacional_________________________ _ ____5
3.5 Misin__________________________ ___________________9
3.6 Visin___________________________ __________________9
3.7 Servicios___________________________________ _______ _9
IV. DESARROLLO DE LA PRCTICA_______________________ _ _10
5.1 TECNOLOGA DE CULTIVO____________________ __ _10
5.1.1 Uso y manejo de equipos de laboratorio. __________ _10
5.1.2 Limpieza, desinfeccin y esterilizacin de materiales de
laboratorio. _ 10
5.1.3 Preparacin de medio de cultivo: Lquido y slido. __ 12
5.1.4 Tcnica de aislamiento en medio lquido. _________ _ 14
5.1.5 Produccin y cosecha (inicial) de biomasa. ____ ___ __ 15
5.1.6 Extraccin, purificacin, visualizacin y anlisis de ARN. 16
5.2 TECNOLOGA DE CULTIVO DE MICROALGA
Ankistrodesmus sp. (Chlorophyta) EN AGUAS RESIDUALES
DE CAMAL Y PROCESAMIENTO DE SU BIOMASA _____c _ _19
5.2.1 Evaluacin de la tasa de crecimiento de
Ankistrodesmus sp. cultivada agua residual de camal. __ _19

iv
 5.2.2 Determinacin del porcentaje de remocin
del nitrgeno amoniacal por Ankistrodesmus sp.
cultivada en agua residual de camal. _______ __________ 23
5.2.3 Cosecha (final) de biomasa y extraccin de
lpidos totales de Ankistrodesmus sp. cultivada en
agua residual de camal. _____________________ _____ ___ 24
V. CONCLUSIONES_____________________________________ _27
VI. RECOMENDACIONES 27
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS________________________ 28
VIII. ANEXOS____________________________________________ _38

v
 NDICE DE TABLAS

Pg.

Tabla 1. Ratios de calidad de ARN microalgal. 16

Tabla 2. Ratios de pureza del ADN y ARN. 17

Tabla 3. Pureza de las muestras. 18

Tabla 4. Diseo experimental. 19

Tabla 5. Porcentaje de lpidos totales en 50 mg de biomasa seca. 26

vi
 NDICE DE FIGURAS

Pg.

Figura 1. Ubicacin de la UCP. 5

Figura 2. Capacitacin en uso de equipos. 10

Figura 3. Esterilizacin de materiales. 11

Figura 4. Preparacin de medio Chu-10. 11

Figura 5. Soluciones stock para la preparacin de medio Chu-10. 12

Figura 6. Aislamiento por lavado celular. 13

Figura 7. Aislamiento, escalado y cultivo de Ankistrodesmus sp. 14

Figura 8. Produccin de biomasa. 14

Figura 9. Cosecha inicial de biomasa. 14

Figura 10. Extraccin y purificacin de ARN. 15

Figura 11. Espectro de absorbancia UV de ARN purificado. 15

Figura 12. Electroforegrama en agarosa al 1%. 16

Figura 13. Determinacin de la tasa de crecimiento. 20

Figura 14. Densidad celular de Ankistrodesmus sp. cultivada en agua

residual de camal. 20

Figura 15. Perfil de crecimiento de Ankistrodesmus sp. cultivada en

agua residual de camal. 21

Figura 16. Monitoreo de nitrgeno amoniacal usando kit LaMotte. 23

Figura 17. Remocin de nitrgeno amoniacal por Ankistrodesmus sp.

cultivada en agua residual de camal. 23

Figura 18. Cosecha final y extraccin de lpidos totales. 25

Figura 19. Biomasa seca en mg de Ankistrodesmus sp. cultivada en

agua residual de camal. 25
vii
 I. INTRODUCCIN

Las microalgas son unicelulares o pluricelulares, se encuentran en agua marina,

agua dulce o agua salobre y su tamao va desde pocos micrmetros hasta unos
pocos cientos de micrmetros (Kim, 2015). Los requisitos generales para que el
cultivo de microalgas sea exitoso son agua, luz, carbono, macronutrientes
(nitrgeno, fsforo, magnesio, silicatos) y varios micronutrientes (especies
dependientes) (Bux & Chisti, 2016). La nutricin en las microalgas es
predominantemente fotoautotrfica pero tambin puede ser hetertrofa o
mixotrfica (Chen et al., 2011). Aproximadamente el nmero de especies algales
van desde 350.000 a 1.000.000, sin embargo, slo se han estudiado y analizado
aproximadamente 30.000 especies (Richmond, 2004).

El cultivo de microalgas ha captado mucha atencin en los ltimos aos, debido

a sus mltiples aplicaciones: biofijacin de CO2 tratamiento de aguas residuales,
produccin de biocombustibles, alimento y biomolculas (Kim, 2015). Las
propiedades biolgicas de las microalgas y sus componentes se han estudiado
en las siguientes reas de investigacin: antioxidantes, antimicrobianos, agentes
anticancergenos, antiinflamatorios, salud cardiovascular, antiobesidad y
actividad antidiabtica (Domnguez, 2013).

Se ha reportado que la variacin en la composicin del medio de cultivo y/o el

uso de medios de cultivo alternativos pueden alterar la composicin bioqumica
de las microalgas, las cuales pueden ser explotadas para la produccin de
productos como lpidos, carbohidratos, protenas y pigmentos (Gouveia et al.,
2016). El uso de microalgas surgen como una tecnologa novedosa en el
tratamiento de aguas residuales (medio de cultivo alternativo) ya que se le puede
dar un valor agredo a estos efluentes usndolos como fuente de nutrientes para
el crecimiento microalgal lo cual generara mltiples aplicaciones ya sea en
alimentacin (humana y/o animal), biorremediacin e incluso en la
bioacumulacin de lpidos para un posible uso en la produccin de
biocombustibles.

