TEMA 8: INGENIERA GENTICA Y MICROORGANISMOS

TRANSGNICOS.

Ingeniera gentica: conjunto de mtodos para es traer dan de una clula, manipularlo in vitro
e introducirlo y expresarlo en otra clula, generalmente de una especie diferente.

Desarrollo de cepas
-Incrementar la produccion: regulacin, permeabilidad, resistencia.
- Propiedades fermentativas mejoradas: sin pigmentos, necesidades reducidas de oxgeno, menor
produccin de espuma, capacidad de crecer en sustratos baratos, etc...
- Productos finales nicos: en metabolitos secundarios.

Etapas en la clonacin de genes.

1.- Obtencin y modificacin del gen de inters.
2.- Eleccin del vector. El vector es una molcula de ADN que hemos construido nosotros
modificando distintos fragmentos naturales de ADN y nos permite que el gen primero que he
localizado que es el que lleva el con tenido de informacin que yo quiero, ese lo puedo introducir
dentro del na clula y que all permanezca estable. El vector es el vehculo, el que hace que este
gen permanezca estable.
3.- Recombinacin. Cundo y o tengo el gen de inters y el vector tengo que unirlos en una sola
molcula. Cortar y pegar fragmentos de ADN.
4.- Introduccin del DNA recombinante.
5.- Deteccin del gen. Detectar que clulas tienen el gen que me interesa. Fase esencial, me
permite limpiar de las clulas que no Me interesan.
6.- Propagacin de la clula.

1.- OBTENCIN Y MODIFICACIN DEL GEN DE

INTERS.
Localizamos primero la fuente, que clulas tienen el gen
que yo quiero clonar. Hay que integrar el gen en una
composicin gnica, en ambos extremos de ese gen de
inters tiene que tener un promotor que permita que la
ARN polimerasa haga la transferencia correcta, y tiene
que tener una secuencia al final que controle hasta donde se hace esa copia.
Para hacer ms sencillo en el laboratorio el reconocimiento de los recombinantes le pongo un
marcador (gen que se exprese que sea fcil de detectar, que nos permita la seleccin de forma
rpida)

- A.1 - Aislar y modificar el gen deseado.

Mtodos de aislamiento:
Directo:
Localizo la clula que queremos, aslo el ADN completo y lo rompo mediante
endonuclesas de restriccion. Cada fragmento lo clono en un vector y lo introduzco en una
clula compatible.
Al final lo que obtendr es una genoteca, que en conjunto va a contener todo el genoma
de la clula. De todas las clulas que contienen plasmidos con fragmentos del genoma
donador, slo una tiene el gen que me interesa. Como las endonucleasas de restriccin
cortan al azar, lo ms probable es que en ese fragmento est
el gen que me interesa entre otras muchas cosas, por lo que
las debo eliminar.

Fuente del DNA Obtencin directa:

Ventaja: facilidad. Cualquier laboratorio lo puede hacer.
Inconvenientes: numerosos clones aislados (necesidad de
buenas tcnicas de seleccin), genes con intrnsecos no se
expresan bien en procariotas, la expresin depende del
reconocimiento correcto de los promotores de un organismo a
otro, la eleccin de codones puede no ser la correcta (aunque
todos los codones sean funcionales hay uno o dos que sino
preferentes, si el ADN procede de un ser humano, el codn
preferente que codifica para cada aminocido va a ser distinto
de lo que est preparado la maquinaria metablica , lo que la
enlentece), modificaciones para exportacin.

Retrotranscripcin:
Usamos una enzima sobre el RNAm que esta en el citoplasma y ya ha sido modificado, ya
hemos eliminado la secuencias no codificantes; este primer transcrito ya es completo, una
vez que sale del nucleo solo tenemos la secuencia modificada, flanqueado por el promotr y
 el terminador; al obtener este RNAmaduro solo tengo el
material genetico que codifica; solo nos interesa la
secuencia a traducir, que ya es universal para procariotas
y eucariotas.

Si este RNAm maduro lo pongo en contacto con la RT

(Del retrovirus) me produce el DNA, primero una cadena
y luego se ccopia a si misma y destruye el RNA; asi
obtenemos como una U, una cadena unica de DNA con
dos cadenas complementarias y una cadena sencilla, est
se rompe con una nucleasa de cadena sencilla.

