Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
BAB I
PENDAHULUAN
Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan berdasarkan partisi
cuplikan antara fasa yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fasa diam, dapat
berupa zat cair atau zat padat. Kita biasanya menganggap Tswett sebagai penemu
kromatografi, yang pada tahun 1903 menguraikan karyanya mengenai pemakaian kolom
kapur untuk memisahkan pigmen dalam daun. Istilah kromatografi dipakai oleh Tswett
untuk menggambarkan daerah berwarna yang bergerak ke bagian bawah kolom
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan unsur-unsur yang akan dipisahkan
terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner
dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat
atau melalui fase yang stasioner. Fasa stasioner mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan
fasa yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas. Maka semua jenis kromatografi
yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair.
Pembahasan teknik kromatografi modern, baru lengkap bila disebut kromatografi cairan
kinerja tinggi (HPLC). Kromatografi cairan kolom klasik merupakan prosedur pemisahan
yang sudah mapan dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom
karena gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu
pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom
cairan hidup kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan
tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000
p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dan eluen dipompakan
ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini
dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan
yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal, HPLC telah
terbukti luas penggunaannya dalam kimia organik
1. Pengertian HPLC
2. Jenis- jenis HPLC
3. Instrument HPLC
4. Prinsip kerja HPLC
5. Aplikasi HPLC
6. Manfaat Penggunaan HPLC
7. Kelebihan dan Kekurangan HPLC
8. Penggunaan alat
9. Analisa data
10. preparasi sampel
1.3 Tujuan
a. Mengetahui Pengertian HPLC
b. Mengetahui Jenis- jenis HPLC
c. Mengetahui Instrument HPLC
d. Mengetahui Prinsip kerja HPLC
e. Mengetahui Aplikasi HPLC
f. Mengetahui Manfaat Penggunaan HPLC
g. Mengetahui Kelebihan dan Kekurangan HPLC
h. Mengetahui cara pengoperasian alat
i. Mengetahui cara pengolahan data
BAB II
PEMBAHASAN
A. PENGERTIAN
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada teknik
kromatografi di mana fase geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam bentuk cair
atau padat.
Metode ini sangat bermanfaat di bidang farmasi untuk menganalisis secara simultan beberapa
analit dalam martiks sederhana maupun kompleks.
Pada akhir 1960-an, semakin banyak usaha untuk pengembangan kromatografi cair sebagai
suatu teknik untuk mengimbangi kromatografi gas. KCKT adalah kromatografi cair kolom
modern, yang dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi kolom menjadi suatu
sistem pemisahan yang cepat dan efisien.
Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan peningkatan
performa kolomnya yang menggunakan kolom dengan ukuran dimensi dan partikel yang jauh
lebih kecil dari kolom yang dipakai pada kromatografi kolom, sehingga agar fase gerak dapat
mengalir pada kolom, fase gerak dipompa dengan tekanan tinggi. Di samping itu, kinerja
tingginya dalam analisis didukung dengan adanya berbagai sistem deteksi dengan kepekaan
tinggi yang dapat diintegrasikan dengan sistem kromatografinya.
KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas (KG), keduanya dapat
digunakan untuk menghasilkan efek pemisahan yang sama baiknya. Bila derivatisasi
diperlukan dalam KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis.
Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama.
Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan
lebih besar dalam analisis.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan metode kromatografi lainnya,
antara lain :
a) Cepat :: waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang uncomplicated waktu analisis kurang
dari 5 menit bisa dicapai.
b) Resolusi tinggi :: berbeda dengan KG, interaksi selektif dapat terjadi pada KCKT karena
pengaruh yang besar dari fase diam dan fase geraknya.
c) Sensitivitas detektor :: detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat. Detektor-
detektor fluoresensi dan elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12
gram).
d) kolom dapat digunakan kembali :: berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom
KCKT dapat digunakan kembali. Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang
sama sehingga satu kolom dapat digunakan berulang kali untuk berbagai jenis sampel.
e) Ideal untuk zat termolabil dan volatilitas rendah :: zat-zat yang tidak bisa dianalisis dengan
KG karena terurai oleh suhu tinggi atau volatilitasnya rendah dan dapat dianalisis secara
KCKT.
f) Mekanisme pemisahan lebih variatif :: banyaknya pilihan fase gerak dan fase diam yang
digunakan serta besarnya interaksi analit terhadap fase diam dan fase gerak memungkinkan
terjadinya pemisahan dengan berbagai mekanisme.
g) Mudah rekoveri sampel :: umumnya detektor yang digunakan dalam KCKT tidak
menyebabkan kerusakan pada komponen sampel yang diperiksa, sehingga komponen sampel
tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detektor.
