Disposicin subcelular de principales protenas vegetales

y transformacin transitoria de plantas de tabaco mediante

Agrobacterium tumefaciens
Diego Valderrama. Curso de Fisiologa vegetal. Departamento de Biologa. Facultad de Ciencias.
Universidad de Chile.

Resumen: Las plantas poseen protenas importantes para la realizacin de la fotosntesis, como
tambin para la sntesis de azcares. Estas protenas se encuentran distribuidas en diversos
compartimentos subcelulares tales como cloroplastos y mitocondrias y la localizacin de estas
protenas se ha podido vislumbrar a travs de experimentos de fraccionamiento de estos
compartimentos subcelulares y su consecuente anlisis de las protenas presentes en dichos
compartimentos. En este prctico se realiz fraccionamiento subcelular de cloroplastos para la
determinacin de la localizacin de las protenas clorofila I y clorofila II (encargadas de cosechar la luz
incidente) y de las subunidades y de Coupling Factor 1 (CF 1) que forman parte del complejo
encargado de la sntesis de ATP. Por otro lado, mediante la transformacin transitoria de plantas de
tabaco con Agrobacterium tumefaciens fue posible insertar material gentico al ncleo celular de
clulas vegetales que contena las protenas a estudiar fusionadas a protenas fluorescentes tales como
GFP, YFP y RFP que pudieron ser vistas bajo microscopio de fluorescencia identificando la localizacin
subcelular de estas protenas. Por tanto, el uso de estas dos metodologas ya sea de forma separadas
o complementndose sirven para la determinacin correcta de la localizacin subcelular de protenas
de inters.

Introduccin: La principal diferencia entre necesit localizar y analizar las protenas

clulas vegetales y clulas animales, es la
presencia de un organelo capaz de utilizar la
energa lumnica proveniente del sol y
transformarla en energa qumica, la cual es
almacenada en NADPH y ATP, quienes, a
travs de la fijacin de CO2, son necesarios
para la sntesis de hidratos de carbono
elementales para el desarrollo de las plantas.
De hecho, aproximadamente el 40% del peso
seco de una planta proviene del carbono fijado
en la fotosntesis (Lambers & Cols.,1998).
Como se mencion anteriormente, la
fotosntesis es llevada a cabo dentro de los
cloroplastos, encontrndose estos en las hojas
de las plantas. El cloroplasto posee una doble
membrana plasmtica que lo delimita y en su
interior se encuentran las vesculas tilacoidales,
las cuales se apilan en granas y es all donde
ocurre la actividad fotosinttica. Comprender
como se realiza esta actividad ha sido de gran
inters para la ciencia y es por ello que se
esenciales para su funcionamiento. Para este
fin es que se desarroll el mtodo de
fraccionamiento subcelular de cloroplastos, que
permite extraer protenas desde una
suspensin cruda de cloroplastos, adems de
saber si esas protenas provienen desde el
estroma o desde las vesculas tilacoidales
(Tobin, 1996).
Otro mtodo usado es la fusin de protenas de
inters con protenas fluorescentes (Spokes &
Cols.,2006) tales como GFP (Green
Fluorescent Protein), YFP (Yellow Fluorescent
Protein) y RFP (Red Fluorescent Protein) con lo
cual se logra determinar mediante microscopa
de fluorescencia la localizacin de estas
protenas de fusin. El cDNA de la protena
junto con el cDNA de la protena fluorescente se
encuentran insertos dentro del plasmidio Ti
modificado (vector binario) de Agrobacterium
tumefaciens, bacteria con la cual se transform
(Horsch & Cols. 1985) de forma transitoria hojas
de tabaco, en donde el lugar de infeccin no se
regenera y las clulas infectadas no pueden
heredar los transgenes insertados de modo
que, estos transgenes sern expresados solo
por un tiempo determinado (Bhaskar &Cols.,
2009).