El valor diettico de una microalga depende de su composicin y su contenido

energtico, el cual se relaciona con la cantidad de materia orgnica presente en

1
su biomasa. sta composicin se determina mediante tcnicas bioqumicas las
cuales estn diseados en funcin a los objetivos de inters a evaluar, los cuales
pueden ser determinacin de protenas, determinacin de carbohidratos,
extraccin y cuantificacin de lpidos, determinacin de pigmentos (Arredondo &
Voltolina, 2007)

Ankistrodesmus sp. ha sido reportado como una importante fuente de lpidos,

pigmentos, polisacridos (Chu et al., 1995; Kilham et al., 1997; Do Nascimento
et al., 2013) y tambin como un organismo modelo para estudiar el crecimiento
y la divisin celular (Kobayashi & Ito, 1977). Sin embargo, ha sido poco estudiado
en el tratamiento de aguas residuales. Por todo lo mencionado anteriormente el
objetivo principal de la presente prctica fue lograr el adiestramiento en la
tecnologa de cultivo y tcnicas bioqumicas aplicadas en microalga
Ankistrodesmus sp. cultivada en agua residual de camal.

2
 II. OBJETIVOS

2.1 Objetivo general

Lograr el adiestramiento en la tecnologa de cultivo de microalga

Ankistrodesmus sp. (Chlorophyta) en aguas residuales de camal y
procesamiento de su biomasa.

2.2 Objetivos especficos

Evaluar la tasa crecimiento de Ankistrodesmus sp. cultivada en aguas

residuales de camal.
Determinar el porcentaje de remocin de nitrgeno amoniacal por
Ankistrodesmus sp. cultivada en aguas residuales de camal.
Cuantificar la produccin de biomasa y lpidos totales de Ankistrodesmus
sp. cultivada en aguas residuales de camal.

3
 III. DESCRIPCIN GENERAL DEL CENTRO DE PRCTICAS

3.1 Generalidades del centro de prcticas

El laboratorio de Biotecnologa y Bioenergtica de la Universidad Cientfica del

Per, est ubicado en el corazn de la selva peruana, tiene como lneas
prioritarias el desarrollo de investigaciones relacionado con el estudio de
microalgas de agua dulce que fueron aisladas de las diferentes cuencas
hidrogrficas amaznicas. Asimismo, capacita jvenes estudiantes de pre y
posgrado en las diferentes tcnicas que implica el cultivo de estas microalgas y
sus aplicaciones para solucionar los problemas ms lgidos de nuestro pas.

En este laboratorio, actualmente se desarrollan proyectos de investigacin

subvencionados por PNICP (ex FINCyT), FONDECYT, CONCYTEC, adems de
fondos propios de la universidad.

3.2 Objetivo

Realizar investigaciones bsicas en microalgas de agua dulce para aplicarlas

en dar solucin a los problemas ms severos de nuestra regin y por ende del
pas.

3.3 Ubicacin geogrfica

El laboratorio de Biotecnologa y Bioenergtica de la Universidad Cientfica del

Per (UCP) se encuentra ubicado en la Av. Abelardo Quiones Km. 2.5 San
Juan Bautista Iquitos (Fig. 1).

4
 Figura 1. Ubicacin de la UCP (Google maps, 2016).

3.4 Estructura organizacional

Rector

Vicerrector de
Investigacin e Innovacin

Jefa de Laboratorio de
Biotecnologa y Bioenergtica

Asistente de Investigacin

Tesistas de Posgrado Tesistas de pregrado

Practicantes y voluntarios

Funciones de los integrantes del laboratorio de Biotecnologa y Bioenergtica

UCP

Jefe de Laboratorio
La prioridad del Jefe (a) de laboratorio es la bsqueda constante de fondos
presupuestales para la ejecucin de proyectos de investigacin a
desarrollarse en el laboratorio.
5
 Vigilar el cumplimiento de la normatividad universitaria en su mbito de
competencia; y promover el adecuado y eficiente desarrollo del Laboratorio.
Proporcionar informacin, asesora y apoyo tcnico que le sean solicitados
por la autoridad que lo requiera. Asimismo, lleva a cabo el seguimiento de las
actividades programadas y ejecucin de los acuerdos del Laboratorio.
Establecer comunicacin permanente con los responsables de proyectos,
con el objeto de mejorar sus actividades y conservar el orden en el
laboratorio.
Recepcionar y registrar la documentacin que se tramita en el laboratorio, as
como elaborar el Plan Operativo Anual.
Participar en convenios y proyectos especficos de inters para el laboratorio.
Administrar el inventario de materiales y equipos y otros bienes de laboratorio
Delegar funciones al asistente de investigacin y supervisar el cumplimiento
de las actividades. Controlar el cumplimiento de los deberes de los usuarios
del Laboratorio: docentes y estudiantes, establecidos en el Reglamento
interno.

Asistente de investigacin
Revisar fuentes primarias y secundarias de informacin relacionadas con el
tema del proyecto. Aportar en la argumentacin sobre las alternativas
metodolgicas y procedimentales que convienen dentro del proyecto de
investigacin. Codificar y preparar las bases de datos del proyecto de
investigacin.
Participar activamente en el diseo y desarrollo de las sesiones
experimentales y/o actividades de campo. Aplicar instrumentos y protocolos
de la investigacin bajo la supervisin del responsable del proyecto y Jefe (a)
de laboratorio. Participar en los procesos de recoleccin de datos y en otras
tareas propias del proyecto.
Participar en la elaboracin de los productos parciales y finales del proyecto
como generacin de informes, artculos, patentes, prototipos, etc., derivados
de la investigacin.
Cumplir con los criterios ticos involucrados en el desarrollo del proyecto de
investigacin.
Dar a conocer a todos los usuarios del laboratorio las normativas, los
procedimientos para la realizacin de los ensayos experimentales.

6
 Preparar las soluciones, medios de cultivo requeridos para los ensayos
experimentales de los organismos con los que se trabaja en el laboratorio.
Participar activamente en la colecta, identificacin y aislamiento de los
microorganismos en estudio para su posterior cultivo y caracterizacin
bioqumica.
Mantener actualizado el inventario de materiales, reactivos y equipos
disponibles en el Laboratorio.
Elaborar el cronograma del plan de trabajo de los tesistas, practicantes y
voluntarios que se encuentren en el Laboratorio, as como su monitoreo
mientras dure la estancia de cada uno de ellos.
Apoyar en la elaboracin de informes tcnicos y econmicos de los proyectos
en ejecucin y preparar informes tcnicos de sus actividades mensualmente.
Realizar otras actividades propias de investigacin que sean designados por
el (la) Jefe (a) de Laboratorio.

