TOXICOLOGIE GENERALE

2001

XI ETUDE QUANTITATIVE DE LA TOXICIT :

EXTRAPOLATION DE L'ANIMAL A L'HOMME.

UTILISATION DES DONNES TOXICOLOGIQUES

EXPRIMENTALES DANS L'EVALUATION DE LA SCURIT DES
XNOBIOTIQUES

L'objectif essentiel de la toxicologie est d'valuer de manire prdictive et partir de

donnes exprimentales les risques que reprsentent pour l'espce humaine, les
animaux domestiques, voire le monde vivant tout entier (cotoxicologie) l'exposition
volontaire ou accidentelle a un agent chimique. Le potentiel toxicologique d'une
molcule est habituellement valu en administrant de fortes doses a plusieurs espces
animales. L'valuation du risque pour l'homme comporte deux tapes : en premier lieu
l'extrapolation chez l'animal de la forte dose la faible dose et en second lieu
l'extrapolation de l'animal a l'homme. Cette stratgie pose plusieurs problmes. D'une
part en raison de leur lourdeur et de leur dure, les tudes toxicologiques fournissent
les informations dcisives souvent aprs coup.. D'autre part l'extrapolation du risque
l'homme reste difficile tant que le mcanisme des effets toxiques n'est pas connu. Enfin
depuis quelques annes, la naissance d'une thique animale impose de diminuer,
chaque fois que cela est possible, l'exprimentation sur l'animal. La lgislation
internationale en vigueur ne permet l'utilisation de l'exprimentation animale qu'
condition qu'il n'y ait pas d'autres mthodes qui puissent utilement lui tre substitues.
Pour ces raisons de nouvelles stratgies ont t dveloppes en toxicologie. Celles-ci
s'appuient principalement sur l'utilisation de tests "in-vitro". De faon schmatique ces
tests ont deux objectifs : d'une part slectionner prcocement les molcules prsentant
le meilleur rapport cot/efficacit; (toxicologie de criblaqe ou de slection); d'autres part
expliquer le mcanisme des effets toxiques (toxicologie explicative). Finalement, ces

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tests permettent surtout de rduire le nombre de molcules qui devront tre soumises
l'ensemble de l'exprimentation animale extrmement coteuse.
En prambule, permettez-moi de vous rappeler les terribles tragdies
antrieures causes par les mdicaments pour lesquels les tudes
de toxicit se sont avres insuffisantes ou inadquates avant de
critiquer les quelques checs de lexprimentation animale. Une
exprimentation correcte des effets sur animal et une bonne
interprtation des rsultats suivie de mesures de prcaution auraient
vit la plupart de ces accidents.
Afin d'lucider les manifestations de toxicit srieuse chez l'homme, l'utilisation de
l'exprimentation humaine, faisant appel l'tude pidmiologique, ne donne que trs
peu d'informations. Il est donc indispensable de s'adresser cette toxicologie
exprimentale applique d'autre espces.
Or, s'il est dj difficile d'extrapoler avec justesse les observations obtenue partir d'un
petit groupe d'individus dfinis l'ensemble d'une population de race parfois diffrente,
cela devient une gageure de vouloir le faire partir d'un petit groupe d'animaux
l'homme.
La principale cause d'erreur d'extrapolation de l'animal l'homme rside dans la
diffrence entre les pharmacocintiques du xnobiotique chez les diverses espces, au
niveau de l'absorption, de la distribution et/ou de la mtabolisation.
Un mode d'action rellement diffrent entre le xnobiotique ou un de ses mtabolites
et le site de toxicit ne se rencontre que trs rarement.
L'exemple reprsent par la toxicit des vapeurs de ttrachlorure de carbone sur
diffrentes espces montre bien, par l'analyse des courbes logarithmiques de la
concentration en [CCl4] en fonction de la dure d'exposition, que c'est le paramtre
cintique qui est prpondrant. En effet, la modification de la dure d'exposition
ncessaire pour l'apparition d'un critre, concentration gale, est fonction de
l'espce(le cobaye est plus sensible que le lapin, le singe ou lhomme. Le rat est le plus

