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Anlisis de Paternidad Usando Cibertorio

Arboleda Franco1; Cabrera Juan1; Pillajo Jssica1



1Escuela Politcnica Nacional, Facultad de Ingeniera Qumica y Agroindustria, Quito,

Ecuador

Resumen: El objetivo de la presente prctica fue determinar la paternidad de 4 postulantes, utilizando el mtodo de
electroforesis virtual. Este ensayo se basa en el anlisis de marcadores polimrficos realizando una amplificacin
por PCR (reaccin de cadena polimerasa) y separar estos fragmentos amplificados por electroforesis. Realizada la
separacin, se compar los patrones de banda del hijo, la madre y los 4 postulantes (posibles padres). La banda que
ms se asemej a la del hijo fue la del segundo candidato. El segundo postulante es el padre.

Palabras clave: Electroforesis virtual, PCR, anlisis paternidad, marcadores polimrficos.

Paternity test using Cibertorio


Abstract: The objective of the present practice was to determine the paternity of 4 postulants, using the virtual
electrophoresis method. This assay is based on the analysis of polymorphic markers by performing PCR
amplification (polymerase chain reaction) and separating these amplified fragments by electrophoresis. After
separation, the band patterns of the child, the mother and the 4 candidates (potential parents) were compared. The
band that most resembled that of the son was that of the second candidate. The second postulant is the father of the
child.

Keywords: Virtual electrophoresis, PCR, paternity test, polymorphic markers.

puentes de hidrgeno y as las bases complementarias


1 1. INTRODUCCIN son separadas.
- Hibridacin: Se baja la temperatura de reaccin a 50-
La reaccin en cadena de la polimerasa cuyas iniciales en 70C, de forma que pequeas secuencias de DNA de
ingls son PCR fue desarrollada por el Doctor Kary Mullis en cadena sencilla se unan a secuencias complementarias
el ao de 1993, la PCR es una tcnica que reproduce in vitro del ADN diana.
y en pocas horas el proceso de amplificacin del ADN, - Sntesis de ADN: tpicamente a 70-75 o C, comienza a
multiplicando de forma exponencial una secuencia de ADN funcionar la replicacin incorporando nucletidos sobre
a partir de cantidades pequeas de muestra, que son los primers y haciendo una copia completa y exacta de la
segmentos de la cadena. Sus requerimientos son que existan cadena molde. (Greif, 2012)
nucletidos en el medio que son la materia base para fabricar Estas tres etapas conforman un ciclo, el mismo que puede
el ADN (adenina, timina, citosina y guanina), y una pequea repetirse varias veces y as obtener millones de copias del
cadena de ADN que pueda unirse a la molcula que fragmento de inters.
queremos copiar para que sirva como cebadora. (UNED,
2000) Las tres etapas de la amplificacin de AND por PCR se
muestran en la Figura 1, presentada a continuacin:
Se divide en tres etapas, las cuales estn en dependencia
directa con la temperatura:
- Desnaturalizacin: El ADN de doble cadena es
desnaturalizado comnmente calentando la muestra a
94C por un tiempo aproximado de 30 segundos, con
esto se logra que las cadenas se separen al romperse los

jessica.pillajo@epn.edu.ec
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3. RESULTADOS Y DISCUSIN

Figura 1. Reaccin en cadena de la Polimerasa. (Duoc, 2014)

