Como todos los cientficos relacionados con los seres vivos, los microbilogos necesitan ver los

organismos que estudian; siendo su herramienta imprescindible el microscopio, tambin los

microbilogos necesitan realizar experimentos, que casi siempre requiere su cultivo en el
laboratorio. Cultivar un microorganismo significa proporcionarle las condiciones adecuadas para
su crecimiento y multiplicacin.

PROPIEDADES DE LA LUZ

La luz es aquella parte del espectro de ondas electromagnticas que es visible para el ojo
humano.

La longitud de onda es la distancia entre dos picos o entre dos valles de una

onda. La intensidad de una onda luminosa es la altura de esa onda.

Si un rayo incide en un objeto y es devuelto, se dice que se ha reflejado; si pasa a travs

del objeto, se ha transmitido, si transfiere parte de su energa a dicho objeto, ha sido absorbido.

Cuando la luz pasa a travs de una pequea abertura o alrededor de un objeto

opaco, se desva; a esta desviacin se llama difraccin.

La refraccin es la desviacin que tiene lugar cuando un rayo de luz penetra, formando un
Angulo, en un objeto de diferente densidad.

LA MICROSCOPA

En todos los microscopios, la calidad de la imagen depende de tres factores: El aumento es

la amplificacin de un objeto. El contraste es la diferencia de la intensidad luminosa. Una buena
resolucin significa ser capaz de percibir dos puntos adyacentes de una imagen como separados
uno del otro.

El poder de resolucin de un microscopio se puede aumentar usando lentes de aumento

de mayor tamao, iluminando el espcimen con una luz de menor longitud de onda, o usando un
material (como el aceite de inmersin) con un ndice de refraccin mayor que el del aire, entre la
lente del objetivo y la preparacin.

La apertura numrica (AN) es una medida del tamao de la lente del objetivo y depende
de si la lente va a ser usada con aceite de inmersin.

Un microscopio ptico utiliza la luz visible como fuente de iluminacin. Un microscopio

ptico compuesto posee dos sistemas de lentes, la lente del ocular y la lente del objetivo. Otro
sistema de lentes, el condensador, dirige la luz a travs del espcimen. La luz transmitida por el
espcimen forma una imagen en el tubo del microscopio; esta es aumentada por la lente ocular y
proyectada en la lente del ojo.
 Los microscopios pticos compuestos estn provistos de varios objetivos:

dbil seco (10x), fuerte seco (40x), y el objetivo de inmersin (100x)

Un microscopio ptico ordinario produce una iluminacin de campo claro, la luz pasa a
travs del espcimen y el campo se observa iluminado de forma brillante.

PREPARACIONES EN FRESCO

Una preparacin en fresco se emplea para observar microorganismos vivos. Una

preparacin en gota pendiente evita la desecacin y puede ser observada durante ms tiempo.
Ninguna de ellas aporta mucho contraste.

Los colorantes son compuestos qumicos utilizados para aumentar el contraste. La mayora
solo son efectivos si los microorganismos han sido fijados: muertos y adheridos al portaobjetos.
Los colorantes bsicos son iones cargados positivamente, y los cidos negativamente.

Un mordiente es un compuesto que aumenta la afinidad del espcimen por

el colorante o que recubre la estructura para hacerla ms visible.

Una tincin simple utiliza un solo colorante. Una tincin diferencial consta de dos etapas,
una tincin primaria y una de contraste.

La tincin de Gram es diferencial y distingue entre bacterias Gram positivas y Gram

negativas, debido a sus distintas superficies externas.

La tincin de cido alcohol resistencia o de Zichl Neelsen es diferencial y tie las

micobacterias de rojo, mientras que las otras bacterias son teidas de azul por el colorante de
contraste.

La tincin de Wirtz Conklin tie las endosporas, estructura de reposo de algunas

bacterias. La tincin de Leifson utiliza colorantes y mordientes para teir los flagelos, apndices
filamentosos para la motilidad. La tincin negativa se utiliza para observar la cpsula, una
estructura protectora de algunas bacterias.

En la microscopa de contraste de fases, el contraste se debe a que los diferentes

materiales absorben diferentes cantidades de luz. Debido a que puede utilizarse con clulas vivas
sin teir, puede usarse para estudiar el movimiento celular. Dado que no existe distorsin debida a
la fijacin o tincin, es una tcnica muy buena para observar detalles internos. Pero se observa un
halo de luz alrededor de la imagen, que es inevitable.

En la microscopa de campo oscuro, la imagen se ve brillante contra un

fondo oscuro. Se puede utilizar con clulas vivas sin teir.

 La microscopia de fluorescencia incrementa el contraste por medio de la fluorescencia y,
adems de servir para observar microorganismos, se puede utilizar para identificarlos. Las tcnicas
son anticuerpos fluorescentes (o inmunofluorescencia) son herramientas importantes de
diagnstico.

La microscopa de Nomarsky proporciona contraste por interferencia, como lo hace el

contraste de fases, pero produce una imagen semejante a las tridimensionales con ms detalle.

El microscopio electrnico posee un poder de resolucin mayor, y por tanto un mayor

aumento til que el microscopio ptico.

El microscopio electrnico de transmisin (MET) utiliza un chorro de electrones en lugar

de luz visible para definir el objeto. Produce aumentos de hasta 200000x (en comparacin con los
1000x para un microscopio ptico)

El MET requiere que las muestras reciban una preparacin especial, como la seccin fina,
la criofractura o el criograbado: a menudo se aumenta el contraste por sombreado metlico,
utilizando un metal pesado.

El microscopio electrnico de barrido (MEB) bombardea a la superficie del espcimen con

un rayo de electrones de tal manera que produce imgenes con una profundidad aparente
tridimensional.

