GESTION ET TRAITEMENT

DES SITES POLLUS

ANNEXE 9
Les tests d'cotoxicit

A
9
 Annexe 9

Bioessais sur matrices liquide

1. LIXIVIATION

A lheure actuelle, il nexiste pas de norme nationale ou internationale relative la

lixiviation de sols en vue de raliser des essais dcotoxicit.

Nanmoins, un certain nombre de recommandations peuvent tre faites.

Solvant

Le solvant dextraction utilis doit tre non cotoxique et doit tre reprsentatif du
milieu environnemental tout en ayant des proprits dextraction significatives pour la
majorit des composs hydrosolubles.

Le solvant le plus couramment utilis est de leau ultrapure ou osmose. Leau est non
seulement un milieu pour les organismes aquatiques et galement un vecteur de transfert
de pollution significatif.

Ratio liquide/solide

Le ratio liquide/solide utilis dans les procdures de lixiviation classique est destin
reprsenter une quantit deau apporte au sol par prcipitation pour une quantit de sol
donne.

Dans la pratique celui-ci est dtermin de manire assurer la dissolution des polluants
hydrosolubles de faon significative et produire suffisamment de lixiviat pour la
ralisation des essais dcotoxicit.

Le ratio liquide/solide 10 est le plus classiquement utilis.

Filtration des lixiviats

La filtration des lixiviats pralablement la ralisation des bioessais peut entraner une
sous estimation de la toxicit. En effet, ltape de filtration peut conduire llimination
de particules prsentant une cotoxicit biodisponible. Il est recommand, si une
filtration savre ncessaire, de filtrer le lixiviat la valeur prconise dans le protocole
du bioessai, ou en absence dinformation dans celui-ci une valeur de 45 m.

Neutralisation du lixiviat

Le pH du lixiviat doit tre rajust une valeur compatible avec la survie des
organismes vivants (ce qui peut entraner une dstabilisation de certaines substances et,
de fait, une modification de leurs proprits et de leurs effets sur les organismes.

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Granulomtrie des chantillons

La granulomtrie de lchantillon de sol soumis la lixiviation est un paramtre

fondamental. En effet, pour une masse donne de sol, la surface dchange sera dautant
plus importante que la granulomtrie sera faible, affectant par la mme les transferts de
polluant de la matrice solide vers le liquide dextraction.

La granulomtrie de lchantillon soumis la lixiviation sera fonction des objectifs

fixs et du type de lixiviation mis en oeuvre.

Dans le cas de la comparaison des diffrents chantillons provenant dun mme site, il
est recommand dutiliser des chantillons de sol ayant tous la mme granulomtrie. La
taille optimale des grains dans ce cas est de lordre de quelques millimtres. Une
procdure de lixiviation simple consistant agiter vigoureusement lchantillon de sol
dans de leau ultrapure ou osmose pendant une priode de 24 heures est gnralement
utilise.

Bien que prsentant une faible reprsentativit cologique, cette procdure est simple et
prsente une bonne rptabilit.

Le potentiel de relargage long terme peut tre apprhend de faon plus raliste au
moyen dune procdure consistant soumettre un mme chantillon plusieurs
lixiviations successives.

Enfin dans le cas o un ralisme environnemental maximal est recherch, une procdure
de percolation sur colonne sera privilgie. Dans ces conditions le potentiel de relargage
au cours du temps pourra tre apprhend. La granulomtrie gnralement requise pour
conduire le test est infrieure 10 mm.

2. BIOESSAIS EN MILIEU LIQUIDE

Diffrents types de bioessais dvelopps en milieu aquatique peuvent tre utiliss pour
la caractrisation du potentiel cotoxique de lixiviats de sols pollus. Parmi ceux-ci
certains sont normaliss, dautres sont en cours de dveloppement.

2.1. Les bioessais normaliss

Ce sont dans la plupart des cas, des essais monospcifiques permettant de mesurer
leffet potentiel dun chantillon donn induit dans des populations dorganismes
vivants. Ils sont effectus sur diffrentes espces, parfois communauts, choisies
comme tant reprsentatives de divers niveaux trophiques, producteurs primaires,
consommateurs primaires et secondaires, dcomposeurs.

Les essais dcotoxicit vis--vis des producteurs primaires, applicables aux lixiviats
correspondent des mthodes dtude de linhibition de croissance de population

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dalgues vertes unicellulaires (test ISO 8692) ou de lentilles deau, Lemna minor
(T90 337).