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sensible des 4 espces animales). En revanche, le fait que les courbes soient parallles
semble indiquer un mcanisme similaire.
Une des premires difficults rencontres lorsqu'on tente de corrler les effets toxiques
chez l'animal et chez l'homme, c'est l'impossibilit de comparer les courbes dose
rponse (pratiquement inexistantes pour l'homme et thiquement impossible raliser).
D'autre part, les symptmes modrs (tels les maux de tte, nause, perte de libido ...)
ne peuvent tre valus chez l'animal.
Des exemples classiques nombreux dmontrent qu'il est impossible de prvoir avec un
coefficient de certitude de 100% l'effet chez une espce partir d'tude sur une autre
espce : le fluroxne est un anesthsique pratiquement inoffensif chez l'homme mais
qui tue le chien, le chat ou le lapin, la pnicilline tue le cobaye, doses thrapeutiques
correspondantes.
En relevant les informations de la littrature jusqu'en 1974, Il est intressant de
constater que les tudes exprimentales sur animaux effectues en vue de dmontrer
le pouvoir cancrigne d'un xnobiotique avaient rvl, sur une base d'extrapolation
dose/unit de surface corporelle, toutes les substances cancrignes chez l'homme
l'exception de l'arsenic. Encore que certains chercheurs avaient not pour ce dernier
une incidence anormalement leve de leucmie et de lymphmes malins chez la
souris Suisse enceinte. En revanche, aucun effet oncogne chez l'homme n'a pu tre
mis en vidence pour plus de 1000 composs tests cancrignes chez l'animal.
L'analyse des recherches effectues dans ce domaine souligne nettement les quelques
divergences observes mais ne dmontre nullement l'absence de corrlation pour les
centaines de milliers de substances dont les renseignements obtenus sur le rgne
animal ont incit les autorits sanitaires prendre les prcautions indispensables afin
qu'aucun effet nocif n'apparaisse chez l'homme.
Si la Thalidomide et le Mexaforme ont fait tant parler d'eux, ce fut effectivement cause
d'une divergence de mtabolisation entre espces, mais combien d'autres
xnobiotiques n'auraient ils pas acquis une telle renomme si les tests de tratognicit
n'avaient t effectus.

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Il est vident que l'utilisation de doses relativement importantes au cours des tudes
exprimentales ainsi que de facteurs de scurit levs entranent un excs de
prudence lors de l'extrapolation l'homme.
D'autre part, il ne faut pas oublier que le xnobiotique est rsorb, puis mtabolis et
excrt de l'organisme et que l'ampleur de sa toxicit est fonction de la forme qui agit
au niveau du site toxique, soit non modifie, soit mtabolise (sous la forme d'un ou de
plusieurs de ses mtabolites), soit sous toutes ses formes, de mme que la dure de
son action dpend de la vitesse d'limination des composs actifs. Mme si la
corrlation entre espces tait de 90% chaque tape, elle ne serait que de 60%
maximum si on considre l'absorption, la raction xnobiotique-rcepteur, la raction
mtabolite-rcepteur, l'limination du xnobiotique et celle du mtabolite.
En dpit de ces remarques, l'valuation de marges de scurit partir du rgne animal,
semble garantir une innocuit d'usage bien suprieure celle que ne laisserait
supposer la plupart des tests obtenus par les mthodes alternatives se contentant
d'observer les effets toxiques.
Pour amliorer les rsultats d'extrapolation il est ncessaire d'effectuer des tudes
pharmacocintiques comparatives (absorption, distribution, biotransformation, raction
biologique et excrtion du xnobiotique et de ses mtabolites chez l'homme par rapport
aux mmes paramtres chez l'animal choisi) et d'lucider le mcanisme de toxicit.
Lors de l'laboration des paramtres pharmacocintiques, il est ncessaire de vrifier
si les mcanismes d'limination ou de mtabolisation sont saturables
(pharmacocintique non linaire) et s'ils procdent de la mme manire chez les di-
verses espces, compte tenu des formes prsentant une toxicit particulire.
L'exemple de l'herbicide 2,4,5-T (acide 2,4,5 triphnoxyactique) administr au rat
(t1/2=4,7 h), au chien (t1/2=77,0 h) et l'homme(t1/2=23,1 h) illustre clairement ces
phnomnes. Il montre que l'limination faible dose est suffisante chez l'homme, pour
que les risques de contamination soient considrs comme nuls lors d'un usage normal
suivant les prescriptions recommandes pour le produit.