Las muestras para microscopia electrnica de barrido deben ser congeladas y desecadas
al vaco y despus recubiertas con un metal pesado. Los especmenes son observados al vaco. El
MEB se utiliza generalmente para visualizar clulas enteras, pero la criofractura o el criograbado
tambin permiten observar estructuras internas.

Generalmente los microscopios de uso cotidiano son los pticos, ya que proporcionan una
buena informacin acerca del tamao, forma y apariencia general de las clulas; sin embargo, la
resolucin, y por tanto tambin el aumento, son limitados.

Los microscopios electrnicos, que permiten visualizar la ultraestructura celular , se

utilizan en investigacin. Los virus y los objetos ms pequeos como las macromolculas, solo
pueden verse mediante microscopios electrnicos.

Los microorganismos son sujetos ideales para la investigacin en el laboratorio porque se

pueden estudiar millones de ellos en un solo mililitro de medio, porque se multiplican
rpidamente y porque los conocimientos adquiridos pueden, a menudo, generalizarse a sistemas
celulares, plantas y animales (incluida la especie humana)

OBTENCIN DE UN CULTIVO PURO O AXENICO

Un cultivo axnico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola
clula. Los cultivos axnicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales por
ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo animal existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto
viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axnico se obtiene
artificialmente en el laboratorio.

La obtencin de un cultivo axnico es un proceso de dos etapas. Primero, hay que

esterilizar todos los materiales para eliminar todos los microorganismos presentes en ellos.
Segundo, hay que aislar y cultivar un solo microorganismo, para producir un clon de
descendientes.

La primera etapa para obtener un cultivo axnico es la esterilizacin: eliminacin de todos

los microorganismos de un material. Todos los instrumentos y materiales utilizados para obtener
un cultivo axnico deben ser esterilizados, incluyendo el medio de cultivo.

La esterilizacin por calor mata los microorganismos por desnaturalizacin de sus

protenas. El calor hmedo es ms rpido que el calor seco, pero se requiere una temperatura
mayor que la temperatura del punto de ebullicin del agua; normalmente se utiliza la autoclave.

El calor seco se utiliza para materiales que se daan por la humedad. Se necesitan
temperaturas de al menos 170 grados centigrados y un tiempo mnimo de una hora. El flameado
directo es otra forma de esterilizacin por calor seco.

La filtracin es el paso de un fluido a travs de una barrera con poros demasiado pequeos
para las clulas microbianas. La filtracin no elimina los virus por que pasan a travs de los filtros.

La esterilizacin qumica se utiliza para destruir los cultivos despus de un experimento y

para minimizar la contaminacin en el laboratorio.

La segunda etapa de para obtener un cultivo axnico es inocular, o introducir, una sola
clula de un microorganismo en un medio estril. Un clon es una poblacin celular descendiente
de una sola clula. Las colonias son clones que han crecido sobre un medio slido el tiempo
suficiente como para hacerse visibles.

Las clulas de un cultivo deben diluirse previamente, para poder aislar una de ellas.

En el mtodo de siembra por estra en placa, se sumerge el asa en el cultivo mixto y se

hacen estras sobre un medio slido en placa Petri. El proceso se repite hasta que se aslan clulas
individuales. Se incuban las clulas hasta que se observan las colonias. Entonces se repite el
proceso.

En los mtodos de siembra por vertido en placa y extensin en placa, las suspensiones de
clulas microbianas se diluyen antes de ser sembradas. A continuacin se pueden seguir dos
tcnicas distintas; o bien las diluciones se mezclan con agar fundido y se vierten en placa, o bien se
siembran en la superficie de una placa de agar, extendindolas con una asa de vidrio. Las placas se
incuban hasta que aparecen las colonias. A continuacin se repite el proceso.
 Un medio definido se prepara a partir de productos qumicos puros. Los microorganismos
exigentes requieren medios qumicamente complejos. La preparacin de los medios definidos es
laboriosa y las bacterias suelen crecer en ellos ms lentamente que en los medios complejos.

Los medios complejos se preparan a partir de extractos de sustancias naturales como la

carne, la sangre o la casena. A un medio lquido se le llama caldo. Los medios complejos son
fciles de preparar y permiten un crecimiento rpido de los microorganismos.

Los medios selectivos favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos, mientras

suprimen el de otros. Se utilizan para aislar una especie concreta, a partir de una mezcla compleja.

Los medios diferenciales como el agar sangre, se utilizan para la identificacin de las
colonias de un tipo concreto de microorganismo. Los medios selectivos - diferenciales reducen el
campo de identificacin e identifican una bacteria especfica.

Un medio de enriquecimiento se utiliza para aislar un microorganismo particular o un tipo

microbiano a partir de una poblacin natural grande y compleja

En general, los microorganismos crecen ms rpidamente a temperaturas medias. Para

disminuir los cambios de pH, generalmente se adicionan tampones a los medios.

Los microorganismos aerobios estrictos requieren oxgeno para obtener energa. Los
anaerobios estrictos no pueden crecer en presencia de oxgeno. Los microorganismos anaerobios
facultativos utilizan oxgeno si disponen de l, pero no lo necesitan. Los anaerobios aerotolerantes
no utilizan el oxgeno, pero tampoco les perjudica. Los microaerfilos requieren bajas tensiones de
oxgeno. Suministrar o excluir el oxigeno de un medio siempre representa un problema tcnico.

Los cultivos que se conservan para su estudio y como cepas de referencia; se les llama
cultivos de coleccin.

Se puede mantener un cultivo desecndolo (eliminacin total del agua).

Como tcnica de desecacin suele usarse la liofilizacin. Los cultivos tambin se pueden preservar
a bajas temperaturas. Tras la congelacin, el cultivo se almacena a -50C, bien en nitrgeno lquido
o en un ultracongelador.