Tesistas de pre y posgrado

El alumno o persona interesada en realizar tesis de pre o posgrado deber
solicitar por escrito al (la) jefe (a) del Laboratorio, la autorizacin para la
realizacin del mismo, avalado por su asesor de tesis o responsable de
Proyecto.
Slo se autorizar el uso del laboratorio, en horas en las cuales est
disponible y cuando haya personal para su atencin.
Se debe solicitar por medio de una ficha de requerimiento, el material a
utilizar, el cual se facilitar si con ello no se afecta la realizacin normal de
las prcticas o el trabajo de otros usuarios.
Los reactivos a utilizar, se proporcionan siempre y cuando se tengan en
cantidades adecuadas.
Si se desea laborar en das y horas no hbiles, el alumno deber presentar
su solicitud para ingreso al laboratorio, avalada por el asesor de Tesis o
responsable de Proyecto. En caso de aprobacin, el Jefe (a) del Laboratorio,
solicitar se tramite el permiso al Vicerrectorado de Investigacin e
Innovacin, quedando as, excluido de toda responsabilidad, la cual recaer
en el aval y el tesista.

7
 Practicantes y Voluntarios
Para tener acceso al laboratorio, la autoridad que representa al alumno (os),
deber solicitar por escrito al Jefe del Laboratorio el acceso al mismo,
indicando nombres completos, carrera profesional, ciclo y periodo en que se
realizaran dichas actividades, adjuntando carta de intencin del alumno (os).
Para su estancia y uso del laboratorio deber seguir los lineamientos
dispuestos en el reglamento interno:
o En todo momento, el usuario del laboratorio deber presentar una
conducta apropiada dentro del mismo, respetando el trabajo de sus
compaeros y de los profesores investigadores que en el laboren.
o El usuario del laboratorio deber guardar orden durante su estancia
en el laboratorio.
o Durante el tiempo que el usuario trabaje en el laboratorio, el Asistente
de Investigacin del Laboratorio tiene toda la autoridad para hacer una
llamada de atencin al usuario por conducta no propia, mal manejo
del material, equipo e instalaciones del laboratorio, y en caso de
reincidir en estas actitudes, expulsar al usuario del mismo.
o Respetar el horario y la fecha programada para su sesin de trabajo.
o En caso de tener que realizar trabajo experimental antes o despus
de las horas de jornada laboral, deber notificarlo al (la) Jefe (a) del
Laboratorio con anticipacin, para que este autorice o no su estancia
en el laboratorio.
o En caso de tener que realizar trabajo experimental durante el fin de
semana o periodo vacacional, deber solicitarlo por escrito al Jefe del
Laboratorio con la debida anticipacin (15 das antes), para que ste
autorice o no su estancia en el laboratorio, y lo haga del conocimiento
del personal de vigilancia.

8
3.5 Misin

Desarrollar una red de biotecnologa y bioenergtica conformada por docentes

investigadores, asistentes de investigacin, estudiantes de pre y posgrado
altamente capacitados en el mejoramiento de la investigacin para su posterior
aplicacin por el sector privado, integrando la investigacin interdisciplinaria,
promoviendo el desarrollo de investigaciones bsicas y aplicadas y fomentando el
espritu empresarial y la transferencia de tecnologa de alta calidad para
aplicaciones de la biotecnologa en beneficio del ambiente, la agricultura, acuicultura
y la salud humana.

3.6 Visin

Ser un centro de excelencia a nivel nacional, en el cual se promueva la investigacin

y transferencia de biotecnologa para apoyar la academia y brindar servicios de
asistencia tcnica a la regin, impulsando el conocimiento de la biotecnologa y su
impacto en el conocimiento de las ciencias de la ingeniera, que generen
investigacin aplicada en beneficio del ambiente, la biodiversidad, la acuicultura en
nuestra regin y por ende en nuestro pas, con aplicaciones a nivel mundial.

3.7 Servicios

- Abastecimiento de cepas de microalgas de agua dulce con capacidad de

producir biodiesel y con caractersticas para ficorremediacin.

- Proporciona el uso de equipos de ltima generacin para lecturas de

calidad y cantidad de ARN, ADN y protenas. As, como registro fotogrfico
de imgenes de clulas.

9
 IV. DESARROLLO DE LA PRCTICA

5.1 TECNOLOGA DE CULTIVO DE LAS MICROALGAS

5.1.1 Uso y manejo de equipos de laboratorio

Para conocer el uso y el manejo de los equipos del laboratorio de

Biotecnologa y Bioenergtica de la UCP se cont con el apoyo de una
asistente de investigacin, quien realiz las explicaciones detalladas de cada
equipo del laboratorio, como son; destilador de agua, pH metro, balanza
analtica, Nanodrop 2000, Centrifuga simple, centrifuga refrigerada, autoclave,
cocina elctrica, cabina de bioseguridad, microscopio simple, microscopio de
epifluorescencia (Fig. 2), microscopio de luz invertida, entre otros. Asimismo,
se consideraron los cuidados necesarios para el buen uso de los quipos,
como, por ejemplo: no cerrar el grifo de agua sin antes apagar el destilador,
verificar la burbuja de nivel en la balanza analtica antes de usar, as como
tener en cuenta el tarar, ingresar a la cabina de bioseguridad solo materiales
estriles o desinfectados, blanquear el Nanodrop despus de cada lectura.

