DIAGNOSTICO DIFERENCIAL DE ENFERMEDADES BASADA EN REACCIN EN CADENA DE LA

POLIMERASA (PCR) Y RESTRICCIN ENZIMTICA

DIARREA EN PORCINOS
Facultad de Ciencias Farmacuticas, Bioqumicas y Biotecnolgicas, Programa Profesional de Ingeniera
Biotecnolgica, Universidad Catlica de Santa Mara, Urb. San Jos s/n, Yanahuara, Arequipa, Per.

RESUMEN

En anlisis de enfermedades en especial el diagnostico de estas con ayuda de la biotecnologa

se est volviendo comn por la eficiencia, tiempo y veracidad que demuestran los resultados.
Uno de los diagnsticos de enfermedades en animales por ejemplo la diarrea porcina se est
haciendo muy comn debido a su mejor eficiencia. En la prctica se utiliz una metodologa
basada en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), que aumenta la el nmero de ADN de
esta enfermedad luego este producto fue colocado en un gel de agarosa para realizar una
electroforesis.

Palabras clave: diagnstico de enfermedades, diarrea porcina, PCR, electroforesis, gel de

agarosa.

ABSTRACT

In analysis of diseases especially the diagnosis of these using biotechnology is becoming

common for efficiency, while demonstrating the accuracy and results. One diagnosis of
diseases in animals such as swine diarrhea is becoming very common due to their better
efficiency. In practice a method based on the chain reaction (PCR), which increases the number
of the disease DNA product was then placed in an agarose gel for electrophoresis was used.

Keywords: diagnosis of diseases, swine diarrhea, PCR, electrophoresis, agarose gel.

INTRODUCCIN
La diarrea de los cerdos jvenes es uno de vortex. Se incubo a 55 C por 1 hora despus
los principales problemas que afecta a las dela incubacin se adiciono 200ul de buffer
explotaciones porcinas, enfermedad que y se llev al vortex se incubo a 70c por
puede ser causada por muchos agentes a los 10min se adiciono 210ul de etanol se
que se asocian factores predisponentes que mezcl en vortex luego los tubos se llevaron
contribuyen a aumentar la severidad de los a centrifuga a 6000rpm por 1 min lavar el
brotes (Webster, 1981). Entre esta variada
pellet con 500ul de buffer TE dos veces, se
etiologa, las infecciones por Escherichia coli
centrifugo nuevamente a 12000rpm por 2
revisten gran importancia, jugando un
destacado papel las cepas que producen min decantar el sobrenadante se adiciono
toxina termoestable (ST) y termolbil (LT), 100ul de Tris HCl 10mM pH9. Finalmente se
como tambin las que sintetizan diferentes conservo el ADN a -20 C
tipos de verotoxinas (VT). Las dos primeras
Se utiliz la cmara de UV para generar
son enterotoxignicas (ECET) y la tercera se
condiciones estriles y preparo tubos
conoce por E. coli verotxicas (ECVT), dada
su capacidad txica para la lnea celular eppendorf colocando los reactivos segn la
Vero (Appel y col., 1989; Fairbrother, 1993). tabla1.
C C C M M M M
Las enterotoxinas actan en el intestino (+) (-) -DNA 1 2 3 4
alterando su fisiologa normal, causando un PCR 20 20 20ul 20 20 - -
incremento del contenido acuoso en el Mix ul ul ul ul
Blue - - - - - 30 30
lumen intestinal y reduciendo su absorcin,
PCR ul ul
lo que conduce a deshidratacin, acidosis e Pri 2 2 2ul 2 2 2 2
hiponatremia (Webster 1981; Gyles, 1993). mer ul ul ul ul ul ul
A su vez, las verotoxinas (VT1 y VT2, esta DNA 3 3 - 3 3 3 3
ltima incluye variantes) inhiben la sntesis ul ul ul ul ul ul
proteica en las clulas eucariticas por
inactivacin de la subunidad ribosomal 60 S,
Tabla 1. Composicin de las neutras para
por lo que se inhibe el factor de elongacin
PCR
1 (FE-1) (Takeda, 1995). Pueden causar,
tambin, diarreas con o sin hemorragias y Los 6 tubos eppendorf se llevaron al PCR,
otras cepas producen alteraciones antes se program con las siguientes
neurolgicas (Francis y col., 1989; caractersticas: 95 C por 5min, 95 C por 5
Christopher-Hennings y col., 1993).
sec, 60 C por 10 sec, todo esto para 40
ciclos.
En atencin a la importancia que revisten
estas toxinas en la patognesis de la Preparacin del gel de agarosa
colibacilosis entrica de porcinos, el
presente estudio tiene por objetivo Se pes la agarosa de acuerdo a la
investigar la capacidad de producir STa, LT y concentracin de gel a utilizar. Por ejemplo
VT por las cepas de E. coli aisladas de para preparar un gel al 1% pesar 1g de
lechones con enteriti agarosa y disolverla en 100ml de buffer TAE
1X.En la presente practica se prepar un gel
MTODOS al 1.8%