En ce qui concerne les consommateurs primaires, deux essais dcotoxicit en milieu

aquatique font lobjet dun consensus international. Un essai de toxicit aigu o est
value linhibition de la mobilit de Daphnia magna et un essai de toxicit chronique
o linhibition de la reproduction de ce mme organisme est tudie.

Daphnia magna est un microcrustac ayant la particularit de se reproduire, dans des

conditions environnementales satisfaisantes, par parthnogense, cest dire par
reproduction asexue. Ceci prsente le double avantage de supprimer dune part une
ventuelle diffrence de sensibilit lie au sexe et dautre part de pouvoir disposer
dorganismes gntiquement identiques puisque tous issus dune mme daphnie mre.

Lessai dinhibition de mobilit consiste dterminer la concentration qui en 48 heures

inhibe la mobilit de 50% dune population de Daphnia magna mise en
exprimentation.

Lessai dinhibition de la reproduction consiste placer des daphnies dans diverses

concentrations de la substance exprimenter et dterminer, aprs 21 jours, la plus
forte concentration nentranant pas deffet sur la reproduction statistiquement
significatif par rapport au tmoin (NOEC).

Le danger potentiel des lixiviats vis--vis des consommateurs secondaires est tudi par
lintermdiaire dun essai de toxicit aigu vis--vis des poissons. Parmi les diverses
espces recommandes, deux sont couramment utilises, le poisson zbre Danio rerio et
la truitelle, Oncorhynchus mykiss. Divers protocoles exprimentaux ont t dvelopps :
essai statique (absence de renouvellement du milieu), essai semi-statique
(renouvellement priodique du milieu dessai), essai en continu (renouvellement
permanent du milieu dessai).Dans tous les cas, lessai consiste dterminer la
concentration qui en 96 heures entranera la mort de 50% dune population de poissons.
A la suite de cet essai de toxicit aigu court terme, un essai de toxicit prolonge vis-
-vis des poissons peut tre ralis. Le principe de celui-ci est identique au prcdent, la
seule diffrence tant la dure de lexprimentation qui est porte 14 jours.

Chez la truitelle, un essai consistant dterminer le pouvoir inhibiteur dun chantillon

vis--vis du taux de croissance a galement t normalis au niveau international (ISO
10229).

En ce qui concerne les dcomposeurs divers protocoles exprimentaux sont disponibles.

Certains sintressent des populations monospcifiques de micro-organismes (essai
dinhibition de la luminescence de Vibrio fisheri, ISO 11348-1-2-3, ou inhibition de
croissance de Pseudomonas putida, ISO 10712-2) dautre des populations mixtes de
micro-organismes (essai dinhibition de la consommation doxygne des boues actives,
NF EN ISO 8192, mthode dvaluation de leffet inhibiteur sur la nitrification par des
micro-organismes de boues actives NF EN ISO 9509, inhibition de la croissance des
micro-organismes des boues).

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Les derniers essais normaliss couramment utiliss sur des lixiviats de sols pollus
concernent lvaluation de la gnotoxicit de ceux-ci. Deux tests peuvent tre
prconiss, lun utilisant une bactrie Salmonella typhimurium permet de mettre en
vidence un pouvoir mutagne (test de Ames), lautre utilisant une larve damphibien
(pleurodle ou xrope) permet quant lui de rvler un pouvoir clastogne (altration
de structure des chromosomes) ou aneuplodogne (altration du nombre de
chromosomes) de ces lixiviats (AFNOR T 90 325).

2.2. Les bioessais en cours de dveloppement

A lheure actuelle de nombreux travaux sont en cours afin de dvelopper des protocoles
complmentaires ceux dj normaliss dans le but de pouvoir disposer de batteries de
bioessais plus compltes et reprsentatives.

Trois essais de toxicit chronique en phase liquide sont en cours de normalisation au

niveau national.

Deux concernent des microcrustacs cladocres. Le premier a pour objectif la

dtermination de linhibition de la reproduction de Ceriodaphnia dubia. Ce protocole
sappuie sur les travaux raliss par les agences de leau (1992). Cet essai permet, pour
le mme niveau dinformation que lessai sur Daphnia magna de rduire la dure de
lessai de 21 7 jours.

Le second essai est une mthode simplifie drive de lessai Daphnia magna 21 jours.
En effet, alors que dans le protocole 21 jours, les daphnies exposes en dbut dessai
sont de jeunes daphnies ges de moins de 24 heures, dans cette nouvelle proposition,
les daphnies mres sont ges initialement de 7 jours. La dure de lessai est aussi
rduite de 21 7 jours, mais en contre partie le niveau dinformation recueillie est
infrieur au prcdent.