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CONCLUSION
Le potentiel toxicologique d'une molcule est habituellement valu
en administrant de fortes doses plusieurs espces animales.
L'valuation du risque a l'homme comporte deux tapes : en premier
lieu l'extrapolation chez l'animal de la forte dose la faible dose et en
second lieu l'extrapolation de l'animal a l'homme. Cette stratgie
pose plusieurs problmes. D'une part en raison de leur lourdeur et de
leur dure, les tudes toxicologiques fournissent les informations
dcisives trop tard dans le processus de recherche et de
dveloppement des produits; ceci a des consquences importantes
sur les cots de dveloppement des mdicaments (actuellement 6
a 800 106 BEF pour une dure de dveloppement de 8 10 ans).
D'autre part lextrapolation du risque l'homme reste difficile tant que
le mcanisme des effets toxiques n'est pas connu. Enfin depuis
quelques annes, la naissance d'une thique animale impose de
diminuer, chaque fois que cela est possible, l'exprimentation sur
l'animal. Cette volution d'ordre culturel est maintenant inscrite dans
la loi. L'article 1 du dcret paru le 19 octobre 1987 nonce que les
expriences sur les animaux sont licites condition que ne puissent
utilement tre substitues d'autres mthodes exprimentales. Pour
ces raisons de nouvelles stratgies ont t dveloppes en
toxicologie. Celles-ci s'appuient principalement sur l'utilisation de
tests "in vitro". De faon schmatique ces tests ont deux objectifs :
d'une part slectionner prcocement les molcules prsentant le
meilleur rapport cot/efficacit; (toxicologie de criblage ou de

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slection); d'autres part expliquer le mcanisme des effets toxiques

(toxicologie explicative).
Les trois principaux propos de la toxicologie exprimentale sont :
(1) dtermination du spectre toxicologique chez certaines espces
animales choisies; (2) lextrapolation dautres espces et la
prvision deffets nfastes chez lhomme; et (3) dtermination des
taux seuils dintoxication.
La toxicologie a atteint un niveau de performances satisfaisant pour
identifier la toxicit animale.
Toxicologie de criblage ou de slection
Le principe des tests in vitro dvelopps dans une perspective de
criblage ou de slection est d'tudier l'effet des molcules
directement sur leur cible molculaire ou cellulaire in vitro. Lorsque
la cible ou le mcanisme molculaire de l'effet toxique est connus, il
est possible de dvelopper un test efficace in vitro : c'est le cas des
tests de gnotoxicit. Lorsque les mcanismes de l'effet toxique ne
sont pas connus ou sont multiples les tests ne peuvent tre que
pragmatiques, c'est dire que l'effet toxique des produits est tudi de
faon empirique sur des systmes cellulaires in vitro. Les systmes
cellulaires tudis sont choisis, soit parce qu'ils sont souvent la cible
des mdicaments (hpatocytes), soit parce qu'ils permettent d'tudier
une fonction dont l'altration est corrle avec un risque toxique
important (diffrentiation cellulaire/tratogense). Compte tenu de la
varit et de la complexit des effets toxiques un test ou une batterie
de test in vitro ne peuvent pas actuellement remplacer
l'exprimentation animale. En pratique, ces tests sont utiliss deux
priodes diffrentes du processus de dveloppement : d'une part

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avant les tudes sur l'animal pour identifier le plutt possible dans le
dveloppement les molcules ayant une toxicit rdhibitoire : c'est le
criblage toxicologique ou la toxicologie de criblage; d'autre part aprs
les tudes sur l'animal pour slectionner dans une famille chimique
les molcules prsentant le meilleur rapport tolrance/efficacit. C'est
la toxicologie de slection.