Por ltimo, los objetivos de este prctico fueron:
obtener una suspensin cruda de cloroplastos
para realizar el fraccionamiento subcelular
permitindonos localizar la ubicacin de las
protenas de inters; lograr transformacin
transitoria de hojas de tabaco mediante
agrobacterium tumefaciens para determinar
mediante microscopa de fluorescencia la
localizacin de las protenas de fusin
insertadas.
Resultados
Fraccionamiento subcelular de cloroplastos
Tras la preparacin de la suspensin cruda de
cloroplastos, se procedi a la estimacin de
Figura 1. Gel de poliacrilamida en condiciones denaturantes sin teir (A) y con tincin de Coomassie (B). 1:Leader; 2-5:
Muestras NS, NP, TS, TP del Grupo de trabajo; 7-10: Muestras Grupo de Exequiel; 11: Control de Grupo de Mara
Jess G.; 12: Control de Grupo de Camila A.; 13: Control de Grupo de Valeria D.; 14: Control de Grupo de Pablo; 15:
Control de Grupo de trabajo.
clorofila, es decir, conocer la cantidad de
clorofila existente en la muestra usando acetona
para desunir la clorofila de la protena. La
estimacin se midi mediante absorbancia a
652 nm. El valor obtenido fue de 0,965 con el
cual se pudo obtener la concentracin de
clorofila en la muestra mediante la ecuacin de
la Ley Lambert-Beer, concentracin que fue de
2,8 mg de clorofila/mL y que para realizar los
siguientes experimentos se debi ajustar la
concentracin de 0,5 mL de la suspensin cruda
obtenida a 0,5 mg/mL por lo cual fue necesario
agregar 4,6 mL de buffer de sacarosa a la
muestra.
Una vez obtenida la nueva concentracin se
procedi a determinar la distribucin de la
Protena Clorofila I (PCI), Protena Clorofila II
(PCII) y de las subunidades y de Coupling
Factor 1 (CF1). Para eso se debi seguir el
protocolo, detallado en Materiales y mtodos,
con lo cual se obtuvieron 4 muestras (NS, NP,
TS y TP) las cuales fueron cargadas en un gel
en condiciones denaturantes obtenindose lo
mostrado en Figura 1. En la Figura 1A (gel sin
teir) las bandas de color verde indican la
presencia pigmentos de distintos pesos
moleculares, aunque al no haber bandas en el
carril 1 (leader) se dificulta conocer sus pesos
moleculares. Al teir el gel (Figura 1B) es
posible apreciar el Leader y por tanto conocer el
peso aproximado de las protenas en cuestin,
pues en el carril 4 se aprecian tres bandas con
pesos moleculares aproximados de 120 kDa, 60
kDa y 40 kDa. En el carril 5 no se aprecia banda
alguna, mientras que en carril 3 solo se aprecia
una banda de 60 kDA, caso similar al carril 2, el
cual posee una sola banda de 40 kDa. El carril
15 que contena al control, posea las 3 bandas
con los pesos moleculares anteriormente
mencionados.
Uso de protenas fluorescentes
La suspensin de agrobacterium para infiltrar
requera de 10 mL de un cultivo muestra
para alguna de las protenas fluorescentes a
usar: GFP, YFP y RFP. Para infiltrar las hojas
de tabaco, se realiz una pequea herida en el
envs de la hoja con una jeringa, la misma que
contena la suspensin de agrobacterium a
infiltrar. Se infiltr cada panel de una hoja por

Figura 2: Imgenes de microscopia de fluorescencia de muestras epidermal peel de hojas de tabaco infiltradas con
suspensin de agrobacterium con vector binario de protenas de fusin fluorescentes. A-D: Muestra Control (suspensin
de agrobacterium sin transformar); E-H: Muestra A; I-L: Muestra B; M-O: Muestra C; P-S: Muestra D. Imgenes A, E, I,
M y P corresponden a imagen de microscopia de campo; imgenes B, F, J, N y Q corresponden a imagen de microscopa
de fluorescencia superponiendo los filtros verde y azul; imgenes C, G, K, y R corresponden a imagen de microscopa
de fluorescencia usando filtro verde; imgenes D, H, L, O y S corresponden a imagen de microscopa de fluorescencia
usando filtro azul.