Le dernier essai concerne ltude de la toxicit chronique vis--vis dun rotifre deau
douce Brachionus calyciflorus. Dans ce cas, cest linhibition de la croissance de la
population qui est le critre deffet. Ce test est le plus court des trois proposs puisquil
ne dure que 48 heures.

Au niveau international, des travaux sont en cours concernant le dveloppement de

lignes directrices pour les essais de toxicit en milieu aquatique (OCDE) et plus
spcifiquement pour linhibition de la croissance algale (ISO) avec les substances dites
difficiles et en particulier les chantillons colors, volatils ou contenant des mtaux.

Enfin en ce qui concerne les essais de gnotoxicit, un protocole dcrivant une mthode
dvaluation des effets gnotoxiques sur une plante suprieure Vicia faba est
actuellement en cours de discussion au niveau national (AFNOR). Cet essai est bas sur
la dtermination de la frquence de micronoyaux dans les cellules des extrmits
racinaires de Vicia faba.

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Au niveau international (ISO), un protocole dtude de linduction de la fonction SOS

chez Salmonella typhimmum (test Umu)est actuellement en cours dvaluation.
Linduction de cette fonction de rparation de lADN permet de rvler un pouvoir
gnotoxique des chantillons tests.

Enfin bien que non soumis une procdure de normalisation, lessai de mutation
reverse chez Vibrio fisheri (Mutatox) est souvent utilis pour valuer le pouvoir
mutagne des lixiviats de sols pollus.

2.3. Intrts - Limites des bioessais sur lixiviats

Les essais dcotoxicit sur lixiviats permettent dvaluer la mobilit, la biodisponibilit

et lcotoxicit des contaminants extractible leau.

La mise en vidence en particulier de la mobilit des polluants sous linfluence de leau,

est un paramtre trs difficile valuer au laboratoire. Les tapes de lixiviation ou
dextraction sont les prliminaires ncessaires. La principale difficult tient au fait
quactuellement aucune mthode ne fait lobjet dun consensus.

De plus, dans un certain nombre de cas, ces procdures conduisent lobtention

dextraits colors dont lcotoxicit peut se rvler particulirement difficile valuer
(test algue en particulier).

En rgle gnrale, ces bioessais sont considrs comme des indicateurs relatifs car peu
reprsentatifs de la ralit.

Par ailleurs, la ralisation de certains essais (Ames, algue, daphnie ou ceriodaphnie)

ncessite la filtration des extraits obtenus entranant par la mme une incertitude lors de
lexploitation des donnes.

3. BIOESSAIS SUR MATRICES SOLIDES

La mise en contact directe dun organisme vivant avec un sol pollu permet de rvler,
dans les conditions dexposition dveloppes, le pouvoir cotoxique de celui-ci. Compte
tenu du grand nombre despces animales ou vgtales vivants dans les sols ou
linterface sol/atmosphre, et du grand nombre de critre deffets potentiels, lvaluation
de lcotoxicit dun chantillon de sol, au moyen de bioessais, devra faire appel une
batterie dessais combinant diverses espces et diffrents critres deffet.

3.1. Les bioessais normaliss

Parmi lensemble des bioessais sur matrices solides actuellement utiliss certains font
lobjet dune normalisation au niveau national ou international.

En ce qui concerne les producteurs primaires, deux grandes approches ont t

dveloppes.

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La premire consiste tudier linhibition de la germination de semences et

dterminer la concentration inhibant la germination de 50% des graines mises en
exprimentation.

La seconde approche concerne ltude de linhibition de la croissance des vgtaux.

Dans ce cas, deux protocoles ont t dvelopps, lun intgrant la phase de germination,
lessai dinhibition de la croissance des parties ariennes (ISO 11269-2) lautre ralis
sur des graines prgermes excluant les effets potentiels des polluants sur les premiers
stades de dveloppement (essai dinhibition de la croissance des parties racinaires ISO
11269-1).

Ltude de lcotoxicit des matrices solides vis--vis des consommateurs primaires fait
actuellement lobjet de deux protocoles normaliss.

Dans les deux cas, lorganisme test est lannlide oligochte Eisenia fetida. Le premier
essai consiste dterminer la concentration entranant la mort de 50% des animaux mis
en exprimentation pendant 14 jours. Le second essai permet quant lui de dfinir la
plus forte concentration nayant pas deffet sur la reproduction de jeunes vers de terre
adultes placs pendant 1 mois dans un substrat contenant la matrice tudier (ISO
11268-1 et 2).