Namun, jika dibandingkan dengan kromatografi lapis tipis kinerja tinggi, KCKT memiliki
beberapa kelemahan, yaitu :
1. Tidak dapat menganalisis lebih dari satu jenis sampel sekaligus
2. Kromatogram tidak dapat disimpan sebagai dokumen otentik
Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan suatu metode pemisahan canggih dalam
analisis farmasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemurnian dan penetapan
kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap dan
tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan metode KG. Banyak senyawa
yang dapat dianalisis dengan KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa
organik makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat/bahan obat campuran rasemis
optis aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral yang mampu menetukan rasemis dan
isomer aktif.
Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat mahal,
namun metode ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277 obat / bahan obat karena
hasil analisis yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi dalam waktu analisis yang cepat.
Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:
1. Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen biologis
2. Analisis ketidakmurnian (impurities)
3. Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)
4. Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion
5. Isolasi dan pemurnian senyawa
6. Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip
7. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)
Fase Gerak
Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut.
Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju
detector, fase gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fase gerak dalam
HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.
1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis.
2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat
mengganggu interpretasi kromatografi.
3. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.
4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.
5. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).
6. Sesuai dengan detector.
a) HPLC fase normal: HPLC dengan kombinasi antara fase diam polar dan fase gerak non-
polar. Fase diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol yang dilapiskan
pada partikel silica. Sedangkan fase gerak yang digunakan adalah heksana atau i-propileter.
b) HPLC fase terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fase diam non-polar dan fase gerak
polar. Fase gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril.
Fase gerak yang baik memberikan factor kapasitas k pada rentang yang sesuai. Untuk
cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan fase gerak yang memberikan k
antara 2-5
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat
sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang
umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa
yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa
yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin
proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas
dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan
pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang
konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:
a) Pompa reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan
piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak langsung
dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk,
sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang
telah berada di ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.
b) Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong
yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak
bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.
c) Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan
bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan
(<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan takanan balik kolom.
3. Tempat Injeksi
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang
minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom
secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai
sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 500 L).
Fase Diam
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi,
silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan
silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat
dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-
reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus
fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan
karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang,
maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang
polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika
yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang
bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.
5. Detektor
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal
(yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif)
seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang
spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-
Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
a. mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;
b. mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang
sangat kecil;
c. stabil dalam pengopersiannya;
d. mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita;
e. signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang
luas (kisaran dinamis linier);
f. tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Karakteristik detector HPLC:
Injeksi sampel
Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana
mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak
sama halnya dengan kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya).
Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor
disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel
diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa
itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk
beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada
ukuran partikel)
Komposisi yang tepat dari pelarut
Temperatur pada kolom
Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika anda menggunakan waktu
retensi sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa.
Detektor
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode
umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.
Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang
gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan
sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung
berapa besar sinar yang diserap.
Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati
melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak
mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan
menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.
Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada
gelombang dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut,
anda sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk
mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.
Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan
area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian
yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).
Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi
akan sama. Misalnya,
1. Parasetamol:
Nama Kimia : 4- Hidroksiasetanilida
Rumus Molekul : C8H9NO2
Berat Molekul : 151,16
Pemerian : serbuk, putih, tidak berbau, rasa sedikit pahit.
Kelarutan : larut dalam air mendidih dan dalam natrium hidroksida 1 N, mudah
larut dalam etanol. (Depkes RI, 1995).