Fuente del DNA Sntesis enzimatica:

Ventajas: si el RNAm es abundante, ser fcil obtener
el clon deseado. Los intrones no son problema.
Inconvenientes: el RNAm que queremos no es
abundante, es necesaria la seleccin. Los genes
clonados no tienen sistemas de expresin tenemos que
unirlos a un promotor (hoy en da no es un
inconveniente). La eleccin de codones puede ser incorrecta. Modificaciones post
traduccin.

PCR
La Reaccin en Cadena de la Polimerasa
(PCR) es una tcnica "in vitro" que imita la
habilidad natural de la clula de duplicar el
ADN.

Se trata de una tcnica usada para crear un

gran nmero de copias de un segmento de
ADN, que utiliza ciclos de desnaturalizacin,
apareamiento con cebadores y extensin por
una ADN polimerasa termoresistente.

Tcnica enzimatica tambien, en la que

necesitamos saber solo para conocer un gen
un primer (Secuencia de incio) y la secuencia
final

Se necesita una mezcla de reaccion que

contenga Taq polimerasa, cebadores o primers
(marcan que se va a seleccionar) y los nucleotidos trifosfato. El aparato usado es el
termociclador

Fuente del DNA Sntesis qumica:

Nos permite sintetizar un gen completo y adems nos permite cambiar lo que nos
interese cambiar. Inconveniente: es ms lento ms costoso, mas problemtico, poca
cantidad.
 Ventajas: nos e necesita seleccionar despus de clonar. Secuencias en promotores,
sitio de unin a ribosomas, etc. Pueden optimizarse. Los codones pueden elegirde de
acuerdo con la clula hospedadora.
Inconvenientes: necesidad de conocer la secuencia del gen. Dificultades, cada vez
menos, en la sntesis.

Un gen suele tener mil quinientos pares de bases.

- A.2 - Modificar el gen. Promotor.

El promotor es un elemento de DNA donde se ancla la DNApolimerasa

Promotores constitutivos; se expresan de forma continua, sin factres intrinsecos o ambientales

que los regulen; tienen que ver con el metabolismo primario; hay algunos con gran afinidad por la
DNApolimerasa, y as hay una alta expresin del gen; posible incoveniente: se expresan en todos
los tejidos (por ejemplo en las plantas transgenicas, nos interesa que algo se exprese en la raz o
el tallo, pero no en el fruto porque as pasa a otros organismos).

Promotores inducibles, solo se expresa durante un tiempo por el inductor. Existen en todos los
seres vivos (ej el del gen lactosa), el que se usa con mas frecuencia es el 35s, que es de un virus
mosaico de la coliflor

Promotores especficos de tejido o de rgano, solo se expresa el gen en el tejido, as se

elimina la presencia de la protena en los tejidos que no nos interesan. Muchos especficos de
semillas.

Ej: Se aisl el gen CRYIA y CRY9 del Bacillus thuringiensis que produce una proteina que es
toxina contra larvas de insectos (especialmente lepidopteros).

Se aislaron genes de resistencia a dos herbicidas, glifosato y glufosinato, producidos por bacetrias
del suelo (agrobacterium, Ochrobactrum...).

Una vez que tenan ambos genes se busco el promotor. El promotor 35S que induce la expresin
gnica en todas las clulas todo el tiempo (al ser constitutivo), se uni a los de B.thuringiensis, se
demostr que una protena aloctona poda provocar alergias; luego se cambio al promotor de la
fosfoenolpiruvato carboxilasa, es muy potente (ya q es la enzima mayoritaria d la fotosntesis),
adems es una enzima fotosinttica y solo se expresa en los tejidos que realizan la fotosntesis, la
hoja (donde actan los larvas de los insectos); los herbicidas eran de absorcin folial, por tanto
tambin nos interesa.

Los terminadores, hay que usar las secuencias que responden mejor, las q son especificas del
tejido donde quiero expresar el gen, aqu no hay tanta variedad, asique se elige la especifica y ya
est.

Gen marcador: se puede usar una protena fluorescente (inconveniente, me ayuda a detectar
pero no a seleccionar), asique se usa como gen marcador un gen de resistencia, as se cultivan
las clulas en una placa petri con el antibitico que confiere resistencia este gen arcador, siembro
los transformantes y las que no tienen el gen marcador morirn y me quedare con los que me
interesa; ya no se usa para no crear ms resistencias.
2.- ELECCIN DEL VECTOR
En la naturaleza no hay un vector de clonacin que tenga las caractersticas que necesitamos, por
ello lo creamos. Permite que entre el ADN en la clula y que el ADN que se ha construido se
mantenga estable y que se reproduzca de manera sincrnica con el material celular.