Toxicologie de criblage

Apres l'tape de synthse chimique qui conduit l'obtention d'un

nombre lev de molcules, un premier criblage pharmacologique
permet d'liminer les molcules inactives. Il est important ce stade
de dtecter prcocement les molcules actives qui ont une toxicit
rdhibitoire comme celles qui reprsentent des effets gnotoxiques
(mutagnes et clastognes) ou tratognes. Afin de pouvoir tudier
un grand nombre de molcules un stade trs prcoce de leur
dveloppement, il est ncessaire de mettre au point des tests
simples, consommant de faibles quantit de produit (quelques
dizaines de milligrammes) et pouvant tre automatiss. Ainsi pour
dtecter le potentiel clastogne des molcules, un test de dtection
du micronoyau par cytomtrie de flux a t dvelopp. Les
micronoyaux sont des inclusions cellulaires contenant l'ADN, qui
rsultent de l'exclusion de chromosomes ou de fragments de
chromosomes aprs la division cellulaire. Cette structure rsulte
d'une anomalie de position des chromosomes ou des fragments de
chromosomes par rapport au fuseau mitotique. Ainsi l'augmentation
du nombre des micronoyaux sous l'effet d'un agent chimique traduit

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l'existence d'altrations chromosomiques. Aprs incubation de

cellules provenant de la ligne QUO avec le produit tudi, les
micronoyaux peuvent tre dtectes par cytomtrie de flux aprs
marquage de l'ADN par un fluorochrome. Cette technique permet
d'analyser environ 3000 cellules par seconde et fournit une rponse
en moins d'une minute. Elle permet l'tude de 500 1000 molcules
par an alors que les techniques classiques ne permettraient d'tudier
que quelques dizaines de produits par an. Une nouvelle mthode
d'valuation du potentiel tratogne in vitro fonde sur la mesure de
l'inhibition de la chondrognse in vitro est venue rcemment
augmenter larsenal de la toxicologie cellulaire. Cultives en
micromasse, les cellules de bourgeon de membre d'embryon de rat
se diffrencient en chondrocytes. L'activit tratogne d'un produit
peut tre rvle par une inhibition slective de la prolifration ou de
la diffrentiation des cellules in vitro. Le test a t automatis pour en
faire un test de criblage. Ces tests rponse rapide permettent
d'liminer environ 30% des molcules synthtises. Ils permettent
d'identifier de faon prcoce l'intrieur d'une famille chimique les
molcules condamnes sans pour autant dtruire les familles
auxquelles elles appartiennent. De plus, la connaissance de la
relation structure-toxicit permet au chimiste de rorienter de faon
optimale ses programmes de synthse.

Toxicologie de slection

Au terme de cette premire tape, la collaboration troite entre le

chimiste, le biologiste et le pharmacologue a conduit slectionner

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une srie de molcules pharmacologiquement actives et ne

prsentant pas de toxicit rdhibitoire. A ce stade, les tudes de
toxicit sur l'animal ( en gnral administration du produit pendant 1
semaine) ont pour but de mettre en vidence un ou plusieurs
organes cibles de la toxicit. L'identification de ces effets toxiques in
vivo conduit dvelopper des modles cellulaires in vitro permettant
de dtecter rapidement et de quantifier le potentiel toxique des
molcules appartenant la mme famille. Les progrs rcents
raliss dans le domaine des cultures de cellules permettent
actuellement de cultiver de nombreux types cellulaires tels que
hpatocytes, cellules tubulaires rnales cellules de Leydig, cellules
endothliales, neurones et cellules gliales. Ces modles cellulaires
peuvent tre utiliss pour tester in vitro la toxicit des molcules.
Cependant la mise au point de ces modles est difficile en raison
notamment de la complexit des techniques de cultures. Par ailleurs
dans la mesure ou le mcanisme des effets toxiques n'est
habituellement pas connu, le choix des paramtres tudier est
souvent dlicat. Cependant les informations fournies par ces tests
sont capitales puisqu'elles doivent aboutir a slectionner, avant les
tudes lourdes de toxicologie sur l'animal, les molcules ayant a
priori le meilleur rapport efficacit/tolrance.