Figura 2. Capacitacin en uso de Equipos: A. Uso de microscopio de epifluorescencia;

B. Revisin de manuales

5.1.2 Limpieza, esterilizacin y desinfeccin de materiales de laboratorio

La limpieza y esterilizacin de materiales se realiz segn la naturaleza de los

materiales: vidrio y/o plstico. El material de vidrio fue lavado con detergente
(10 g/L), abundante agua potable y enjuagado con agua destilada,
posteriormente esterilizado en autoclave. De igual forma el material de
plstico fue sumergido en un depsito con leja (50 ml /L) y detergente (10 g/L)

10
 Fig. 3, por 24 h, despus enjuagado con abundante agua potable y agua
destilada, posteriormente esterilizado en autoclave. Por otro lado, los
materiales que no fueron esterilizados (vidrio y/o plstico) antes de ser
introducidos a la cabina de bioseguridad fueron desinfectados con alcohol al
70%.

Figura 3. Esterilizacin de Materiales. A. Lavado de material de plstico; B. Material de plstico

autoclavado.

5.1.3 Preparacin de medio de cultivo: Lquido y slido

La preparacin del medio CHU-10 (lquido) se realiz segn el protocolo

estndar de la UCP y la preparacin del medio slido consisti en Medio CHU-
10 suplementado con agar al 1.5-2.0% (Fig. 4). Cabe destacar que la
preparacin de las soluciones stock se realizaron en matraces por separado
con la finalidad de evitar la formacin de precipitados (Fig. 5).

Figura 4. Preparacin de Medio Chu-10. A: Lquido; B: Slido.

11
Figura 5. Soluciones stock para la preparacin de medio Chu-10

La principal causa en la formacin de precipitados en el cultivo de microalgas

es la variacin en el pH del medio, el crecimiento fotosinttico de microalgas
provoca un aumento en el pH, si este aumenta hasta 9, el carbonato se puede
precipitar y por tanto no estar disponible para el metabolismo microalgal
(Abalde et al., 1995). El metasilicato de sodio se disuelve con facilidad en agua
destilada tibia y es altamente alcalino, por lo que se precipita o polimeriza
cuando se lo agrega al medio. El problema se resuelve si la solucin stock del
silicio primero se acidifica a pH 2 con HCl concentrado. Pero las diatomeas
crecen bien si el medio es preparado con solucin stock de silicio a pH alcalino
(Stein, 1973).

Para evitar la formacin de precipitado productos de la esterilizacin en

medios marinos se sugiere el uso de estabilizadores (buffers). Slo dos
amortiguadores son usados en medios marinos: el tris
(hidroxilmetilaminometano) y la glicilglicina. Ambos amortiguan bien en pH
7.5-8.5. Las soluciones preparadas con estos buffers se deterioran con el
tiempo, por lo que deben ser usadas inmediatamente despus de su
preparacin (Stein, 1973). El tris es fuertemente alcalino por lo que para evitar
precipitaciones no hay que agregarlo directamente al medio, por lo que se
tiene que disolver la cantidad requerida de tris en agua destilada aparte y usar
mnimos volmenes para enriquecer medios marinos y ajustar el pH del medio
con el HCl concentrado. La glicilglicina es soluble en agua y el polvo puede
agregarse directamente al medio. Es altamente acdico, por lo que no causa
precipitados y el pH debe ajustarse con gotas de NaOH 1N. La glicilglicina es
rpidamente metabolizada por los microorganismos y debe ser usada slo con

12
 los cultivos axnicos, mientras que el tris puede usarse con los cultivos
xnicos (Stein, 1973).

Tambin se recomienda seleccionar correctamente los nutrientes que van a

componer el medio de cultivo microalgal ya que el medio tiene que estar
ajustado al pH ptimo para el crecimiento de la microalga.

5.1.4 Tcnica de aislamiento en medio lquido

El aislamiento en medio lquido se realiz por identificacin taxonmica segn

Bicudo & Menezes (2006) mientras que el aislamiento se llev a cabo
empelando la tcnica estndar de lavado celular (Fig. 6) por aislamiento con
pipeta capilar en microscopio de luz invertida (Arredondo & Vzquez, 1991).
Esto consisti en colocar una gota del cultivo de Ankistrodesmsus sp.
contaminado con otras microalgas en una lmina portaobjeto y cuatro gotas
de medio CHU. Luego con una pipeta capilar conectada a una manguerilla de
silicona con filtro se succion y transfiri las microalgas de inters hacia la
primera gota del medio de cultivo. Este proceso de transferencia se repiti
hasta obtener una clula microalgal sin contaminacin evidente.
Posteriormente, la gota con microalga fue transferida a un microtubo con 500
uL de medio CHU-10 hasta que se evidenci turbidez (crecimiento) en el
medio, posteriormente se transfiri a un tubo de ensayo con 4 mL de medio
CHU-10, despus de 1 semana se evidenci pigmentacin en el medio y
finalmente el medio se transfiri a un matraz con 500 mL de medio CHU-10 y
se cultiv en las siguientes condiciones: aireacin, 25C y 20 molm-2s-1
durante 2 a 3 semanas hasta observar la pigmentacin del medio (Fig. 7). La
pureza del cultivo se evalu mediante anlisis microscpico.

Figura 6. Aislamiento por lavado celular de Ankistrodesmus sp.

13
Figura 7. Aislamiento, escalado y cultivo de Ankistrodesmus sp. A. Identificacin de
Ankistrodesmus sp.; B. Cultivo de Ankistrodesmus sp. en 500 uL de medio Chu-10; C. Cultivo de
Ankistrodesmus sp. en 4 mL de medio Chu-10; D. Cultivo de Ankistrodesmus sp. en 500 mL de
medio Chu-10.

5.1.5 Produccin y Cosecha (inicial) de Biomasa

La produccin de biomasa se realiz a partir de 250 ml de cultivo puro de

Ankistrodesmus sp. del banco de cepas del Laboratorio de Biotecnologa y
Bioenergtica de la UCP, el cual se transfiri a un depsito estril el cual
contena 5 L de medio CHU-10 por un periodo de 3 4 semanas (Fig. 8). La
cosecha se realiz por centrifugacin a 4000 RPM por 5 min en el cual se
descart el sobrenadante e inmediatamente se aadi ms cultivo en los
mismos tubos y se volvi a centrifugar bajo las condiciones indicadas. Estos
pasos se repitieron hasta obtener toda la biomasa microalgal de los 5 L de
cultivo concentrada en tubos de 15 mL (Fig. 9).

