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RESUMEN
Con el objetivo de controlar el pardeamiento enzimtico de las frutas, se ha desarrollado una secuencia de
experimentos de inhibicin enzimtica basado en el sistema enzima-sustrato-inhibidor (tirosinasa-
pirocatecol-inhibidor). La actividad enzimtica de la tirosinasa se ha visto sustancialmente afectada por los
inhibidores de quelatacin (EDTA), polimrico (quitosano) y enzimtico (papana). La efectividad inhibitoria
de la papana se ha atribuido a su accin hidroltica sobre los sitios activos 176G y 182E de la tirosinasa. Una
aproximacin para la constante de Michaelis (Km a 25C) ha dado el valor de 2,0.
Palabras clave: Actividad, tirosinasa, pirocatecol, EDTA, quitosano, papana.
2 2
Difenol oxidasa
+ 2H2O la sustraccin de oxgeno disuelto, necesario
(Catecolasa) para desencadenar el proceso del pardea-
miento en los vegetales.
Oxidacin enzimtica del difenol a quinona Los patrones cinticos de la actividad en-
zimtica de las PPO de las especies vege-
La enzima tirosinasa, aun cuando tiene tales, estudiadas en un proyecto previo[7],
especificidad sobre la tirosina, es tambin han abierto las posibilidades de controlar el
una fenoloxidasa por lo que se la agrupa pardeamiento de tales especies. La inhibi-
con las PPO y se relaciona con la ecua- cin puede efectuarse por el uso de agentes
cin 1. Segn la clasificacin internacional reductores, quelatantes, acidulantes, inhibi-
de las enzimas, se encuentran dentro del dores enzimticos, tratamientos con otras
nmero 1, clase de las oxidoreductasas y enzimas o por el uso de agentes complejos
de acuerdo al tipo de reaccin catalizada como las ciclodextrinas o quitina. Tambin es
son los que transfieren electrones, iones o posible inhibir por procedimientos trmicos
tomos de hidrgeno. Debido a que la o de altas presiones. De todos estos, el uso
tirosinasa presenta el cofactor Cu2+, se las de quelatantes como el EDTA, la quitina
puede relacionar tambin con las enzimas (que posee propiedades antimicrobianas y
del tipo citocromo oxidasas. biodegradables) as como la papana han
cobrado especial inters en el control del
El modelo utilizado para la deteccin y la pardeamiento enzimtico de los vegetales.
actividad enzimtica de la tirosinasa basado
en la ecuacin 1 est generalizado por ser un Existe una gran cantidad de investigaciones
procedimiento sencillo y til para estudios y realizadas sobre el control del pardeamiento
experimentos del pardeamiento enzimtico. enzimtico de los vegetales; sin embargo,
El modelo permite estudios con inhibidores, no se han profundizado an en el uso de
lo que ha posibilitado plantear los esquemas productos naturales como la quitina o la
experimentales para este trabajo. papana, posibles de ser obtenidos a partir
de recursos marinos o de productos propios
En los estudios realizados por Chunchua
como la papaya.
Shi, Ya Dai y colaboradores[5], la purifica-
cin y propiedades espectroscpicas de la En este trabajo se estudia la inhibicin
PPO de la Nicotiana tabacum, les posibilit enzimtica basado en el sistema enzima-
determinar espectros de absorcin del cate- sustrato-inhibidor (tirosinasa-pirocatecol-
col (como sustrato) transformado a quinona inhibidor), utilizando tres tipos de inhibidores:
luego de la accin enzimtica. Los espec- por quelatacin sobre el cobre (II) con EDTA,
tros presentan picos de absorcin mxima complejo como el quitosano y de desnatu-
comprendidos entre 400 y 425 nm y para las ralizacin de la tirosinasa con la papana.
enzimas aisladas del tabaco y championes Se plantea que este ltimo una proteasa-
alrededor de 235 y 350 nm ambos siguiendo posee una alta capacidad inhibitoria sobre
un patrn de absorcin similares. la tirosinasa.
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ET S (t)k1
C(t) ET S (t) (8)
k1S (t) k1 k2 k1 k2 S (t)
k1
k k
k m
1 2
(9)
k 1
dP(t) dS (t)
vv k C(t) (10)
Rx 2
dt dt
k E S(t)
v 2T (11)
k S(t)
m
E S C E P
k1 De (13) se tiene :
S '(t)k m S (t) v max S (t)
dS(t)
k S (t)E(t) k C(t)(1) dS(t)
1 1
dt dS (t)
S k(t)dt dt vmax (14)
m
dE(t)
t S (t) k m t k m
ET E(t) C(t)(5)
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1 S (0)
ln frente a S (0) S (t)
t S (t) t
EXPERIMENTAL
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Pi ro cat ec ol , M ole s /L
0.0024
0.0023
Tubo 1 (con el tubo 7 de blanco) hasta tiem-
0.0022
po infinito para la obtencin del espectro VIS
0.0021
de la quinona. 0.0020
0.0018
cas y actividades comparativas a 25C.
0.0017
0.0016
A 0.8
0.0015
0.7 0 720 1440 2160 2880 3600 4320 5040 5760 6480 7200
0.5
Figura N. 7. Patrn de disminucin de la con-
0.4
centracin del pirocatecol debido a la accin de
0.3 la tirosinasa.
0.2
(a) Tirosinasa-pirocatecol
A
= 467 nm) producida por accin de la tirosinasa 0.15 (c)
sobre el pirocatecol a tiempo infinito.
0.22 (d)
A 0.20 0.05
0.18
0.16
0.00
0.14
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Y=A+B*X
Parameter Value Error
Figura N. 8. Inhibicin de la actividad enzimtica
0.08 ------------------------------------------------------------
A -0.22994 0.01569 de la tirosinasa (a) con EDTA (b), quitosano (c)
0.06 B 179.90509 7.64963 0 720 1440 2160 2880 3600 4320 5040 5760 6480 7200
------------------------------------------------------------
0.04
R SD N P
------------------------------------------------------------
t (seg)
0.9973 0.0060 5 1.684E-4
0.20
A
0.18
0.16
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
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y papana (d). (Figura N. 5) para la cuantificacin de la
quinona en los ensayos cinticos (Figuras N. 6
y 7); as como los de la inhibicin de la
DISCUSIN DE RESULTADOS actividad enzimtica con adicin de EDTA,
quitosano y papana (Figura N. 8).
Se ha definido un modelo
experimental como el propuesto en El espectro visible presenta un mximo a
la Tabla N. 1, a partir del cual se han 467 nm a pH bufferado de 7,00 la misma que
obtenido: el espectro visible de la difiere en relacin al reportado por Chuchua
qui- nona (Figura N. 4) producida Shi et al.[5] Quienes registran el valor para el
por la accin de la tirosinasa sobre el mximo alrededor de 410 nm a pH de 6,5.
pirocatecol; una curva de calibracin
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