ARTCULO
A. A. Pedroso,* J. F. M. Menten*1 M. R. Lambais, A. M. C. Racanicci,* F. A. Longo,* y J. O. B. Sorbara*
*Departamento de Ciencia Animal y Departamento de Suelo y Nutricin Vegetal, Colegio de Agricultura, Universidad de Sao
Paulo, 13418-900, Piracicaba, SP, Brasil
COMUNIDAD BACTERIANA DEL INTESTINO Y
CRECIMIENTO PRODUCTIVO DE POLLOS DE
ENGORDE ALIMENTADOS CON DIETAS
CONTENIENDO ANTIBITICOS
RESUMEN
Este estudio se llev a cabo con el fin de relacionar el rendimiento
productivo de pollos de engorde alimentados con dietas conte-
niendo antibiticos promotores de crecimiento con los cambios
de la microbiota intestinal. La tcnica de electroforesis en gel con
gradiente desnaturalizante (DGGE) de amplicones de la regin V3
de 16S rDNA fue utilizada para la caracterizacin de la microbiota.
Se realizaron 2 experimentos, uno con pollos criados en bateras
y el otro con pollos criados en piso. Los antibiticos mejoraron
el rendimiento productivo de pollos criados en piso. Avilamicina,
Bacitracina Metileno Disalicilato y Enramicina indujeron cambios
en la composicin de la comunidad bacteriana intestinal de las
aves en ambos experimentos. El nmero de genotipos bacteria-
nos encontrados en el tracto intestinal no fue reducido por la su-
plementacin antibitica en su medio. Sin embargo, los cambios
en la composicin de la comunidad bacteriana intestinal inducida
por los antibiticos quizs estn relacionados al mejoramiento del
rendimiento productivo. Esto fue indicado por la supresin de 6
amplicones y la presencia de 4 amplicones exclusivos del trata-
miento que obtuvo el mejor rendimiento productivo en el experi-
mento en piso.
Palabras Clave: antibitico, pollo de engorde, electroforesis en gel
con gradiente desnaturalizante, microbiotA.
INTRODUCCIN
Estudios inconclusos han intentado determinar los grupos de mi-
croorganismo intestinal que causan depresin del crecimiento en
animales y los agentes antimicrobiales que son beneficiosos para
la microbiota. La modificacin de la poblacin bacteriana del in-
testino del hospedero es causada por factores externos, como
el tipo de dieta o antibitico, no es fcil de monitorear utilizando
mtodos tradicionales (McCracken et al., 2001). En cambio, exis-
ten tcnicas moleculares para la identificacin de microrganismo
del tracto intestinal que no requieren cultivo in vitro (Bryant, 1997;
Raskin et al., 1997). En estudios recientes, han sido desarrolladas
muchas tcnicas moleculares para evaluar diferentes ecosistemas
(Netherwood et al., 1999; Pryde et al., 1999).
Un avance en el campo de la ecologa microbiana fue utilizar el
rDNA 16S como huella dactilar molecular, para clasificar e iden-
tificar los microorganismos teniendo en cuenta el desarrollo de
tcnicas independientes de cultivos para anlisis de la diversidad
microbiana (Amann et al., 1995). Es posible la conservacin de re-
giones de 16S rDNA utilizando primers, mediante PCR, que obtie-
ne amplicones que pueden separarse por la electroforesis en gel
con gradiente desnaturalizante (DGGE; Cury, 2002). Desde Mu-
yzer y ca. (1993), primeros en usar DGGE para estudiar las pobla-
ciones microbianas complejas, ha sido una atractiva alternativa de
cultivo. Muchos estudios utilizaron DGGE como una herramienta
para cuantificar componentes complejos de ecosistemas (Felske
et al., 1998), incluyendo la microbiota intestinal aviar (Netherwood
et al., 1999; van der Wielen et al., 2000; Zhu et al., 2002; Guan et
al., 2003; Hume et al., 2003; Lu et al., 2003).
Tannock (1998) mostr que el medio en el que los animales son
criados puede modificar la microbiota intestinal. Esto tambin ha