Figura 8. Produccin de Biomasa. A: Da Cero; B: Da 21.

Figura 9. Cosecha inicial de biomasa. A. Ankistrodesmus sp. en 5 L de medio Chu-10;

B. Centrifugacin; C. Espesado de Ankistrodesmus sp.
14
 5.1.6 Extraccin, Purificacin, Visualizacin y Anlisis de ARN

La extraccin y purificacin del ARN se realiz segn el mtodo estndar de

la Unidad Especializada de Biotecnologa del Centro de Investigacin de
Recursos Naturales de la Amazonia Peruana de la Universidad Nacional de
la Amazona Peruana (CIRNA - UNAP) Fig. 10; a partir de tres gneros
microalgales (Ankistrodesmsus sp., Chlorella sp., Scenedesmus sp.) las
cuales fueron cultivas en medio Chu-10 con y sin fuente de nitrgeno.

Figura 10. Extraccin y purificacin ARN. A. Extraccin de 0.5 mL de microalgas frescas; B.

Mezcla de soluciones de extraccin y arena estril; C. Molido de muestra en piln; D.
Transferencia del tejido molido un microtubo con cloroformo:alcohol isoamlico (1:1) y centrifugar
a 13000 RPM x 10 min a 4C; E. Recuperar el sobrenadante y agregar cloroformo:alcohol
isoamlico (1:1); F. Centrifugar a 13000 RPM x 10 min a 4C ; G. Vortecear la muestra; H.
Transferir 1 ml de sobrenadante a un microtubo, agregar LiCl 2 2.5 M y centrifugar a 14 000 rpm
x 30 min a 4C; I. Precipitar con etanol absoluto a 13000 rpm x 8 min a 4C; J. Secado del pellet
en Termo bloock a 45C x 5 min; K. Muestras de ARN microalgal extradas y purificadas.

La integridad del ARN total extrado se evalu por el mtodo no

espectrofotomtrico mientras que la pureza del ARN por el mtodo
espectrofotomtrico basado en su perfil de absorcin UV (Fig. 11).

Figura 11. Espectro de absorbancia UV de ARN purificado (Farrell, 2010).

15
 La visualizacin de la corrida electrofortica en gel de agarosa al 1% se presenta
en la Fig. 12. Debido a que este ensayo se realiz con fines de adiestramiento
no se utiliz un Ladder.

Figura 12. Electroforegrama en agarosa al 1%.

El mtodo no espectrofotomtrico tiene la ventaja de ser rpido y

generalmente bastante exacto, se basa en la migracin de molculas en un
gel segn su peso molecular (tamao) en comparacin con un ladder (Farrell,
2010). Segn la observacin realizada en el software BioDoc- Analyse las
bandas no presentaron desfragmentacin o contaminacin significativa.

Por lo tanto, para aportarle veracidad a los resultados obtenidos en el mtodo

no espectrofotomtrico se procedi a realizar el mtodo espectrofotomtrico;
los ratios de calidad fueron medidos en Nanodrop 2000 (Tabla 4).

Tabla 4. Ratios de Calidad de ARN microalgal.

Microalga N Absorbancia Ratio Concentracin

260 nm 280 nm A260/A280 A260/A230 ng/L
Ankistrodesmus sp. + 11.68 7 1.790587 1.170341 467.2
Ankistrodesmus sp. - 6.523 3.229 2.02013 1.1 260.9
Chlorella sp. + 12.039 6.344 1.897699 1.541485 481.6
Chlorella sp. - 5.159 2.56 2.015234 1.553916 206.3
Scenedesmus sp. + 30.227 18.744 1.612623 0.410024 1209.1
Scenedesmus sp. - 3.903 2.008 1.943725 1.223511 156.1

16
 El mtodo a emplear para la extraccin de ARN depende del tipo de ARN que
se desea estudiar, los principales criterios que se deben tener en cuenta para
extraer ARN son: seleccionar el mtodo para la lisis celular, seleccionar el
mtodo apropiado para la inhibicin total de la actividad de nucleasas,
RNAsas y asegurar la viabilidad de la muestra, seleccionar el mtodo para la
desproteinizacin de la muestra (uso de proteinasa K, solventes orgnicos
como fenol y cloroformo, buffers de guanidinium, entre otros), seleccionar el
mtodo apropiado para la concentracin de ARN (RPM, temperatura,
combinacin de sales y alcohol) y por ultimo seleccionar las condiciones
apropiadas para el almacenamiento de la muestra (Farrell, 2010).

Los ratios de calidad proporciona una estimacin razonable de la pureza de

la muestra (Tabla 5). Un ratio A260/A230 de ARN bajo puede ser causado por
guanidinio o -mercaptoetanol, un mtodo para eliminar el exceso de tampn
de guanidinio es reprecipitar el ARN con acetato sdico y etanol, seguido por
lavado del pellet 2 - 3 veces con etanol al 70%. El mismo procedimiento se
debe seguir si el ratio A260/A230 es mayor que 2.4 (Gjerde, Hoang, & Hornby,
2009).

Tabla 5 Ratios de pureza del ADN y ARN (DS= 0.1). A280: Protenas y fenoles; A230: sales,
carbohidratos y otros compuestos orgnicos (Gjerde, Hoang, & Hornby, 2009; Farrell, 2010).