Parasetamol atau N-asetil-p-aminofenol atau asetaminofen merupakan derivat para-
amino fenol yang berkhasiat sebagai analgesik-antipiretik. Asetaminofen merupakan
pengganti yang baik untuk analgesik dan antipiretik aspirin pada penderita dengan keluhan
saluran cerna dan pada mereka dengan perpanjangan waktu perdarahan yang tidak
menguntungkan. Asetaminofen merupakan analgetik dan antipiretis.
Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang
dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini
memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan
fasa gerak polar seperti methanol/ air. Parasetamol diabsorbsi cepat dan sempurna melalui
saluran cerna. Konsentrasi tertinggi plasma dicapai dalam waktu jam dan masa paruh
plasma antara 1-3 jam. Obat ini tersebar ke seluruh tubuh. Dalam plasma, 25% parasetamol
terikat protein plasma. Parasetamol digunakan sebagai analgesic dan antipiretik.
Pengujian kadar parasetamol dalam obat menggunakan teknik HPLC , dalam proses
analisisnya HPLC memiliki beberapa tahapan. Diawali dengan menginjeksikan sampel uji
yaitu larutan obat yang sebelumnya telah disaring dengan membran PTFE ke dalam kolom
HPLC dengan injektor khusus / syringe yang bervolume 20 L, penyaringan sebelum
penginjeksian ini dilakukan agar tidak terjadi penyumbatan didalam kolom dan
menghilangkan gas dari pelarutnya. Sampel didorong cepat saat melalui kolom dengan
bantuan pompa bertekanan tinggi. Di dalam kolom, komponen- komponen pada sampel
dipisahkan berdasarkan pada perbedaan kekuatan interaksi solut terhadap fasa diamnya. Solut
yang interaksinya kurang kuat akan keluar lebih lambat dari kolom daripada solut lainnya.
Komponen akan keluar dari kolom dengan kecepatan yang berbeda dan terdeteksi oleh
detektor. Detektor yang digunakan adalah detektor UV karena parasetamol merupakan
senyawa organik yang dapat menyerap sinar UV. Pengujian ini menggunakan panjang
gelombang 243 nm dengan mempertimbangkan panjang gelombang methanol yaitu 205 nm
dan air yaitu 190 nm. Teknik yang dilakukan kali ini merupakan reverse phase atau fasa
terbalik karena teknik ini menggunakan pelarut polar sebagai fasa gerak sedangkan fasa
diamnya menggunakan pelarut non- polar. Penggunaan fasa gerak dan fasa diam yang
berbeda kepolarannya ini bertujuan agar sampel uji tidak bereaksi dengan fasa diamnya saat
melewati kolom HPLC. Sampel melewati kolom HPLC tentunya memiliki jangka waktu
yang terukur dan juga menjadi parameter, waktu yang dibutuhkan sampel untuk melewati
kolom ini disebut waktu retensi. Dalam pengujian parasetamol dalam obat, waktu retensi
yang terukur adalah antara 2,19 hingga 2,2. Selanjutnya hasil analisis dengan HPLC ini
menghasilkan suatu citra berupa kromatogram. Kromatogram ini merupakan grafik antara
intensitas komponen yang dibawa oleh fasa gerak terhadap waktu retensi. Seharusnya
tampilan kromatogram ini berupa grafik lurus, lancip, dan simetris. Tetapi data yang
diperoleh pada percobaan ini sedikit melebar dan tidak simetris tentunya. Ini disebabkan
antara lain oleh adanya difusi didalam kolom HPLC, difusi yang terjadi adalah difusi
longitudinal dan difusi transfer massa. Difusi longitudinal itu sendiri disebabkan oleh
penyebaran komponen yang tidak sama sedangkan difusi transfer massa disebabkan oleh
kecepatan komponen yang tidak merata. Terdapat beberapa parameter pemisahan dalam
HPLC, yaitu laju alir eluen yaitu sebesar 0,5 mL/ menit, ketebalan stasioner kolom C-18
yaitu 15 cm, ukuran partikel analit, dan laju difusi yang sudah disebutkan diatas. Parameter-
parameter ini dapat menyebabkan kejanggalan dalam pencitraan kromatogram seperti
pelebaran pada puncak. Adanya pelebaran puncak pada kromatogram mengindikasikan
terjadinya overlapping analit yang belum terpisahkan dalam kolom. Semakin tinggi laju
difusinya maka komponen dalam sampel akan semakin sulit dipisahkan secara efisien. Dari
grafik luas area terhadap konsentrasi (ppm) dapat dihitung kadar parasetamol dalam sampel
obat. Data yang diperoleh menunjukkan bahwa dari sampel obat sebanyak 12,5 mg diperoleh
kadar parasetamol sebesar 83,444 % sedangkan dari massa rata-rata tablet obat sebesar 738,2
mg diperoleh massa parasetamol pada tiap tablet obat sebesar 615,9836 mg. Dapat
disimpulkan bahwa kadar parasetamol dalam tablet obat adalah sebesar 615,98 mg per
tabletnya.