mostrado que el grado de contaminacin del ambiente afecta la
respuesta del promotor de crecimiento. Las aves criadas en piso
pueden mostrar ms infecciones patgenas que las criadas en
bateras (Willis et al., 2002), y su comunidad microbiana pueden
tener estructuras diferentes debido al acceso a la cama y la copro-
fagia. Collier y ca. (2003) notaron que en cerdos el efecto promo-
tor de crecimiento del antibitico se relaciona con la seleccin de
lactobacilos y sus efectos promotores de crecimiento.
Este estudio se realiz para determinar si el mejoramiento en
rendimiento productivo de pollos alimentados con antibiticos y
criados en diferentes ambientes (piso y bateras) puede estar re-
lacionado a cambios en la comunidad bacteriana del intestino, al
evaluarlo por DGGE.
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MATERIALES Y MTODOS
Aves, tratamientos y muestreo.
En el primer experimento (1), 200 pollos machos de 1 da de edad
(Ross) fueron colocados en 24 corrales (50 aves por corral). En el
segundo experimento (2), 288 pollos machos de 1 da de edad
(Ross) fueron colocados en 24 jaulas (121 aves por jaula). Se utili-
z un diseo randomizado por bloques en ambos experimentos,
con 6 repeticiones y 4 tratamientos. Los bloques fueron definidos
por la posicin de los corrales en el galpn o de las jaulas en las
bateras. Los tratamientos consisten en dietas a base de maz y
soya a las cuales se les adicion Avilamicina (10 mg/kg de alimen-
to), Bacitracina Metileno Disalicilato (27.5 mg/ kg de alimento) o
Enramicina (12.5 mg/ kg de alimento). El control fue la dieta no
suplementada. El alimento y el agua de bebida fueron proporcio-
nados ad libitum y las aves tuvieron un programa de luz continua
hasta los 21 das de edad. Se registraron semanalmente los pa-
rmetros de ganancia de peso, ndice de conversin alimenticia y
consumo de alimento.
Al final de los experimentos, 1 ave de cada unidad experimental
fue tomada aleatoriamente y sacrificada por dislocacin cervical
despus de 6 horas de ayuno. El intestino delgado fue rpidamen-
te extrado y abierto longitudinalmente, la superficie de mucosa de
duodeno, yeyuno e leon fue raspado con una cuchilla de ciruga
estril. Tambin se colectaron muestras de raspados de intestino
delgado de 5 aves recin nacidas. Los experimentos cumplieron
con la gua de cuidado y uso de animales de experimentacin
(Consejo Nacional de Investigacin, 1996) respecto al experimen-
to y cuidado de las aves sometidas a este estudio.
Extraccin de ADN
El ADN del genoma bacteriano fue extrado de muestras (300 mg)
utilizando el kit rpido de ADN (BIO101 Vista, CA) de acuerdo con
los protocolos del fabricante. Los geles (0.5 x Tris-borato EDTA y 1x
Tris-borato EDTA; 45 Mm Tris borato, 1 mM EDTA, pH 8) fueron
manchados con Sybr verde II (FMC Bio products, Rockland, ME).
La cantidad de ADN se cuantific usando un marcador de ADN de
peso molecular bajo (Invitrogen Life Technologies, Vista, CA), den-
sitmetro laser Fluorimagen (Molecular Dynamics, San Jose, CA) y
software de anlisis de fragmento (Molecular Dynamics).
Amplificacin de 16S rADN
La regin V3 de los genes 16S sADN (posicin 339 a 539 en los
genes de Escherichia coli) de la bacteria fueron amplificados por
los primers 338f-GC y 518r como lo describe Ovreas y colabora-
dores (2005) y la cantidad de productos del PCR fueron verifica-
dos por electroforesis como se describi anteriormente.
DGGE por amplicones de PCR
La electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante fue realiza-
da utilizando el Sistema de deteccin de mutacin universal Cdi-