Si no existiera el vector, al dividirse de forma no sincrnica solo una clula Heredar el fragmento
de DNA introducido y al avanzar las generaciones, en la 4 ya estar tan diluido que lo he perdido.

Por ello el vector es autoreplicativo (replicn) as se replica a la vez que la clula y se hereda igual
que todos los genes que estn en el interior del cromosoma; todas las generaciones llevan su
material gentico y el introducido por el vector.

Los plsmidos actan como replicones, y no existen plsmidos naturales que nos sirvan como
vectores, luego se construyeron los vectores, cogiendo fragmentos de distintas partes de
plsmidos o de transposones para montar uno con las caractersticas interesantes, el primero
construido fue el pBR322, sus caractersticas:

- Tiene un origen de replicacin y tiene que ver con la clula que se quiere replicar (en este
caso es en E.coli que es con lo que se trabaja en ese momento), si quisiera que sirviera
para otro tipo de clulas cambiaria el origen de replicacin.

- Usaron dos fragmentos de DNA de otro plsmido para marcarle dos genes de resistencia
a AB (en aquel momento se usaba esto como marcador)

-Se necesitaba que dentro del gen de resistencia existiera secuencias especficas de corte
para endonucleasas de restriccin, para que al cortar con las endonucleasas se introduce
ah el DNA interesado y se deja de producir ese ab

- Es necesario que sea pequeo, ya que lo voy a estar manipulando y as es ms

resistente a distintos factores fsicos como la centrifugacin.

SELECCION DE VECTOR:

- Origen de replicacin adecuado

- Marcadores que permitan la seleccin
- Sitios nico de corte, deseable que estn en
uno de los dos genes marcadores
- Tamao q permita su manipulacin sin
ruptura por razones fsicas
3.- RECOMBINACIN
Etapa central del proceso. Basado en las
endonucleasas de restriccin, hay tres
tipos, I, II, III. Se juntan al DNA extrao, si
es parecido o estabilizan; si es diferente lo
eliminan. Es la seguridad de la clula para
que elementos muy extraos no se
introduzcan en su genoma (sistemas de
modificacion-restriccion).

Este sistema tiene una endonucleasa

(rompen) y una metilasa (colocan metilos en
ciertas posiciones), si no est el DNA
metilado de forma parecida, las
endonucleasas lo rompen

El I y el III no sirven en el laboratorio ya que estn integradas en un complejo multiproteico y la

ruptura del DNA se produce a partir de un punto de forma aleatoria y lo degradan

El tipo II son tiles ya que la metilasa es independiente de la endonucleasa, y porque localizan

unas secuencias especificas para cada uno y dentro de esta secuencia rompen el DNA sin
degradarlo. Sus nombres de las bacterias donde se aislaron. Pueden generan extremos romos
(cortan al segundo nivel), o extremos con colas cohesivas (no al mismo nivel, sino en diferentes
pares- corte asimtrico, quedan colas monocatenarias complementarias) esto ltimo es lo que
permiti la recombinacin.

Usar la transferasa terminal.

Cuando no puedo utilizar la misma endonucleasa de

restriccin, puedo digerir el plsmido vector con una
endonucleasa de restriccin de corte al mismo nivel y se
abre el ADN circular, en ese fragmento de ADN obtenido
por sntesis enzimtica por la PCR, lo modifico usando una
transferasa terminal, una ADN polimerasa pero q no
requiere molde, pega en los extremos de las cadena
nucletidos.
En los extremos de cada una de las cadenas pega
nucletidos al azar, si yo pego timina, he generado mi
molcula de ADN con una cola monocatenaria de timina.
Con el pasajero, cortado en extremos, lo hago reaccionar
con otro nucletido distinto; el complementario al usarlo
con otro trozo de ADN. En este caso tengo otro tipo de
molcula hbrida. Tiene ventajas sobre la tcnica anterior.
Es una enzima muy corriente que se extrae del timo de los
animales.

Usar plasmidos con un coli linker

En esos vectores de clonacin les voy a meter un fragmento de ADN conocido con el nombre de
coli linker, que contiene en un espacio muy pequeo de ADN una secuencia muy corta, contiene
secuencias de reconocimiento para decenas de endonucleasas de restriccin, con esto garantizo
poder cortar el vector en el punto que a m me interesa, por tanto va a ser muy difcil que no pueda
utilizar la endonucleasa de restriccin en el vector y en el pasajero.
4.- INTRODUCCIN DEL DNA RECOMBINANTE.
Vector y pasajero unido mediante la recombinacin in vitro, ahora hay que meterlo dentro de la
clula.