problema (Muestra A) que contena a separado con la muestra problema y en una

agrobacterium con el vector binario que codifica
hoja distinta se infiltr solo con agua como
control negativo.
Transcurridos 3 das desde la infiltracin se
procedi a preparar las hojas infiltradas para ser
expuestas en microscopio fluorescente
permitiendo localizar subcelularmente las
protenas de fusin, lo que se ve en la Figura 2
que muestra la fluorescencia de la muestra
problema trabajada (A) ms las dems
muestras trabajadas por los otros grupos de
trabajo.
La imagen 2G muestra la localizacin de las
protenas de fusin de la muestra A en
pequeos cuerpos circulares a lo largo de todas
las clulas perteneciendo al aparato de Golgi;
imgenes 2J y 2K corresponden a la muestra B
y corresponden a protenas que se localizan en
cloroplastos; imagen 2O muestra protenas de
la muestra C que se ubican en el ncleo de cada
clulas; por ltimo, la imagen 2R de la muestra
D presenta la localizacin de las protenas en
pequeos cuerpos redondos que se encuentran
en gran cantidad en cada clula por lo que se
podra tratar de cloroplastos. Estos pequeos
cuerpos aparecen en gran parte de las
imgenes de microscopa fluorescente que usa
filtro verde (2C, 2G, 2K, 2 y 2R) lo que es
debido a que con este filtro se produce la
autoflorescencia de los cloroplastos (Dalton &
Cols., 2011).
Discusin
Las plantas poseen complejas rutas
metablicas, en donde pasos de una ruta
metablica pueden ocurrir en distintos
organelos, lo que destaca la gran
compartimentalizacin que poseen las clulas
vegetales (Heining, 2013) como tambin el alto
trfico de molculas a nivel subcelular. Es por
eso que fue necesario desarrollar metodologas
que permitiesen localizar aquellas molculas de
inters para estudiar cierta ruta o proceso
subcelular. En el caso particular de este
prctico, se aplicaron mtodos que permiten
localizar a algunas de las protenas ms
importantes de la fotosntesis y la sntesis de
ATP mediante el fraccionamiento subcelular de
cloroplastos y la microscopa de fluorescencia
para protenas de fusin fluorescentes.
Distribucin de protenas en la membrana
tilacoide: mediante el mtodo de
fraccionamiento subcelular de cloroplastos se
consigui localizar las protenas de inters:
Clorofila I, Clorofila II y subunidades y de
Coupling Factor 1. Estas protenas tienen un
peso molecular aproximado de 110 kDa, 32
kDa, 55 kDa y 53 kDa respectivamente (Smith,
1977; Howe & Cols., 1985).
Con el uso del detergente Tritn X-100 en una
de las soluciones anlisis, se logr desnaturar
la membrana tilaciodal, solubilizando protenas
que se encontrasen en esta membrana, de
modo que, en esta solucin, las protenas se
encontraran en el sobrenadante. La otra
solucin anlisis contena NaBr, sal que genera
el efecto salting out, es decir, a altas
concentraciones de NaBr, esta sal competir
con las protenas por el solvente, disminuyendo
la solubilidad de las protenas hacindolas
precipitar (Desnoyers & Ichhapor, 1969)
encontrndose en el precipitado de la solucin.
En la Figura 1 se aprecia que en el gel sin
tincin no hubo bandas de pigmentos cuando
debi ocurrir lo contrario, tal como se puede
apreciar en las muestras del grupo de Exequiel.