go-D (Biorad, Hrcules, CA) en geles de 16 cm x 16 cm x 1 mm.
La separacin especfica de la secuencia de los productos de PCR
(amplicones) fueron obtenidos en 8% (p/v) de gel poliacrilamida
(acrilamida: bis 37-51) en 1x buffer tris-acetato EDTA (50x solucin
stock de tris acetato EDTA consiste en 2 M tris base, 1 M cido
actico glacial, 50 m/M EDTA) conteniendo 15 a 55% desnatura-
lizante gradiente lineal. El 100% de la solucin desnaturalizante
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contiene 40% (vol/vol) de formaldehido (BioRad) y 7.0 M de urea
(Bio Rad). La electroforesis se realiz con una constante de voltaje
de 200V a 60C por 4 horas. Los geles fueron marcados con 5ug
de Syber verde II (FMC BioProducts) / ml de 1 x buffer tris-acetato
EDTA, fijado en cido actico al 10%, y lavado con etanol al 50%.
Despus de la marcacin, los geles fueron analizados utilizando el
densitmetro laser FluorImegen (Dinmicas moleculares) y el sof-
tware para anlisis fragmentado (Dinmicas moleculares).
Estimacin de la diversidad
Se utiliz la data base de diversidad versin 2.1 de Discovery Se-
ries (BioRad) para analizar los patrones de bandas del PCR-DGGE
mediante mediciones de la distancia de migracin dentro de cada
banda del gel; as como tambin los nmeros de amplicones. Los
perfiles de amplicon fueron comparados utilizando el coeficien-
te de similitud, Cs (simple coincidencia), determinado como Cs=
[(2j) (a+b)-1] x 100, donde Cs es el ndice de similitud entre las
muestras, a es el nmero de bandas de PCR-DGGE en la banda
1, b es el nmero de bandas de PCR-DGGE en la banda 2, y j es
el nmero de bandas comunes de PCR-DGGE. As, dos perfiles
idnticos darn un coeficiente de similitud de 100%, mientras dos
perfiles completamente diferentes resultaran en 0% de similitud.
Estadstica
El anlisis estadstico de los ndices de similitud (Cs) entre la com-
posicin de comunidades bacterianas del intestino se realiz uti-
lizando Proc GLM de SAS (SAS Institute, 1998). El efecto de los
tratamientos en el nmero de amplicones por banda fue analizado
por el mismo procedimiento.
La presencia o ausencia de amplicones detectados en las dife-
rentes muestras fueron utilizadas para el anlisis agrupado por
jerarquas con Systat 8.0 software (Systat, 1996), utilizando el al-
goritmo de Ward para la vinculacin, y el porcentaje de distancia
como unidad de medicin.
RESULTADOS Y DISCUSIN
EEn un reporte previo, se verific que la microbiota que se adhiere
al epitelio difiere de la dispersa en el contenido intestinal y la sepa-
racin de estos puede no ser eficiente al realizarlo en laboratorio
(Zhu et al., 2002). As, en el presente estudio, las aves se some-
tieron a un ayuno de 6 horas antes del beneficio, por lo que se
colecto solamente la microbiota adherida al tejido. La microbiota
adherida al tejido es importante debido a que provee una protec-
cin fsica contra la penetracin de patgenos (Stern, 1994; Pryde
et al., 1999; Zhu et al. 2002) lo que puede disminuir el rendimiento
productivo en las aves, y porque est directamente relacionado a
factores digestivos y metablicos (Krause et al., 1999).
Figura 1.
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Figura 1. La electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante de los productos del PCR
de la regin V3 de 16S rDNA de muestras de intestino delgado de pollos de engorde criados
en bateras y suplementados con bacitracina metileno disalicilato (banda 1 al 6), Avilamicina
(banda 7 al 12), y Enramicina (banda 13 al 18). Las bandas 19 al 24 representan los grupos
controles no suplementados y la banda 25 representa los pollos recin nacidos

La electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante permiti la

deteccin de 104 y 79 diferentes amplicones en la regin V3 de
16S rDNA cuando las muestras fueron colectadas de aves criadas
en bateras y corrales, respectivamente (Figura 1 y 2). Consideran-
do la buena diversidad indicada en la literatura (Morre y Holdeman,
1974; Moore y Moore, 1995), DGGE tendra que sobreestimar los
nmeros de organismo encontrados. Incluso cuando el patrn
de migracin de los amplicones del pool de muestras obtenidos
en ambos experimentos fue analizado conjuntamente (Figura 3),
el nmero de amplicones detectados fue 105. Esta sobrestima-
cin pudo haber ocurrido debido a que algunas bacterias estn
presentes en pequeas cantidades de la poblacin del intestino;
en consecuencia, las muestras de su ADN podran representar Figura 3. La electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante de los productos del PCR de
la regin V3 de 16S rDNA de un pool de muestras de intestino delgado de pollos de engorde
menos del 1% del total (Muyzer y Smalla, 1998) y los amplicones criados en bateras (bandas 1 a 4) y criados en piso (bandas 6 a 9) y suplementados con
resultantes no seran captados por el densitmetro. Otra razn de Bacitracina Metileno Disalicilato (banda 1 al 6), Avilamicina (banda 2 al 7), y Enramicina (banda
porque el nmero de amplicones fue ms bajo de lo esperado po- 3 al 8). Las bandas del 4 al 9 representan los grupos controles no suplementados y la banda
5 representa los pollos recin nacidos. Se identificaron los amplicones que se supone son
dra deberse a la comigracin de algunos fragmentos con algunos benficos (A1 a A4) y perjudiciales (A5 a A10).
pares de base distintos (Jackson et al., 2002) o la misma relacin
de contenido C+G (Simpson et al., 1999).
La evaluacin de DGGE utiliz un pool de muestras de cada tra-
En ambos ambientes, el nmero de amplicones observados a tamiento (6 replicaciones) revel que los patrones de amplicones
travs de los tratamientos dietarios no fueron estadsticamente fueron diferentes en ambos experimentos (Figura 3). Ninguno de
diferentes (P>0.05), variando de 40 a 47 en el experimento en ba- los tratamientos antibiticos indujo un amplicon caracterstico re-
teras y de 23 a 27 en el experimento en piso. Knarreborg y cola- petido en ambos ambientes en el cual los pollos fueron criados.
boradores (2002) tambin encontraron que la suplementacin con
antibiticos en la dietas de pollos de engorde permite el estableci-
miento de una comunidad bacteriana distinta en el tracto intestinal
sin decrecimiento del nmero de genotipos como lo representan
los amplicones. De acuerdo a Collier y colaboradores (2003), el
establecimiento de algunas especies de bacterias puede estar re-
lacionado al desaparecimiento de otras especies que compiten
por los nutrientes y producen metabolitos txicos.

Figura 4. Dendrograma representa las relaciones entre patrones de banda de productos

Figura 2. La electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante de los productos del
PCR de la regin V3 de 16S rDNA de muestras de intestino delgado de pollos de engorde
criados corrales en piso y suplementados con bacitracina metileno disalicilato (banda 1 al 6),
Avilamicina (banda 7 al 12), y Enramicina (banda 13 al 18). Las bandas 19 al 24 representan
los grupos controles no suplementados y la banda 25 representa los pollos recin nacidos
El grupo que comprende a los recin nacidos mostr una mayor
diversidad en los patrones de amplicones y un mayor nmero de
los mismos en relacin con otros grupos (Figura 1 y 2). Esta comu-
nidad bacteriana puede haber sido introducida en la etapa antes
de la incubacin (Klasing, 1998), en la incubadora y despus de
la incubacin (van der Wielen et al., 2002) hasta la entrega de los
pollos al sitio experimental.
de PCR de la regin V3 de 16S rDNA de muestras de intestino delgado de pollos criados
en bateras y suplementados con Bacitracina Metileno Disalicilato (BMD), Avilamicina (AVI),
Enramicina (ENR). CON= grupo control no suplementado; NHC= grupo de pollos recin
nacidos. El nmero entre parntesis indica las repeticiones
El coeficiente de similitud, que compara los perfiles de amplico-
nes de dos patrones de bandas de PCR-DGGE, fue alto entre
las muestras del mismo tratamiento, registrando 84 y 91% de los
experimentos en bateras y corrales de piso, respectivamente. El
uso de dendrogramas basados en el algoritmo de Ward permite
observar con mayor claridad los efectos de los tratamientos (Mc-
Cracken, 2001). Analizando los dendrogramas (Figura 4 y 5), es
evidente que los tratamientos fueron responsables de la agrupa-
cin de la estructura; esto es, los antibiticos fueron capaces de
modificar la composicin de la microbiota intestinal de las aves.

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El cambio en la composicin ocurre sin cambios medibles en el
nmero de genotipos, como se describe anteriormente (Curry,
2002). Cambios similares fueron reportados por McCracken y co-
laboradores (2001) cuando roedores recibieron antibiticos en el
agua de bebida. La microbiota de los pollos del grupo control a los
21 das de edad fue ms similar a la de los pollos recin nacidos
que a los pollos alimentados con antibiticos.
to de la suplementacin con antibiticos sobre el rendimiento pro-
ductivo fue distinto en ambas condiciones de crianza (Tabla 1). Se
encontraron efectos significativos solo en las aves criadas en piso
(P<0.05). Las aves que recibieron Enramicina tuvieron mejor
ganancia de peso que las que recibieron Avilamicina, y tu-
vieron mejor conversin alimenticia comparada con el grupo
control y el grupo Bacitracina Metileno Disalicilato (P<0.05).