Muestra Ratio Valor Pureza

ADN A260/A280 1.8-2 Pureza optima
A260/A280 1.6-1.8 Pureza aceptable
A260/A280 <1.6 Presencia de compuestos aromticos y protenas
A260/A280 >2.1 Contaminacin con ARN
A260/A230 2.0-2.4 Pureza optima
A260/A230 <1.8 Contaminacin por compuestos orgnicos
A260/A230 <1.5 Contaminacin con sales, carbohidratos
A260/A240 1.4 Pureza optima
A260/A240 <1.4 Excesiva cantidad de sal en la muestra
ARN A260/A280 2.0-2.2 Pureza optima
A260/A280 1.8 Pureza aceptable
A260/A280 <1.8 Presencia de compuestos aromticos y protenas
A260/A230 2.0-2.4 Pureza optima
A260/A230 <1.8 Contaminacin por compuestos orgnicos
A260/A230 <1.5 Contaminacin con sales, carbohidratos
A260/A240 1.4 Pureza optima
A260/A240 <1.4 Excesiva cantidad de sal en la muestra

17
 En los ltimos aos se ha cuestionado la exactitud de la absorbancia A260
como indicador de concentracin y el ratio A260/A280 como indicador de
pureza (Glasel, 1995; Huberman, 1995; Manchester, 1995; Manchester,
1996). Esto debido principalmente a que las absorbancias varan en funcin
del pH y la cantidad de sales presentes en la muestra. El pH de la muestra
influye en la absorbancia, pero es ms fiable cuando se realizan mediciones
entre pH 7,5 - 8,5 (Wilfinger et al., 1997). Por lo tanto, se recomienda diluir las
muestras de ADN y ARN en tampn TE o fosfato. Tambin es comn que
cantidades excesivas de sal de arrastre (co-precipitado de cido nucleico)
pueden enmascarar la pendiente positiva de la curva que se asocia
usualmente con la porcin 240 - 260 nm del espectro. Esto se puede
solucionar con un lavado del pellet con etanol 70-75% inmediatamente
despus de la centrifugacin para eliminar la mayor parte de sal que se us
para acelerar la precipitacin de las molculas de cido nucleico (Farrell,
2010)

Por todo lo antes mencionado se concluy son los resultados presentados

en la Tabla 6.

Tabla 6 Pureza del ARN de las muestras microalgales

Microalga N Pureza
A260/A280
Ankistrodesmus sp. + Aceptable
Ankistrodesmus sp. - Optima
Chlorella sp. + Aceptable
Chlorella sp. - Optima
Scenedesmus sp. + Compuestos Aromticos
y protenas
Scenedesmus sp. - Aceptable
A260/A230
Contaminacin con sales,
carbohidratos y otros
compuestos orgnicos
Contaminacin con sales,
carbohidratos y otros
compuestos orgnicos
Contaminacin por
compuestos orgnicos
Contaminacin por
compuestos orgnicos
Contaminacin con sales,
carbohidratos y otros
compuestos orgnicos
Contaminacin con sales,
carbohidratos y otros
compuestos orgnicos

18
5.2 TECNOLOGA DE CULTIVO DE MICROALGA Ankistrodesmus sp.
(Chlorophyta) EN AGUAS RESIDUALES DE CAMAL Y PROCESAMIENTO
DE SU BIOMASA

5.2.1 Evaluacin de la tasa de crecimiento de Ankistrodesmus sp.

cultivada en aguas residuales de camal

El agua residual se recolect del Camal Municipal del Distrito de Punchanas-

Iquitos. Posteriormente, el agua residual se filtr y centrifug a 4000 rpm por
5 min.

El diseo experimental que se realiz se describe en la Tabla 7. En cada

tratamiento se inocul 3 mL del espesado de Ankistrodesmus sp. obtenida
en la cosecha inicial y cada tratamiento se realiz por triplicado.

Tabla 7. Diseo experimental

Medio Control Agua residual de camal diluida Agua residual de

al 50% camal pura
Chu-10 500 mL
Agua Residual de Camal 250 mL 500 mL
Agua Potable 250 mL
Total 500 ml 500ml 500 mL

El crecimiento microalgal se midi cada 24 h durante 15 das basados en la

absorbancia a 680 nm, la cual se midi usando espectrofotmetro Nanodrop
2000 (Fig. 13). Para lo antes mencionado se prepar una curva estndar. La
tasa de crecimiento se determin usando la siguiente ecuacin:

=(2 1 ) /(2 1 )

Donde:

= tasa de crecimiento
2 = Nmero de clulas al tiempo final
1 = Nmero de clulas tiempo inicial
2 = Tiempo final
1 = Tiempo inicial

19
Figura 13. Determinacin de la tasa de crecimiento. A: Extraccin de alcuotas; B: Lecturas
diarias de Ankistrodesmus sp. en Nanodrop 2000.

El cultivo de Ankistrodesmus sp. en el agua residual de camal diluida al 50%

obtuvo la densidad celular total ms alta en el da 15, correspondiente a 9.96
0.026 x 106 cel/mL mientras que el control obtuvo la densidad celular total
ms baja, 8.26 0.08 x 106 cel/mL aproximndose demasiado a la densidad
celular del agua residual pura de 8.45 0.08 x 106 cel/mL (Fig. 14). Con
respecto al 15vo da la comparacin entre grupos por ANOVA de una va y la
prueba Post Hoc - HSD de Tukey con un nivel de confianza del 95%,
Ankistrodesmus sp. obtuvo densidad celular significativamente ms alta en el
agua residual de camal diluida al 50% que en el control y el agua residual de
camal pura.

11
10
Concentracin Celular 10^6 Cel/mL

9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tiempo (da)

T1 T2 T3

Figura 14. Densidad celular de Ankistrodesmus sp. cultivada en agua residual de camal. T1
representa al control, T2 representa al agua residual de camal diluida al 50% y T3 al agua residual
de camal pura. Las barras de error representan la desviacin estndar.

20
 Con respecto al crecimiento en el agua residual de camal diluida al 50% se
evidenci el crecimiento ms rpido. En el control, el agua residual de camal
diluida al 50% y el agua residual de camal pura; el crecimiento fue ms rpido
entre los das 5-10, mientras que en los das posteriores el crecimiento
disminuy notablemente (Fig. 15).

11
10
Concentracin Celular 10^6 Cel/mL

9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Tiempo (da)

T1 T2 T3

Figura 15. Crecimiento de Ankistrodesmus sp. cultivada en agua residual de camal. T1

representa al control, T2 representa al agua residual de camal diluida al 50% y T3 al agua residual
de camal pura.

