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Electroforesis SDS-PAGE

1. Objetivo
Identificar/cuantificar protenas, conforme a su peso molecular, de diferentes muestras

2. Materiales y Equipo
Adems del listado de materiales a continuacin, verificar los reactivos para preparar las soluciones
requeridas.

dH2O Cristales espaciadores y peines (1.5


HCl concentrado mm)
SDS al 10% Tubos falcon (15mL 50mL)
Acrilamida 30% Bloque de calor
TEMED Micropipetas y puntas
Persulfato de Amono (PSA) al 10% Cmara de electroforesis y fuente de
Base y pinzas para cristales poder
Fotodocumentador

3. Notas y recomendaciones
Utilizar guantes para el manejo de las muestras, reactivos y en general durante todo el
procedimiento.
Si ya cuenta con alguna(s) de las soluciones descritas, verificar que no tengan particulas y/o
crecimiento.
La tincin con plata puede llevarse a cabo despus de una tincin previa con azul de coomassie. Sin
embargo, se recomienda previamente desteir lo ms que se pueda el gel.

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4. Metodologa
Preparar las soluciones requeridas. A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones son en dH2O:

Tabla 1 Listado de buffers necesarios para realizar el gel y la corrida de electroforesis

Buffer Reactivo Concentracin pH Observaciones Etapa de uso


Tris base 0.5M Preparacin de gel
Concentrador 6.8
SDS 10% 4% (v/v) Preparacin de gel
Tris base 1.5M Preparacin de gel
Separador 8.8
SDS 10% 4% (v/v) Preparacin de gel
Buffer
12% (v/v) -
separador
SDS 10% 20% (v/v) -
Glicerol 10% (v/v) - Se puede utilizar buffer
Buffer de
Azul de comercial y solo agregar el - Electroforesis
muestra 2x mercaptoetanol
bromofenol 5% (v/v) -
0.5%
-
5% (v/v) -
mercaptoetanol
Tris base 30 g/L Para correr el gel se debe
Glicina 144 g/L 8.3 utilizar una solucin 1x.
Buffer de
SDS 10 g/L Ejemplo: 100mL de solucin Electroforesis
corrida 10x 0.2 10x + 900mL de dH2O = 1L de
dH2O 1L
solucin 1x
Azul de
2.5 mg/mL -
Coomassie La concentracin est
Sol. de tincin Etanol/dH2O expresada entre el volumen
(1:1)
90% (v/v) -
de la solucin de agua +
Tincin (Coomassie)
(Coomassie)
Ac. Actico etanol
10% (v/v) -
glacial
Etanol 50% (v/v) -
Sol. de
Ac. Actico - Tincin (Coomassie)
desteido 1 glacial
10% (v/v) -

Metanol 7% (v/v)
Sol. de
Ac. Actico
desteido 2 glacial
5% (v/v)

Etanol 50% (v/v) -


Sol. de
Ac. Actico - Tincin (Plata)
fijacin glacial
5% (v/v) -

Etanol 30% (v/v) -


Acetato de
Sol. de 7% (p/v) -
sodio - Tincin (Plata)
sensibilizacin
Tiosulfato de
1.27mM -
sodio
Sol. de teido
Nitrato de plata 0.1% (p/v) - - Tincin (Plata)
(Plata)
Carbonato de
2% (p/v) -
Sol. de sodio
- Tincin (Plata)
revelado Formaldehdo
0.04% (v/v) -
35%
Sol. de
EDTA 1.5% (p/v) - - Tincin (Plata)
finalizacin

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a) Preparacin de geles de poliacrilamida:
1. Verificar que los cristales espaciadores se encuentren limpios. De ser necesario limpiar con etanol al
70%
2. Montar los cristales en su marco y a su vez en la base.
3. Sealar el nivel del gel separador (ayudndose de un marcador) a un 1cm de distancia del peine
aproximadamente.
4. Preparar el gel separador en un tubo falcon de 50 mL. Adicionar los reactivos en el orden sealado
ya que el PSA (recin hecho de preferencia) y el TEMED inician la polimerizacin.

Tabla 2 Cantidades de reactivos para geles separadores al 12.5%.

Reactivo 1 gel 2 geles


dH2O 2.5mL 5.0mL
Acrilamida 30% 3.0mL 6.0mL
Buffer separador 1.9mL 3.8mL
PSA 10% 112L 224L
TEMED 5L 10L

5. Mezclar manualmente los reactivos en el tubo falcon y adicionar a los cristales espaciadores hasta el
nivel previamente marcado.
6. Agregar etanol al 70% encima del gel separador hasta el nivel de los cristales.
7. Utilizar la solucin restante del tubo falcon como control para determinar cuando el gel haya
polimerizado
8. Retirar el alcohol con ayuda de una sanita tocando lo menos posible el gel.
9. Preparar el gel concentrador, en un tubo falcon de 15mL. Adicionar los reactivos en el orden sealado
ya que el PSA (recin hecho de preferencia) y el TEMED inician la polimerizacin.