En cuanto al gel con tincin, este si present
bandas, las cuales tenan un tamao
aproximado de 120 kDa, 60 kDa y 40 kDa. En
los carriles 3 y 4 (NP y TS) se encuentra la
misma banda de 60 kDa, lo que indicara que
las subunidades y se encuentran tanto en
las membranas tilacoidales como en el estroma
y que segn literatura (www.atpsynthase.info)
estas subunidades se encuentran en el
estroma, pero interaccionan con las
subunidades que se ubican intrnsecamente en
la membrana tilacoidal. La banda de 40 kDa se
encuentra tanto en el carril 2 como en el carril 4
(NS y TS respectivamente) y que debiese
corresponder a CPII; la banda de 120 kDa se
encuetra en el carril 4 y se tratara de CPI. Con
ambos resultados se puede concluir que tanto
CPI como CPII estn intrnsecamente unidas a
la membrana tilacoidal.
Visualizacin de las protenas fusionadas:
observando la Figura 2 y segn lo observado en
el da en que se us microscopia de
fluorescencia se pudo concluir que se realiz
una agroinfiltracin con xito que permiti oscuridad.
posteriormente localizar distintas protenas
fusionadas en diferentes organlos presentes en
las clulas vegetales. Es as, por ejemplo, que
en la Figura 2K se aprecia claramente como las
protenas fusionadas se localizan en los
cloroplastos de las clulas vegetales. Para la
visualizacin de las muestras se usaron los
filtros verde y azul lo que permite que excitar a
las protenas fluorescentes roja y verde
respectivamente, hacindolas emitir
fluorescencia a un menor nivel de energa,
emitiendo a la longitud de onda del rojo para
RFP y a la longitud de onda del verde para GFP
(Cardemil, 2017). Este fenmeno explicara la
autoflorescencia de los cloroplastos en filtros
verdes, pues al ser excitados con luz verde y
emitirn luz roja.
Como se pudo apreciar, los mtodos usados en
este prctico permitieron localizar las protenas
de inters de cada experimento, aunque cada
tcnica presenta alguna desventaja que en el
caso del fraccionamiento subcelular de
cloroplastos, esta es que para obtener mayor
eficiencia se debiese aislar cada protena de
forma independiente lo que se traduce en un
tiempo de trabajo mayor adems de que en
geles es difcil discernir entre protenas con
pesos moleculares similares. En cuanto a la
microscopia de fluorescencia, para lograr
fusionar las protenas fluorescentes es
necesario conocer la secuencia nucleotdica de
la protena de inters por lo que el querer
estudiar una protena con secuencia
desconocida ser complicado. A pesar de estas
desventajadas citadas se logr cumplir cada
objetivo propuesto, comprendiendo adems
que el uso complementario de estas dos
metodologas sera mucho ms eficiente en la
localizacin subcelular de protenas.
Materiales y mtodos
1. Fraccionamiento subcelular de cloroplastos:
tener en cuenta de que la clorofila es bastante
susceptible a la degradacin, de modo que se debe
proceder en todo momento en condiciones de fro y
1.1 Extraccin de cloroplastos: se colectaron 7 g
de tejido de hojas de espinaca, los cuales se
pusieron en mortero (ubicado en recipiente con hielo
y cubierto de papel aluminio) junto con 15 mL de
buffer de sacarosa (0,38M sacarosa, 0,07M
K2HPO4, 0,01M KCl, pH 7,5). Luego de ser bien
homogenizado, se filtr mediante gasa en vaso
precipitado de 100 mL, para posteriormente dividir
suspensin equitativamente en dos tubos Falcon de
15 mL y centrifugar a 3000 rpm por 5 minutos para
la sedimentacin de cloroplastos. Se desech
sobrenadante para luego agregar 200L de buffer a
cada tubo y proceder a resuspender el pellet
mediante agitacin y con mucha precaucin (no se
debe usar micropipeta para esta accin). Ya
resuspendidos, se procedi a juntar contenido de
ambos tubos en un solo tubo y completar hasta un
volumen de 1 mL con bffer de sacarosa dejando la
suspensin en oscuridad. Esa fue la preparacin
original de cloroplastos para los ensayos
posteriores.