En trminos de tasa de crecimiento, la velocidad especfica de crecimiento ()

ms alta fue obtenida en el agua residual de camal diluida al 50%
correspondiente a 0.077 0.001 1 mientras que la velocidad especfica de
crecimiento () ms baja fue obtenida en el agua residual de camal pura
correspondiente a 0.062 0.002 1 siendo muy parecida a la velocidad
especfica de crecimiento () del control correspondiente a 0.063 0.002 1 .

El ANOVA de una va y la prueba Post Hoc - HSD de Tukey con un nivel de

confianza del 95% report la existencia de diferencias estadsticamente
significativas entre el control y el agua residual de camal diluida al 50%, as
como en el agua residual de camal diluida al 50% y el agua residual de camal
pura. Sin embargo, no existi diferencias estadsticamente significativas entre
el control y el agua residual de camal pura.
21
Los resultados reflejados en la velocidad especfica de crecimiento muestran
que el agua residual de camal puede ser usada como medio sustituto para el
cultivo de Ankistrodesmus sp. o si se requiere obtener un mejor crecimiento
se puede utilizar agua residual de camal diluida al 50%.

En el cultivo de microalgas existen factores determinantes en la variacin de

la tasa de crecimiento, por mencionar algunos tenemos: tipo de nutricin,
disponibilidad de luz, fotoperiodo y tamao celular (Bux & Chisti, 2016).

La nutricin en las microalgas es predominantemente fotoautotrfica pero

tambin puede ser hetertrofa o mixotrfica Un metabolismo autotrfico utiliza
carbono inorgnico tal como CO2 o bicarbonato como fuente de carbono,
mientras que un metabolismo heterotrfico se caracteriza por un consumo de
carbono orgnico como fuente de carbono para su desarrollo y en el
mixotrofismo se utilizan ambos tipos de fuentes de carbono. (Chen et al.,
2011). En los tratamientos evaluados se evidenci los tres tipos de nutricin:
nutricin auttrofa (control), nutricin mixotrfica (agua residual de camal
diluida al 50%) y nutricin hetertrofa (agua residual pura). Los resultados
muestran que el agua residual de camal diluida al 50% induce a un mayor
crecimiento de Ankistrodesmus sp. pues existe nutricin mixotrfica. Los
resultados evidencian que el crecimiento es ms rpido en autotrofismo que
en heterotrofismo ya que en heterotrofismo los compuestos orgnicos tienen
que ser biodegradados a compuestos ms sencillos para que posteriormente
puedan ser aprovechados por las microalgas.

La disminucin en la tasa de crecimiento a partir del da 10 se debe al efecto

del fenmeno Mutual Shading (Bux & Chisti, 2016). Resultados similares a
los obtenidos por Dickinson (2015); el cual concluye que el aumento de la
biomasa y densidad celular induce al crecimiento limitado por la luz de C.
vulgaris. La eleccin del fotoperiodo adecuado es importante en el cultivo de
microalgas, un cultivo con un fotoperiodo 24:0 h luz/oscuridad induce a un
crecimiento ms rpido (He et al., 2015) que un fotoperiodo 12:12 h luz/
oscuridad como el que se us en este trabajo. Otro factor importante el cual
afecta directamente la tasa de crecimiento microalgal es el tamao celular
(Yang & Gao, 2003).

22
 Por lo tanto, es importante optimizar la composicin del medio de cultivo para
lograr el ms alto rendimiento en el cultivo de microalgas y sus bioproductos.

5.2.2 Determinacin del porcentaje de remocin del nitrgeno amoniacal

por Ankistrodesmus sp. cultivada en aguas residuales de camal

El monitoreo de la concentracin de nitrgeno amoniacal se realiz con el uso

del Kit LaMotte (Fig. 16) al iniciar y finalizar los 15 das del cultivo de
Ankistrodesmus sp.

Figura 16. Monitoreo de nitrgeno amoniacal usando Kit LaMotte.

El porcentaje de remocin de nitrgeno amoniacal en el control y el agua

residual de camal diluida al 50% fue del 50%, por otro lado, en el agua residual
de camal pura el porcentaje de remocin fue 25% (Fig. 17). El ANOVA de una
va y la prueba Post Hoc - HSD de Tukey con un nivel de confianza del 95%
no report diferencias estadsticamente significativas entre el control y el agua
residual de camal diluida al 50%. La diferencia estadsticamente significativa
se evidenci entre el agua residual de camal pura con el control y el agua
residual de camal pura con el agua residual de camal diluida al 50%.

0.5

0.4
NH3-N(ppm)

0.3

0.2

0.1

0
T1 T2 T3

Inicial Final

Figura 17. Remocin de Nitrgeno Amoniacal por Ankistrodesmus sp. cultivada en agua residual
de camal. T1 representa al control, T2 representa al agua residual de camal diluida al 50% y T3
al agua residual de camal pura. Las barras de error representan la desviacin estndar.
23
El nitrgeno amoniacal presente en el agua residual de camal fue la fuente de
nitrgeno en este trabajo, es bien sabido que el nitrgeno es un nutriente
esencial para las microalgas debido a que es fundamental para la sntesis de
protenas cidos nucleicos y otros bioelementos (Schmollinger et al., 2014).

Investigaciones en diferentes gneros algales han demostrado que especies

de Chlorella y Scenedesmus proporcionan tasas muy altas de remocin
(80%) para el amonaco, nitrato y fsforo de aguas residuales (Cai, Park, &
Li, 2013; Bohutskyi et al., 2015). Incluso se ha informado que las especies de
Chlorella y Scenedesmus tienen un rango de tolerancia de 30 a 300 ppm de
NH4 N (Cai et al., 2013).

5.2.3 Cosecha (final) de biomasa y extraccin de lpidos totales de

Ankistrodesmus sp. cultivada en aguas residuales de camal

La cosecha de la biomasa se realiz por centrifugacin a 4000 rpm por 5 min.