Tabla 3 Cantidades de reactivos para geles concentradores al 12.5%.

Reactivo 1 gel 2 geles


dH2O 2.0mL 4.0mL
Acrilamida 30% 600L 1.2mL
Buffer concentrador 888L 1.776mL
PSA 10% 56L 112L
TEMED 5L 10L

10. Mezclar manualmente los reactivos en el tubo falcon y adicionar a los cristales espaciadores hasta
llenar casi por completo.
11. Colocar el peine y esperar a que el gel polimerice.
Nota: Si el gel no se va a correr inmediatamente, colocarlo dentro de una bolsa de plstico con
algodn humedecido con dH2O y refrigerar.

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b) Corrida de geles:
1. Colocar el gel en los marcos y a su vez en la cmara de electroforesis. En caso de correr un nmero
impar de geles colocar un dummie en el espacio vaco.
2. Adicionar buffer de corrida (1x) a la cmara interior (formada por los dos geles), verificar que no haya
fugas y continuar hasta que se desborde y llene la cmara exterior hasta el nivel correspondiente.
3. Preparar las muestras y el marcador de peso molecular (solo en caso de que as lo requiera) en tubos
eppendorf. Para las muestras usar un volumen de 30L (15L de buffer de muestra y 15L de
muestra), para el marcador leer las especificaciones del proveedor.
Nota: La proporcin volumtrica de las muestras puede cambiar dependiendo de la cantidad de
protena a cargar
4. Colocar los tubos en un bloque de calentamiento a ~100C durante 5-10 minutos. Leer la
especificacin del proveedor para determinar si el marcador de peso molecular tambin requiere
tratamiento trmico.
Nota: Permitir que los tubos se enfren previo a la carga en el gel
5. Retirar el peine del gel y cargar 20L de cada una de las muestras con una micropipeta. Verificar la
especificacin del marcador para determinar el volumen a cargar en el gel.
Nota: El volumen de carga depender de la cantidad de protena, as como la capacidad de los pozos.
ste protocolo es especfico para geles de 1.5mm.
6. Cerrar la cmara de electroforesis y conectar a la fuente de poder. Correr el gel a 90V en el gel
separador y cambiar a 110V en el gel concentrador durante ~2h.

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c) Tincin (Azul de Coomassie):
1. Al final de la electroforesis detener la fuente de poder, desconectarla, abrir la cmara de
electroforesis y recolectar el gel.
2. Vaciar solucin de tincin (lo suficiente para cubrir el o los geles) en un contenedor con tapa.
3. Enjuagar con dH2O los geles y separar los cristales con ayuda de la esptula.
4. Remover el gel concentrador, recuperar el gel separador y colocarlo en el contenedor con solucin
de tincin.
5. Mantener el gel en la solucin durante al menos 1 hora, a temperatura ambiente y con agitacin.
Nota: Se recomienda dejar toda la noche
6. Pasar el gel a otro contenedor limpio, adicionar solucin de destincin 1 y mantener en agitacin
durante al menos 1 hora.
7. Posteriormente cambiar el gel a la solucin de destincin 2, mantener en agitacin y hacer recambio
cuando haya saturacin.
Nota: Los residuos de las soluciones deben ser colectados y colocados en el contenedor
correspondiente. NO DESECHAR A LA TARJA
8. Utilizar el fotodocumentador para tomar imagen del gel.

d) Tincin (Plata):
1. Al final de la electroforesis detener la fuente de poder, desconectarla, abrir la cmara de
electroforesis y recolectar el o los geles como se especific anteriormente.
Nota: Este proceso puede llevarse a cabo despus de tincin con azul de comassie.
2. El gel debe hacerse pasar por las siguientes soluciones, con agitacin y siguiendo el orden y los
tiempos especificados:

Tabla 4 Soluciones y tiempos para tincin con nitrato de plata.

Solucin Tiempo
Fijacin 15 minutos
Sensibilizacin 30 minutos
Lavados 3 lavados de 5 minutos con dH2O
Teido 20 minutos
Lavados 2 lavados de 1 minutos con dH2O
De 20 a 30 segundos hasta que la solucin se ponga
Revelado amarilla. Hacer cambio por solucin fresca hasta
obtener la tincin deseada
Finalizacin 10 minutos
Lavados 3 lavados de 5 minutos con dH2O

3. Finalmente utilizar el fotodocumentador para tomar imagen del gel.

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Referencias
Yan, J. X. (2000). A modified silver staining protocol for visualization of proteins compatible with matrix
assisted laser desorption/ionization and electrospray ionizationmass spectrometry.
Electrophoresis, 3666-3672.