Como se introduce. Tres tipos.

- La primera deriva de la transformacin gnica. Con las bacterias que trabajamos hemos
aprendido a provocarle un estado similar al estado de competencia natural, pero artificial, para que
as se permita la entrada de molculas de ADN.

Tcnicas: choque osmtico y choque trmico.

Paso mi poblacin de clulas a un medio con una concentracin salina alta y las enfro, de manera
que permeabilizo la clula y en ese estado puedo introducir el material gentico. La eficiencia no
es muy alta, as que se ide un nuevo sistema llamado electroporacion; esta es mucho ms fcil
de llevar a cabo y es la que ms se utiliza.

Sea el mtodo que sea, nosotros conseguimos introducir en la clula el ADN fabricado en el
laboratorio, obteniendo as una clula recombinante.

Otro mtodo, complejo y que ha ido cayendo en desuso, basado en la transduccin (transporte de
genes de una clula a otra).
Voy a utilizar el virin como un sistema de transporte e inyeccin de ADN. Esto se consigue
teniendo virus efectivos (dos o tres tipos), que ninguno
de ellos sean capaces de formar una partcula viral
completa porque le faltan protenas necesarias, pero que
la suma de todos ellos formen la suma de las protenas
necesarias. Las protenas una vez completas se
autoensamblan y adems introducen dentro de la cabeza
ese material gentico, obteniendo as pseudoviriones.

Ese virin se va a comportar idnticamente igual que uno

normal, se une a la clula y va a inyectar el ADN, esta
tcnica es muy eficiente, pero es costosa de realizar por
ese motivo ha cado en desuso.

- Can de genes: consiste en disparar bolitas de

oro recubiertas de ADN a clulas. Se utiliza con
mucha frecuencia en biologa vegetal.
Este material gentico impulsado por la mquina
mediante recombinacin (no muy bien conocido)
introduce los genes en las clulas diana.
5.- DETECCIN DEL GEN.

Es fcil si hay genes reporteros.

Se utilizan metodologas que nos
permiten detectar el gen sin
necesidad de marcadores o de
reporteros

Se cultivan clulas que hemos

sometido a los procesos de
transformacin y sobre ellas ponemos
un papel de nitrocelulosa para que se
adhieran todas las colonias que han
crecido en la placa. A continuacin
sobre este papel liso las clulas con
lisozimas y detergente, dejo libre el
contenido celular, del cual me
interesa slo el ADN, como lo que
quiero detectar es un fragmento de ADN que es el que a m me interesa, lo que tengo que hacer
es desnaturalizar el ADN, es decir, calentarlo, para que se deshaga la doble hlice. Utilizo
nitrocelulosa porque a esta se adhiere muy bien el ADN y as puedo lavar y eliminar lo que no me
interesa.
Por tanto tenemos ADN de cadena sencilla adherido a la nitrocelulosa procedente de cada una de
las colonias. Vierto sobre el papel de nitrocelulosa el nuevo ADN sinttico, para que se hibride el
gen que quiero, este se tie, por tanto ya se en que colonia esta mi gen.
Se puede hacer mediante tcnicas inmunolgicas detectando el producto del gen, con una base
diferente para pegar protenas y en vez de introducir ADN hbrido tendra que introducir
anticuerpos de protenas.
Este sistema dura das, pero nos permite identificar las colonias que tienen el gen que a mi me
interesa.

Normalmente se usa e.coli como recombinantes; a partir de aqu hay tres vas fundamentales

1- Que la propia bacteria sea capaz de producir y exportar el producto del gen de forma activa,
esto ocurre con la insulina porque es una molcula sencilla. Entonces solo hay que propagar las
clulas a nivel industrial y purificar el producto

2- S lo que nos interesa obtener es un ser vivo transgnico diferente a una bacteria (planta),
entonces a partir de la bacteria que contiene el gen que nos interesa hay que disear un sistema
que nos permita transferir el gen, esto se realiza usando la capacidad q tiene una bacteria
patgena de plantas (agrobacterium thurifaciens?) que inyecta un bloque de ADN para q la planta
forme un tumor que contenga las sustancias que le interesan para vivir; nosotros cambiamos los
genes de la bacteria por los nuestros e infecto a la planta; obtenemos plantas transgnicas
(resistentes a sequias, que se rieguen con agua de mar...)