Extraccin de ADN Se traspas la agarosa pesada a un beacker

se retiro bacteria del agar sangre con un
papel filtro de 4mm aproximadamente, se
pas aun microtubo y se adiciono buffer
lisis para ser mezclado por 15 segundos en
de 50 ml se agreg la cantidad apropiada de
buffer TAE 1X luego y se mezcl en bao
mara o en una hornilla hasta el punto de
ebullicin, dejar enfriar la solucin a 40 OC
y se agreg el colorante SYBR SAFE a una
concentracin final de 0.5 ug/ml.
Posteriormente se verti la agarosa sobre
el molde conteniendo los peines y se dej
en reposo por 30min.
Preparado y cargado de la muestra
Las muestras de ADN se mezclaron con el
loading buffer 6X, excepto las muestras por
que ya tiene Blue PRC .El loading buffer
debe quedar a la concentracin de 1X. Se
cargaron 6 muestras de ADN en cada uno
de los pozos con 18ul.
empezamos la corrida electrofortica a
100V durante 40min, al finalizar la corrida
electrofortica se desconect la fuente de
poder y se retir el gel de la cmara de
electroforesis.
Finalmente se visualiz las bandas de RNA
iluminando el gel con una lmpara de luz
ultravioleta.
Anlisis por restriccin enzimtica de los
productos de PCR
Se utilizaron las siguientes enzimas de
restriccin: Hphi, BsmAI, RsaI, DdeI, AluI.

Corrida electrofortica y visualizacin de las Luego se realiz electroforesis

bandas

Se conect la fuente de poder a los

electrodos de la cmara electrofortica y

REFERENCIAS

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Cuestionario
 1. Explique qu es una prueba de PCR

En la prueba de PCR se busca amplificar un gen determinado de una enfermedad o semejanza

hereditaria, para esto se utiliza primer, enzimas, ADN.

2. Indique usos de PCR

Test de paternidad
Deteccin de enfermedades hereditarias
Clonacin de genes
Comparacin de expresin de genes
Anlisis de polimorfismos

3. Explique todo referente a tipo de PCR

PCR anidada

Tcnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificacin es utilizado como
molde para realizar una segunda amplificacin con cebadores que se ubican dentro de la
primera secuencia amplificada. Este tipo de PCR es muy especfica.

PCR Multiplex

Es un tipo de PCR en el cual se amplifica ms de una secuencia en una misma reaccin, en

este tipo de PCR se utilizan mltiples pares de primers (hasta 8) lo que da una serie de
productos, los amplificados pueden verse como mltiples bandas en un gel, este tipo de PCR
es frecuentemente usada en diagnstico mdico.

PCR in situ

Es una PCR realizada sobre preparaciones fijas sobre un portaobjetos, consiste en una
reaccin de PCR en secciones histolgicas o clulas, donde los productos generados pueden
visualizarse en el sitio de amplificacin. En la tcnica de in PCR-in situ se realiza primero
amplificacin de ADN blanco y luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional
con sondas ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequesimas de
genoma.

RT-PCR

Donde el molde inicial es ARN y se requiere de una enzima denominada transcriptasa

inversa, para realizar la conversin del ARN a un tipo de ADN llamado ADNc (ADN
complementario). Es especialmente til cuando solo se dispone de pequeas cantidades de
ARN, esta tcnica se utiliza para amplificar genes especficos

En esta PCR se requiere de dos tipos de cebadores: un cebador denominado Antisentido que
inicia la reaccin de RT-PCR y el cebador denominado Sentido (sense) que realiza el duplex
de ADNc, adems requiere una ADN polimerasa dependiente de ARN, la RT-PCR puede ser
usada para construir bibliotecas de ADNc.

PCR tiempo real

Permite cuantificar, la cantidad de ADN o ARN amplificado en cada momento. Para la
deteccin de la cantidad de ADN especfico se emplea una sonda unida a dos fluorocromos
que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse),
cuando la sonda est intacta, presentan una transferencia energtica de fluorescencia por
resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda est daada y los dos
fluorocromos estn distantes, producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN
polimerasa. Esto permite monitorear el cambio del patrn de fluorescencia y deducir el nivel
de amplificacin del gen. (The Board of Trustees of the University of South Carolina)

4. Explique sobre las enzimas de restriccin, tipos y accin.

Las enzimas de restriccin, tambin conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan
los enlaces fosfodiester del material gentico a partir de una secuencia que reconocen.Las
mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrmicas
(secuencias que se leen igual en ambas direcciones).

Son extradas de organismos procariticos (bacterias), donde actan como un mecanismo

de defensa, para degradar material gentico extrao que entre en la clula. Las bacterias
tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNA extrao y el
DNA propio. Las enzimas de restriccin no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo
afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.

Existen 3 tipos de enzimas de restriccin:

1. Tipo I y Tipo III:

a. Tienen actividad de restriccin (cortan) y modificacin (metilan).

b. Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I
cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea ro arriba o ro abajo.
Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o despes de la secuencia que reconocen.
c. Necesitan ATP para moverse a travs de la molcula de DNA, desde el
lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.

2. Tipo II:

a. Slo tienen actividad de restriccin.

b. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que
reconocen.
c. Slo requieren Mg++ como cofactor.
d. No necesitan ATP.
Aplicaciones de las enzimas de restriccin:

1. Hacer mapa de restriccin de un plsmido o bacterifago.

2. Fragmentar DNA genmico para separacin de electroforesis y Southern Blot.
3. Generacin de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en
Southerny Northern blotting.
4. Generacin de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados,
creacin de DNA recombinante.

5. Indicar que tipo de PCR pertenece al trabajo indicado

PCR multiplex o PCR simple