Un exemple particulirement dmonstratif pour illustrer, ce type

d'approche est celui des aminoglycosides dont la toxicit rnale est
une limitation majeure a leur utilisation thrapeutique. Le mcanisme
de la toxicit rnale des aminoglycosides a fait l'objet de nombreuses
tudes. Il a t tabli que du fait de leur caractre cationique, ces

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molcules se fixent sur les phopholipides de la membrane apicale

des cellules tubulaires rnales. Les phosphoinositides pourraient
jouer le rle d'un rcepteur spcifique aux aminoglycosides. La
fixation des aminoglycosides est suivie de leur internalisation et de
leur translocation dans les lysosomes. L'acidit du contenu
lysosomial augmente leur affinit pour les phospholipides et entrane
leur accumulation dans les lysosomes. De plus, la fixation aux
phosphoinositides inhibe la production d'inositol triphosphate.
L'identification de ces mcanismes a permis de dvelopper diffrents
modles cellulaires ou de membranes artificielles pour tudier la
relation structure-toxicit des aminoglycosides. Il a ainsi montr que
la fixation aux phospholipides dpend du nombre et de la position
des groupes chargs positivement dans la molcule.

Toxicologie explicative

Un domaine important de la toxicologie concerne l'tude du

mcanisme des effets toxiques. Ce domaine longtemps rserv aux
laboratoires de recherche en toxicologie doit maintenant galement
faire partie intgrante de l'activit du toxicologue travaillant dans
l'industrie pharmaceutique. Deux raisons justifient ces nouvelles
responsabilits: d'une part, seule la comprhension des mcanismes
des effets toxiques permet une extrapolation valable du risque a
l'homme, d'autre part, ces tudes sont de plus en plus souvent
exiges par les autorits d'enregistrement. La mise en oeuvre
d'tudes explicatives ncessite des quipes pluridisciplinaires de
haut niveau possdant des comptences dans de nombreuses

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disciplines telle que la biochimie, l'immunologie, la biologie

molculaire, la culture de cellules. Ces tudes longues et lourdes
grer ne peuvent intresser que quelques molcules qui, parvenues
au stade des essais cliniques phase II et III chez l'homme, ont des
effets toxiques dans les tests de toxicologie gnral chez l'animal.
Pour comprendre l'intrt de cette approche, il convient de rappeler
les bases traditionnelles de l'valuation toxicologique. Le potentiel
toxicologique d'une molcule est valu en administrant de fortes
doses plusieurs espces animales. L'valuation du risque se fait
partir de la marge de scurit reprsente par la diffrence entre la
plus forte dose sans effet chez l'animal (dose sans effet) et la dose
thrapeutique maximale chez l'homme. Plus la marge de scurit est
grande et plus le risque d'un effet toxique chez l'homme est faible.
Cependant il est clair que la comprhension du mcanisme de l'effet
toxique permet d'amliorer de faon considrable l'valuation du
risque. Un exemple particulirement dmonstratif est celui de la
lovastatine, mdicament hypocholestrolmiant inhibant l'HMG CoA
rductase, enzyme limitante de la synthse du cholestrol. Les
tudes prcliniques ont montr, qu' forte dose chez l'animal, cette
molcule tait hpatotoxique dans diffrentes espces et induisait la
formation de papillomes au niveau de la zone malpighienne de la
muqueuse gastrique du rat.
Il a t montr que ces anomalies tait prvenues lorsque la
lovastatine tait co-administre avec du mvalonate, prcurseur du
cholestrol dont la synthse est inhibe par le mdicament. Ces
exprience dmontrent que les effets toxiques de la lovastatine
forte dose sont secondaires une dpltion en mvalonate et de ce

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fait reprsentent une exagration de l'effet biochimique souhait.

Ceci permet d'affirmer qu'un tel effet est trs improbable des doses
beaucoup plus faibles correspondant aux doses thrapeutiques.
Au terme de cette brve revue gnrale sur les nouvelles stratgies
en toxicologie, il est raisonnable d'esprer, qu'en permettant une
slection plus prcoce des molcules et qu'en expliquant le
mcanisme des effets toxiques, la toxicologie ne soit pas perue
comme un frein au dveloppement des molcules mais plutt comme
un apport essentiel la conception et au dveloppement des
molcules actives.

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GERHARD ZBINDEN

Swiss Federal Institute of Technology and University of Zurich,

Schorenstrasse 16, CH 8603 Schwerzenbach, Switzerland

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