Les derniers essais normaliss concernent les micro-organismes du sol. Parmi ceux-ci,
deux ont pour objet la dtermination de la biomasse microbienne du sol (ISO 14240-1
et 2).

Le dernier essai concerne quant lui linfluence de composs chimiques sur les
processus de nitrification et de minralisation de lazote dans les sols (ISO 14238).

3.2. Les essais en cours de normalisation ou de dveloppement

De trs nombreuses mthodes permettant dvaluer lcotoxicit des matrices solides

sont actuellement en cours de normalisation ou de dveloppement.

Parmi les invertbrs du sol, des travaux sont actuellement en cours lISO dans le but
de standardiser une mthode dtude de linhibition de la reproduction dun insecte, le
collembole Folsomia candida (ISO 11267).

De mme, au niveau de lunion europenne, un protocole dtude de linhibition de la

reproduction des Enchytraedae est en cours dadoption.

Au niveau national, deux protocoles sont en cours dtude lAFNOR, lun relatif la
toxicit aigu des matrices solides vis--vis dune larve dinsecte (Oxythyrea funesta),
lautre concernant la mise en vidence de linduction de micronoyaux dans les cellules
mristmatiques de racines dorge (Hordeum vulgare).

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Divers tests sont actuellement en cours de dveloppement. Ainsi, un essai dinhibition

de croissance de lescargot (Helix aspersa) est actuellement en phase final de
dveloppement.

Chez les plantes, les travaux sorientent vers le dveloppement de test intgrant des
paramtres globaux de dveloppement (germination/croissance) et des biomarqueurs de
fonctionnement cellulaire.

Enfin, dans le domaine de la gnotoxicit, de nombreux travaux sont actuellement en

cours concernant la formation dadduits lADN.

La ralisation de bioessais sur matrices solides ncessite, dans la mesure o

ltablissement dune relation concentration/effet est recherche, lutilisation dun
substrat de dilution.

Divers types de substrat peuvent tre envisags:

Substrat (sable ou silice par exemple) ;
Sol non contamin prsentant des caractristiques similaires celles du sol test ;
Sol certifi ;
Sol artificiel standardis (ISO 11268 1 et 2 par exemple).

Dans la mesure o les bioessais sont raliss en vue dune valuation des dangers vis--
vis des organismes du sol, il est prfrable dutiliser un substrat plus proche de celui
rellement prsent sur le site. Dans ces conditions le choix se portera prfrentiellement
sur un sol non contamin prsentant des caractristiques similaires celle du sol test
ou dfaut vers un sol artificiel standardis type ISO 11268 1 et 2.

3.3. Intrts - Limites des bioessais sur matrices solides

Lintrt principal des essais dcotoxicit sur matrices solides rside dans le fait que
ceux-ci permettent de prendre en compte la biodisponibilit des substances prsentes
dans le sol ainsi que les interactions entre substances chimiques. En revanche, ceux-ci
sont dapplication dlicate voire impossible avec certain type de matrice tel que des
substrats trs argileux ou au contraire trs riches en graviers.

Bien videment, les bioessais ne peuvent porter que sur les espces acclimatables au
laboratoire.

Dans tous les cas, les bioessais devront tre raliss avec un substrat dbarrass des
lments grossiers (diamtre suprieur 4 mm).

Dans le cas dun sol contamin avec des substances volatiles, lexploitation des donnes
issues des essais de laboratoire est trs dlicate.

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OCDE ISO AFNOR CEN UE

Microorganismes
Vibrio fisheri 11348-1
11348-2
11348-3
Pseudomonas 10712-2
Resp. boues STEP 8192 T 90 340 EN 8192 87/32/CEE
Nitrification boues STEP 9509 NF 9509 EN 9509
Croissance boues
Biomasse microbienne des sols - 14240-1 et 2
Nitrification sols - 14238
Producteurs primaires
Algues 201 8692 NF ISO 8692 EN 28692
Lentilles deau - T 90337
Plantes terrestres 20 11269/1 X 31201
11269/2 X 31202
X 31203
Consommateurs primaires
Daphnies - Algues 202 6341 90301
211 10706
Ver de terre 207 11268/1 X 31251
11268/2
Consommateurs secondaires
Poissons 203 7346/1 T 90 303
7346/2 T 90 305
7346/3 T 90 307
10229
Gnotoxicit
Amphibiens - T 90 325
Ames 471

Tabl. 1 - Principaux essais dcotoxicit normaliss.

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