Luego las muestras fueron secadas hasta peso constante en placas de Petri
de las cuales la biomasa seca se extrajo por raspado. El peso de la biomasa
se obtuvo por diferencia de peso:

Peso de la Biomasa = Peso de la Placa Con Biomasa Seca Peso de la

Placa Sin Biomasa

La extraccin de lpidos totales se realiz segn el mtodo descrito por Yu et

al., (2012). En el cual 50 mg de biomasa microalgal seca se tritur en un
mortero con solucin de cloroformo:metanol (2:1). El extracto obtenido se
transfiri a microtubos de 2 mL y se homogeniz en vortex por 30 s,
posteriormente se centrifug a 10000 rpm por 10 min. El sobrenadante fue
recuperado y resuspendido en cloroformo:metanol (2:1) cuando fue necesario.
Finalmente, el sobrenadante se transfiri a placas de Petri de peso conocido
las cuales fueron incubadas a 80C por 24 h (Fig. 18).

El porcentaje de lpidos totales obtenidos se determin con la siguiente

ecuacin:

24
 Contenido de lpidos (%) = (PL/PM) x 100
Donde: PL es el peso seco de los lpidos totales y PM es el peso seco de las
microalgas.

Figura 18. Cosecha final y extraccin de lpidos totales. A. Centrifugacin; B. Espesado

microalgal; C. Vertido del espesado microalgal en placa de Petri; D. Secado de la biomasa; E.
Pesado de la placa de Petri con la biomasa seca; F. Recuperacin de la biomasa seca por
raspado; G. Vortecear; H. Centrifugar; I. Secado de la solucin lipdica.

El ANOVA de una va y la prueba Post Hoc - HSD de Tukey con un nivel de

confianza del 95% report que la biomasa en la cosecha final (biomasa seca)
obtenida en el agua residual de camal diluida al 50% present diferencia
estadsticamente significativa en comparacin con el control y el agua residual
de camal pura. Mientras que en el control y el agua residual de camal pura
no existi diferencias estadsticamente significativas (Fig. 19).

450
400
Biomasa Seca (mg/500 mL)

350
300
250
200
150
100
50
0
T1 T2 T3

Figura 19. Biomasa seca en mg de Ankistrodesmus sp. cultivada en aguas residuales de

camal. T1 representa al control, T2 representa al agua residual de camal diluida al 50% y T3
al agua residual de camal pura. Las barras de error representan la desviacin estndar.

25
 La Tabla 9 muestra los resultados del porcentaje de lpidos totales en los tres
tratamientos a partir de 50 mg de biomasa seca. El contenido de lpidos totales
fue 19.86% - 20.26%. El contenido de lpidos totales fue ligeramente ms alto
en el control. Los resultados sometidos al ANOVA con un nivel de confianza
del 95% sugieren que el agua residual de camal usada como medio de cultivo
no promueve la acumulacin de lpidos totales en Ankistrodesmus sp.

Tabla 9 Porcentaje de Lpidos totales en 50 mg de biomasa seca. T1 representa al control, T2

representa al agua residual de camal diluida al 50% y T3 al agua residual de camal pura.

Peso % de Lpidos
T1 20.26610.6
T2 19.93310.2
T3 19.8665.1

Es bien estudiado que para la sntesis de ADN se requieren concentraciones

adecuadas de C, N y P; lo cual resulta en duplicacin de material gentico y
crecimiento celular. Se sabe que el nitrgeno es un nutriente esencial para las
microalgas. Sin embargo, la limitacin de nitrgeno es quizs el mejor gatillo
para la acumulacin de TAG en microalgas (Schmollinger et al., 2014).
Cuando existe un dficit de nitrgeno en el medio, el carbono no puede unirse
a este para la sntesis de ADN o protenas por lo tanto se acumula en forma
de lpidos.

En un estudio con un cultivo ultra limitado por nitrgeno el crecimiento de las

microalgas disminuy notablemente y el flujo de carbono en la va metablica
de dirigi al almacenamiento de carbono en forma de lpidos (TAG) (Li et al.,
2011).

26
V. CONCLUSIONES

1. El agua residual de camal diluida al 50% facilita el crecimiento de

Ankistrodesmus sp. y en este medio se puede conseguir un 50% de
remocin de nitrgeno amoniacal.
2. El agua residual de camal se puede utilizar como medio alternativo
para el cultivo de Ankistrodesmus sp. Sin embargo, no mejora la
acumulacin de lpidos totales.
3. Se logr el adiestramiento en la tecnologa de cultivo de microalga
Ankistrodesmus sp. (Chlorophyta) en aguas residuales de camal y
procesamiento de su biomasa en el Laboratorio de Biotecnologa y
Bioenergtica de la Universidad Cientfica del Per.

VI. RECOMENDACIONES

Identificar y cuantificar protenas, lpidos, carbohidratos y

pigmentos de Ankistrodesmsus sp. cultivada en aguas residuales
de camal.
Estudiar relaciones positivas o negativas entre Ankistrodesmus sp.
y microorganismos presentes en las aguas residuales de camal.

27
 VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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 VIII. ANEXOS

ANEXO 1: Preparacin de la Curva de Calibracin de Ankistrodesmus sp

a. Extraer una alcuota del cultivo unialgal o axenico

b. Determinar la densidad celular (cel/mL) mediante el mtodo de conteo

celular usando, cmara de Neubauer y leer su absorbancia a 680 nm.

c. Realizar diluciones seriadas con agua destilada a partir de la densidad

celular determinada en b y leer las absorbancias. *Se recomienda
hacer las diluciones del 100% al 50%, 25%, 12.5% .% . Considerar
entre 6 a 8 puntos.

d. Graficar los datos obtenidos en Excel (eje x el nmero de clulas y eje

y absorbancia), presentar ecuacin de la recta, R2, sealar la
interseccin en 0. Si el R2 es menor de 0.98 volver a hacer.

e. Recordar que y representa la absorbancia y x nmero de clulas.

Ankistrodesmus sp
0.06
ABsorbancia 680 nm

0.05
0.04
y = 4E-08x
0.03
R = 0.9895
0.02
0.01
0
0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000
Nmero de Clulas

38