2. Kafein
Rumus struktur :
Nama Kimia : 1,3,7-Trimetil xantin
Rumus Molekul : C8H10N4O2
Berat Molekul : 194,19
Pemerian : serbuk putih atau bentuk jarum mengkilat putih, biasanya
menggumpal, tidak berbau, rasa pahit.
Kelarutan : Agak sukar larut dalam air, dalam etanol, mudah larut dalam
kloroform, sukar larut dalam eter. (Depkes RI, 1995).
Dalam penetapan kandungan kafein digunakan sampel berupa minuman berkafein.
HPLC yang digunakan adalh jenis HPLC Series 200 dengan detector 275 nm Perkin Elmer,
Kolom : Supelcosil LC : 18, ( 25 cm X 4,6mm, 5 m ). Menggunakan asam asetat 70% dan
methanol 30% sebagai fasa gerak. Proses pengerjaan terdiri dari 2 tahap, yaitu tahap
preparasi dan tahap injection ke HPLC.
ANALISIS KUANTITATIF
Metoda Persentase Tinggi / Lebar Puncak
Metoda ini disebut juga Metoda Normalisasi Internal. Untuk analisis kuantitatif
diasumsikan bahwa lebar atau tinggi Puncak (Peak) sebanding (proportional) dengan kadar /
konsentrasi zat yang menghasil puncak. Dalam metoda yang paling sederhana diukur lebar
atau tinggi Puncak, yang kemudian dinormalisasi (ini berarti bahwa setiap lebar atau tinggi
Puncak diekspresikan sebagai suatu persentase dari total). Hasil normalisasi dari lebar atau
tinggi puncak memberikan komposisi dari campuran yang dianalisis, seperti contoh pada
Tabel berikut:
Peak area
No
Kafein standar Kafein dalam sampel
1 2601417,40 2216635,31
Berdasarkan data table diatas, maka kadar kafein dalam sampel ( teh poci ) dapat dianalisis
dengan mengunakan persamaan :
Cx = Ax / Ap X Cp
= x 200 ppm
= 170,42 ppm
Maka dalam 1 mL sampel yang diuji terdapat 0,17042 mg kafein.
Ada dua masalah dengan pendekatan ini, yaitu:
Kita harus yakin bahwa kita telah menghitung semua komponen, yang tiap-tiap
komponen muncul sebagai suatu puncak yang terpisah pada kromatogram. Komponen-
komponen dapat berkoelusi, atau ditahan di dalam kolom, atau, terelusi tanpa terdeteksi. Kita
harus mengasumsi bahwa kita memperoleh respons detektor yang sama untuk setiap
komponen
Untuk mengatasi kesulitan ini, maka kalibrasi detektor diperlukan.
Kafein berkhasiat menstimulasi SSP, dengan efek menghilangkan rasa letih, lapar dan
mengantuk, juga daya konsentrasi dan kecepatan reaksi dipertinggi, prestasi otak dan suasana
jiwa diperbaiki. Kofein juga memperkuat kontraksi jantung, vasodilatasi perifer dan diuretis.
Kofein digunakan sebagai penyegar. Zat ini sering dikombinasikan dengan Parasetamol atau
asetosal untuk memperkuat efek analgetisnya.