BATERAS CORRALES EN PISO

Tratamiento

Ganancia de Consumo de Conversin Ganancia de Consumo de Conversin

peso alimento alimenticia peso alimento alimenticia
(g/pollo) (g/pollo) (g/g) (g/pollo) (g/pollo) (g/g)

BMD 774 + 74 1042 + 20 1.35 + 0.12 839 + 34ab 1128 + 33 1.35 + 0.02a

AVI 780 + 55 1044 + 42 1.34 + 0.09 834 + 27b

1113 + 28 1.33 + 0.01ab

ENR 779 + 43 1055 + 42 1.35 + 0.07 876 + 21a

1148 + 15 1.31 + 0.02b

Control 825 + 31 1081 + 21 1.31 + 0.03 848 + 12ab 1146 + 27 1.34 + 0.01a

a,b
Media (+ SEM) en la misma columna con letras diferentes difieren significativamente (P<0.05)

El anlisis aislado de los dendrogramas generados (Figura 4, 5 y

Figura 5. Dendrograma representa las relaciones entre patrones de banda de productos
de PCR de la regin V3 de 16S rDNA de muestras de intestino delgado de pollos criados
en bateras (BAT) y en piso (FLOOR) y suplementados con Bacitracina Metileno Disalicilato
(BMD), Avilamicina (AVI), Enramicina (ENR). CON= grupo control no suplementado; NHC=
grupo de pollos recin nacidos.
Cuando las muestras de las repeticiones fueron mezcladas y uti-
lizadas para generar el dendrograma de los resultados de ambos
experimentos (Figura 6), la agrupacin ocurri ms claramente en
los pollos criados en los corrales de piso; la microbiota de estas
aves fueron similares, independiente del tratamiento antibitico.
La microbiota se vio ms afectada por el medio de crianza que por
el tratamiento antibitico.
6) y el nmero de amplicones probados insuficientes para carac-
terizar el mejoramiento del rendimiento productivo, debido a que
la comunidad bacteriana fue modificada por los antibiticos en
ambos sistemas de crianza y los efectos significativos de rendi-
miento fueron encontrados solamente en las aves criadas en piso.
Por otro lado, la bsqueda de amplicones especficos en el DGGE
inducida por los tratamientos antibiticos permite la identificacin
de 4 microorganismos (amplicones 1 a 4, figura 3) que fueron
exclusivos de los tratamientos con Enramicina. Adems, el trata-
miento con Enramicina mostr la ausencia de 6 microorganismos
(amplicones 5 al 10, figura 3) para los pollos criados en piso. El
mejor rendimiento productivo de las aves del tratamiento con En-
ramicina en el ensayo en piso se puede asociar con los cambios
en la composicin de la microbiota. Desafortunadamente, la exci-
sin y secuenciacin de los amplicones, para la identificacin de
especies, no fue posible ya que no eran visibles bajo el transilumi-
nador, a pesar de ser detectado con el software.

LITERATURA
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Amplicones: es un pedazo de DNA o RNA es la fuente o el

producto de eventos naturales o artificiales de amplificacin
o replicacin. Puede ser formado usando varios mtodos
incluyendo reacciones en cadena de polimerasa (PCR),
reacciones en cadena de ligasa (LCR), o natural duplicacin
Figura 6. Dendrograma representa las relaciones entre patrones de banda de productos del gene.
de PCR de la regin V3 de 16S rDNA de muestras de intestino delgado de pollos criados
en bateras (BAT) y en piso (FLOOR) y suplementados con Bacitracina Metileno Disalicilato
Dendrograma: tipo de representacin grfica o diagrama
(BMD), Avilamicina (AVI), Enramicina (ENR). CON= grupo control no suplementado; NHC= de datos en forma de rbol que organiza los datos en
grupo de pollos recin nacidos. subcategoras que se van dividiendo en otros hasta llegar al
nivel de detalle deseado.
Cuando se planific este estudio, se seleccionaron dos ambien-
tes de crianzas diferentes: criadoras en bateras, donde las aves
tienen acceso limitado a la excreta, y corrales en piso, donde las
aves tienen libre acceso a la excreta y al material de cama. El efec-

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