1.2 Estimacin de clorofila: se solubiliz clorofila
agregando 5 mL de acetona al 80% en tubo Falcon
de 15 mL junto con 50 L de la preparacin original.
Luego se mezcl y centrifug a 3000 rpm por 2
minutos precipitando las protenas. Tras esto, se
midi absorbancia a 652 nm, teniendo 1 mL de
acetona al 80% (como blanco para calibracin) y 1
mL del sobrenadante en acetona. En caso de que la
absorbancia hubiese sido mayor a 1,0 se deba
agregar 5 mL al tubo Falcon y volver a repetir los
pasos descritos anteriormente hasta obtener un
valor menor a 1,0. La determinacin de la
concentracin de clorofila se hizo a partir de la
ecuacin de Lambert-Beer:
= 2,9 652
Una vez determinada la concentracin, se debe
ajustar la concentracin de 0,5 mL de preparacin
original hasta obtener concentracin final de 0,5
mg/mL. Para ello, se debe agregar buffer de
sacarosa hasta alcanzar concentracin final.
1.3 Distribucin de protenas en la membrana
tilacoide: se coloc 50 L de cloroplastos (0,5 mg
clorofila/mL) en 2 tubos eppendorf, agregando a uno
de los tubos 50 L de 5% Triton X-100 (muestra T) y
al otro 50 L de NaBr 4M (muestra N) para dejar
ambos tubos en hielo y oscuridad por 15 minutos
mezclando cada 2 minutos. Transcurrido el tiempo,
los tubos se centrifugaron a 14000 rpm por 5 minutos
para posteriormente traspasar los sobrenadantes
(100 L) a tubos nuevos (muestras TS y NS),
mientras que los sedimentos fueron resuspendidos
en 100 L de buffer de sacarosa (muestras TP y NP).
A estas 4 muestras se les agreg 50 L de buffer de
carga para hacerlos correr en gel. Se prepar
tambin un quinto tubo que contuvo 50 L de
extraccin original y 50 L de buffer de sacarosa.
Todas las muestras se dejaron en hielo por 20
minutos, agitndolos ocasionalmente hasta el
momento de cargar 15 L de cada muestra en los
posillos correspondientes en el gel. Tanto la
electroforesis de los geles como el tratamiento
posterior de los geles fue llevado a cabo por los
ayudantes.
2. Uso de protenas fluorescentes
2.1 Infiltracin de hojas de tabaco: se virti10 mL
del cultivo muestra problema (previamente inoculado
por ayudantes) en tubo Falcon de 15 mL,
sedimentando clulas a travs de centrifugacin a
3000 rpm por 10 minutos. Se desech el
sobrenadante y se resuspendieron las clulas con 1
mL de Medio de Infiltracin (MI: 1 x sales MS, 20%
sacarosa, acetosiringona 300M, MES 10mM pH
5,7). Se midi OD a 600 nm de la suspensin
tomando 20 L de esta, diluyndola en 980 L de MI
en cubeta de 1 mL (para blanco se us 1 mL de MI).
Por ltimo, se agreg 5 mL de la suspensin para
infiltrar en una jeringa con la cual se procedi a
infiltrar paneles de una hoja de tabaco, marcando
el rea infiltrada e infiltrando una hoja aparte con
agua (control negativo).
2.2 Visualizacin de protenas fusionadas: se
cort el rea infiltrada para hacer un epidermal peel
de la muestra problema y del control, montando
estas muestras en portaobjeto con agua y
tapndolas con cubreobjetos. Se visualizaron las
muestras en micrscopio fluorescente (Olympus
IX70) en campo claro y posteriormente con filtros
para visualizar protenas fluorescentes. Las
imgenes fueron grabadas por los ayudantes.
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