La amplificacin por PCR es una tcnica ampliamente usada


en la ingeniera gentica, entre sus aplicaciones se
encuentran:
- Diagnstico, pronstico y tratamiento de enfermedades Figura 1. Anlisis electrofortico de 4 muestras diferentes de
oncolgicas. (Sanz, 2013) ADN amplifacados por PCR.
- Biotecnologa y ciencias agropecuarias
- Secuenciacin de ADN En la Figura 1 se puede identificar que los 4 marcadores STR
- Estudiar la evolucin de las secuencias de un gen y los amplificados se encuentran divididos mediante el uso de un
efectos de variabilidad de la secuencia en la funcin del anlisis electrofortico, esta divisin se da debido a que la
cromosoma. amplificacin del ADN provoca la adicin de nucletidos
- Diagnstico prenatal, entre otras. (Cortzar y Silva, libre a las hebras de estos, esto depende del tipo de cadena
2004) nucleotdica que presente cada muestra. De esta manera se
puede determinar, de acuerdo a una comparacin en la
Otra forma de analizar la paternidad es la determinacin del separacin del ADN amplificado del hijo y de los 4 posibles
grupo sanguneo que se realiza segn la presencia o ausencia padres, cual es el candidato que presenta mayor probabilidad
de protenas A, B o factores Rh presentes en los glbulos rojos, de ser el padre.
esta prueba permite asegurar cuando una persona no es el padre,
sin embargo no prueba cuando lo es. (Bravo, 2009) En la Figura 1 se puede apreciar 6 columnas separadas de las
muestras de ADN, la primera columna pertenece al ADN
materno, la segunda columna pertenece al ADN del hijo, la
2. METODOLOGA tercera, cuarta, quinta y sexta columna pertenecen a los 4
posibles padres. Al comparar la columna del hijo con la
Se ingres a la direccin indicada en la gua de laboratorio columna tercera, cuarta, quinta y sexta, se ha logrado
http: //biomodel.uah.es/lab/cibertorio/start.htm, se inici el confirmar que se da un mayor nmero de coincidencias con
Cibertorio y se realiz el pedido de muestras para ensayo de la columna perteneciente al segundo candidato, el cual es el
paternidad el cual contena: el ADN de un hijo (H), ADN de padre.
la madre (M), ADN de cuatro posibles padres (P1, P2, P3,
P4), cebadores de PCR (D3, D8, D18, D21), reactivo (PCR Otros tipos de anlisis de paternidad:
mix). Una vez que se hizo la compra, en el laboratorio de PCR anidada
reacciones se tom la micropipeta, se tom 20L de la Tcnica en la que el producto de una amplificacin es
muestra de H y se coloc en un tubo y se repiti el proceso utilizado como molde para realizar una segunda
con las muestras M, P1, P2, P3 y P4 en diferentes tubos. Paso amplificacin con cebadores que se ubican dentro de la
seguido en cada uno de los tubo se coloc 5L de la muestra primera secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el
PCR mix, luego en cada tubo se coloc 1 L de cada uno de primer amplicn se pueden unir los cebadores y se hace de
los cuatro cebadores D3, D8, D18, D21, enseguida se agreg nuevo una amplificacin dentro del amplicn inicial.
21L de agua en cada uno de los tubos. Finalmente se
incubaron las muestras. PCR in situ
La PCR in situ consiste en una reaccin de PCR en secciones
Se ingres al laboratorio de Electroforesis, se seleccionaron histolgicas o clulas, donde los productos generados pueden
los siguientes parmetros: autocarga de la muestra, gel de visualizarse en el sitio de amplificacin. Es realizada sobre
poliacrilamida 5% , si fij el tiempo en 1hora 10 minutos y preparaciones fijas en un portaobjetos. En la tcnica de PCR
el voltaje en 300 voltios, se apag la luz y se encendi la luz in situ se realiza una primera amplificacin de ADN blanco y
UV y se procedi a realizar la separacin. Se observ que las luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional
bandas se separaron a lo largo del gel. con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse
cantidades pequesimas de genoma.
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id=153e8941-e2ee-4032-9b68-
PCR mltiple b0408ff3ed67&groupId=10157. (Agosto, 2017)
PCR en la cual se amplifica simultneamente ms de una
secuencia. Para ello, se combinan dos o ms pares de [6] UNED. (2000). Reaccin en cadena de la
cebadores en un mismo tubo, junto con el resto de los polimerasa. Obtenido de: http://cosmolinux.no-
reactivos de la reaccin en cantidades suficientes, para ip.org/uned/pcr.pdf (Agosto, 2017)
amplificar simultneamente varios segmentos de ADN.

RT-PCR
Dado que el ARN usualmente es de una sola hebra y es
sensible al calor, es necesario hacer una transcripcin reversa
(RT) antes de iniciar la amplificacin por PCR. La
transcripcin reversa genera una copia de la hebra de ARN,
pero esta copia es ADN complementario (ADNc o DNAc en
ingls) el cual es estable al calor y puede resistir la
metodologa PCR.

PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR)


Reaccin de PCR cuya principal caracterstica es que permite
cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la
muestra original, o para identificar con una muy alta
probabilidad, muestras de ADN especficas a partir de su
temperatura de fusin (tambin denominado valor Tm, del
ingls melting temperature).
A diferencia de la PCR convencional (en punto final), que
mide la acumulacin del ADN al final de un nmero
predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el
proceso de amplificacin usando fluorescencia, de forma que
su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada.
(Glick y Pastermark, 2003, pp. 78-82)

4. CONCLUSIONES

REFERENCIAS

[1] Bravo, M. (2009). La verdad gentica de la


paternidad. Colombia: Universidad de Antioquia.

[2] Cortzar, A. & Silva, E. (2005). Mtodos Fsico-


Qumicos en Biotecnologa. Obtenido de:
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/pcr.pdf
(Agosto, 2017)

[3] Duoc, U. (2014). Hongos en PCR. Obtenido de:


https://es.slideshare.net/Arratiaa/hongos-en-pcr
(Agosto, 2017)

[4] Greif, G. (2012). PCR: Reaccin en cadena de la


polimerasa. Obtenido de:
http://www.chlaep.org.uy/descargas/curso_tb_mico_
bacterias/reaccion_en_cadena_polimerasa.pdf
(Agosto, 2017)

[5] Sanz, J. (2013). Tcnicas de amplificacin.


Fundamento terico. PCR. Obtenido de:
https://www.seap.es/c/document_library/get_file?uu