3- La bacteria no tiene capacidad de modificar la protena como lo hacen las clulas humanas, ya
que tiene que estar glicosilada; hago lo mismo que con las plantas pero con clulas humanas,
obtengo cultivos de tejido donde introduzco el gen, se produce la sntesis de la protena y su
glicosilacion, obtenemos una protena humana activa; obtenemos muchas protenas de uso
teraputico, que en clulas de bacterias no funcionaran bien.
6.- PROPAGACIN DE LA CLULA (Produccin industrial)

ADN de la clula donadora, vamos a recombinar ese vector e introducir dentro de una clula
(bacteria e.coli) y vamos a detectar nuestros recombinantes. Que podemos hacer a partir de aqu
BIOTECNOLOGA.

Hay tres vas fundamentales: la propia bacteria sea capaz de producir y exportar el producto de
ese gen de forma activa, esto es lo que ocurre con la insulina, lo nico que tenemos que hacer es
propagar las clulas de forma industrial.

A veces esto no es posible, motivos: lo que me interesa es tener un ser vivo diferente de una
bacteria si no un transgnicos (plantas); entonces a partir de esa bacteria tengo que idear un
sistema que me permita transferirlo a una planta, esto se hace mediante una bacteria patogena de
plantas (muy bien conocida, agrobacterium thurifsciens), esta es capaz de inyectar un bloque de
ADN que infecta a la planta y produce un tumor que contiene las sustancias que a ella le interesan
para vivir. Nosotros cambiamos los genes de las bacterias por los nuestros a la planta.

Otra opcin la bacteria no tiene capacidad para modificar una PT de la misma forma que lo hace
las clulas y para que la protena se activa tiene que ser glicosilada. Tengo que tener cultivo de
tejidos en los que introduzco ese gen en lo que se va a producir la sntesis de esa PT y por
supuesto la glicosilacion, esto sirve para la obtencin de una gran cantidad de PT de uso
teraputico.

Cultivo en masa para la produccin del beneficio industrial que me interesa tener. Para ver la
tecnologa de la fermentacin.
- FASES DE PROCESO FERMENTATIVO.
Un proceso fermentativo es un esquema de procesos que nos permitan un cultivo a gran escala
de los MO de utilizacin industrial. El primero de ellos es propio fermentador, es un recipiente que
nos permite desarrollar el microorganismo; tiene que cubrir los requisitos esenciales, tenemos que
garantizar que estn los nutrientes en contacto con las clulas, necesitamos aadir un sistema de
generacin, aadir precursores desde fuera a lo largo del proceso, controlar el pH y de
temperatura.
Para llevar a cabo el proceso de fermentacin necesitamos:

- Clulas que hemos obtenido y que nos interesan, estas clulas tienen que seguir unos
protocolos para que no cambien, a partir de una alcuota pequea de estas tenemos que generar
un inoculo que tenga la cantidad exacta de clulas y con una calidad contrastada

- Medio de cultivo, se suelen usar productos de desecho de la industria alimentaria (hoy da el

coste de este medio no se tiene tanto en cuenta, ya que los productos de la industria alimentaria
dificultan el ltimo proceso de purificacin)

- Cuando ya est las clulas dentro del medio, cambia sobre una semana el desarrollo-proceso
de fermentacin.

- Etapa final: purificacin.

Cuando preparo esto, obtengo un caldo de fermentacin, con dos elementos, las clulas y el
sobrenadante de cultivo. Lo primero q hay q hacer es la separacin de estos dos elementos, para
ello hay diferentes metodologas. Un vez separado, hay q tener en cuanta q nos interesa,
obtenemos las clulas. Lo habitual es q no nos interese toda la clula sino una molcula concreta,
entonces hay q discernir donde est esta molcula, en el sobrenadante o en las clulas. Si son las
clulas lo primero q hay q hacer es romper la biomasa (hay diferentes mtodos, cuando los
enzimas intracelulares son labiles-termolabiles, no puedo usar tcnicas que den calor como
sonicacion o cavitacin). Con la clula rota vuelvo a separar sobrenadante del resto.

Si nos interesa el sobrenadante tengo q purificar directamente, aqu es donde est la dificultad de
los medios con subproductos de la industria alimentaria, usamos tratamientos como extraccin
con disolventes, tamizado irregular...