Kafein dosis sedang menyebabkan insomnia, ansietas dan agitasi. Dosis tinggi
diperlukan untuk memperlihatkan toksisitas berupa muntah dan konvulsi. Dosis letal sekitar
10 g (kira-kira 100 cangkir kopi) yang menimbulkan aritmia jantung. Kematian karena kafein
sangat tidak mungkin. Letargi, iritabel dan sakit kepala terjadi pada pengguna yang secara
rutin minumg lebih dari 600 mg kopi per hari ( sekitar 6 cangkir kopi per hari) dan mendadak
berhenti. (Mycek, 2001).
Preparasi Sampel
Sampel harus dalam bentuk larutan
Untuk skala analisis sampel dalam mikroL , konsentrasi sampel yang diinjeksikan tidak
boleh terlalu pekat karena dapat menyumbat kolom.
Konsentrasi maksimal adalah 40 ppm.
Preaparasi Fase Gerak
Fase Gerak ( eluen ) yang digunakan harus dalam kualitas p.a ataupun grade HPLC. Untuk
air digunakan akuabidest.
Sebelum digunakan, eluen harus disaring dengan milipore kemudian diawagaskan ( di digest
) dengan sonikator sekitar 30 menit untuk menghilangkan udara terlarut.
Eluen harus dimasukkan ke dalam tabung eluen sebelum alat dinyalakan untuk menghindari
adanya gelembung pada selang penghubung.
Tabung eluen yang diisi harus diberi label sesuai dengan eluen yang di gunakan.
BAB III
PENUTUP
Kesimpulan
a. Komponen utama dari HPLC yaitu, pompa, injector, elusi gradient, kolom, detector,
pengolahan data.
b. Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan
senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase
stasioner (diam). HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif
pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam
sediaan farmasi. Contohnya adalah menganalisis parasetamol dan kafein dalam suatu
campuran.
c. HPLC sebagai suatu metode pemisahan memiliki beberapa keuntungan yaitu menghasilkan
pemisahan yang sangat cepat, dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun
tak tahan panas, banyak pilihan fasa geraknya, mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan,
karena detector pada KCKT tidak merusak komponen zat yang dianalisis, dan dapat
dirangkai dengan instrumen lain untuk meningkatkan efisiensi pemisahan. Sedangkan
kekurangannya adalah larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu, hanya bisa
digunakan untuk asam organic, harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut,
analit, dan gradient elusi, harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian
yang terbatas
DAFTAR PUSTAKA
Ahmad, M., dan Suherman 1995. Analisis Instrumental. Airlangga University Press.
Surabaya.
Ahmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Airlangga University
Press. Surabaya.
Bahti. 1998. Teknik Pemisahan Kimia dan Fisika. Universitas Padjajaran. Bandung.
Bassett, J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham, 1994, Kimia Analisis Kuantitatif
Anorganik, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.
Day, R.A dan Underwood, A.L., 2002, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga, Jakarta.
Khopkar, S.M., 2008, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta.
Putra,Effendy D. L., 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi.
Jurusan Farmasi Fakultas Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara :3
Sudjadi, 1986. Metode Pemisahan. Kanisius. Yogyakarta
http://ruangdiskusiapoteker.blogspot.co.id/2012/06/kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html
http://lansida.blogspot.co.id/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html
http://paramita-kromatografi.blogspot.co.id/2012/12/kromatografi-cair-kinerja-tinggi-
kckt_6.html
Posted by Rima Nafiah at 09:02
Email ThisBlogThis!Share to TwitterShare to FacebookShare to Pinterest
No comments:
Post a Comment
Newer PostOlder PostHome
Rima Nafiah
Saya siswa SMK N 1 TEMANGGUNG, Angkatan 40 Jurusan Kimia Analis
View my complete profile
Blog Archive
2017 (4)
2016 (12)
o November (4)
o October (8)
Gravimetri : Analisa Kadar Ca
Makalah Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC)
Pengukuran Potensial sel secara tidak langsung
makalah pembuatan biodiesel dari minyak jelantah
Makalah Pembuatan ZPA dan analisanya dengan spektr...
makalah analisa Cl
jobsheet analisa roti tawar
Analisa Mineral Alam Sulfur
Simple theme. Theme images by enjoynz. Powered by Blogger.