CURSO: TECNOLOGÍA DE LA LECHE

DOCENTE: MSC. WILLIAM HEREDIA PEÑA

PRÁCTICA DE LABORATORIO N° 05

PRUEBA DE LA REDUCTASA O REDUCTASIMETRÍA

1. OBJETIVOS:
 Evaluar la actividad enzimática y microbiana en la leche fresca de vaca.

2. CONSIDERACIONES TEORICAS:
Se ve pues, que la acidez mide el estado actual del producto, más es poco limitada
en cuanto a decirnos algo sobre la capacidad de estabilidad del mismo, o dicho de
otra manera, la acidez no puede informarnos sobre el potencial de la actividad
microbiana, que puede ser un riesgo ya que tiene la capacidad de acidificar la leche.
De allí es que se pensó en pruebas como las del azul de metileno, que permiten
evaluar la actividad enzimática microbiana y a partir de este resultado, presumir el
futuro del producto, como también muy groseramente la carga microbiana que lo
acompaña.

El principio de la prueba se basa en que los microorganismos producen una acción

reductora, que se manifiesta al producirse la decoloración de sustancias como el
azul de metileno, a 10 mL de muestra de leche y observando el tiempo de
reducción, se podría concluir que a mayor carga microbiana, el tiempo de reducción
será menor, lo que es lo mismo decir que leches con tiempo corto de reducción,
tienen un gran riesgo de deteriorarse rápidamente, aún en el caso de presentar una
acidez titulable normal. La propiedad de reducción concluida por las enzimas, no es
propiedad exclusiva de los microorganismos, sino también es propiedad de la
misma leche.

El poder reductor de la leche debe atribuirse a las enzimas o fermentos originarios

de las células libres (microorganismos, leucocitos) que pululan en su masa.

Para poder medir el poder de las células microbianas se recurre al azul de metileno,
por tener esta tintura la ventaja de no combinarse con la caseína y de ser fácilmente
absorbible por las células vivas. Se admite que la decoloración es más rápida
cuanto mayor es el número de microorganismos de la leche, sin embargo las
bacterias presentan la diferente habilidad para reducir el azul de metileno: así, el
Streptoccocus liquefaciens, los gérmenes del grupo coliaerógenes y los
microorganismos de la putrefacción (Bacillus subtilis), se muestran muy activos. Por
otra parte, la leche misma, independientemente de los microorganismos, tienen
propiedades reductoras, y uno de sus componentes, el oxígeno, que por cierto es
muy variable, influye sobre la velocidad de decoloración. Basándose en esto, se
establece que la reducción ocurre en dos tiempos:
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A. Desaparición del oxígeno a causa del desarrollo microbiano, que en este caso
corresponde a las bacterias anaerobias facultativas, que por ser muy ávidas de
oxígeno producen rápida decoloración.

B. Reducción del colorante por la leche y las células que contiene. Los ácidos
retardan la reducción, mientras que los álcalis la facilitan.

3. APARATOS E INSTRUMENTOS:

- Tubos de ensayo.

- Tapas de tubos de ensayo.

- Pipetas de 10 mL.

- Baño maría de altura suficiente para permanecer la leche de los tubos de ensayo
sumergida, en posición vertical.

- Agua destilada.

- Termómetro calibrado.

4. REACTIVOS:

- Azul de metileno.

5. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO:

- Tome 10 mL. de leche en un tubo de prueba estéril, siguiendo los cuidados de las
técnicas microbiológicas convencionales.

- Agregue 1 mL. de solución de azul de metileno dentro de cada tubo.

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- Tape y mezcle el contenido del tubo y déjelo en baño maría a 37 °C teniendo

cuidado de que el nivel de la leche esté por debajo del nivel del agua.

- Controle el tiempo a partir del momento que dejó el tubo en Baño María y observe
a intervalos regulares, pueden ser de media hora.

6. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

El tiempo de reducción hallado en la muestra analizada debe medirse en horas y

minutos.
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Según los parámetros aceptados

Grado 1 Excelente No decolora en menos de 8 horas

Grado 2 Buena Decolora de 6 a 8 horas
Grado 3 Regular Decolora entre 2 a 6 horas
Grado 4 Mala Decolora entre 20 minutos y 2 horas

Grado 5 Pésima Decolora en menos de 20 minutos

La tabla que figura a continuación de los trabajos de Barkworth y Davis en forma

parcial dan una idea y pueden servir como pauta para el juzgamiento de la leche.

Tiempo de Recuento en Tiempo de

Reducción placas Acidez titulable conservación a 18 °C
Horas Número/cc % Hasta CPH (1) horas
9 1 400 49
7–9 15 500 47
5 178 000 35
4 0,155 30
3 1 995 000 0,160 30
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2 0,165 20
1 22 400 000 0,175 20

½ 0,190 12

(1) CPH. Se llama a la prueba de coagulación por hervido, que se hace poniendo 5
mL de leche en un tubo y se lleva a baño maría hirviendo durante 5 minutos, luego
se observa, si la leche se coagula, indica para el caso el término del tiempo de
conservación del producto.

Otra tabla tomada de Rossel y Dos Santos con la misma reserva que la anterior,
más o menos dice lo mismo y clasifica la leche como sigue:

Calidad de la leche Tiempo de Recuento en Conservación

reducción placas
Muy mala De 0,5 a 1 hora 5 millones a más De 15 a 22 horas
Mala De 2 a 3,3 horas De 700 000 a 5 De 14 a más horas
millones
Buena De 4 a 5,4 horas De 200 000 a 700 De 23 a 32 horas
000
Muy buena De 6 horas a más Hasta 200 000 Más de 32 horas

DISCUSIÓN: De acuerdo a la tabla que establece las características de la leche,

los 15.3°D hallados, señala que la leche esta en esta normal. Pero al no haber sido
transportada en las condiciones adecuadas se presume que está adulterada con
agua.
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7. CONCLUSION
A lo largo de este objeto de aprendizaje se ha descrito el método para la realización
de la prueba de la decoloración del colorante azul de metileno o prueba de la
reductasa bacteriana. Esta prueba resulta muy útil a la hora en la industria láctea
puesto que la velocidad a la que se produce el cambio de color del indicador azul de
metileno es directamente proporcional al número de gérmenes presentes. De esta
manera se puede determinar de manera indirecta la calidad higiénica de la leche.

8. CUESTIONARIO:

- ¿Cuáles son los requisitos Microbiológicos establecidos por las NTP para la
leche y los siguientes productos lácteos: quesos, yogurt, leche en polvo y
helados?

LECHE CRUDA DESTINADA A TRANSFORMACIÓN

QUESO FRESCO
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OGURT
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LECHE EN POLVO

(Ministerio de Salud del Perú, 2010)

- Existe algún método que sustituya la prueba de la reductasa?, descríbalo.

PRUEBA DEL ALCOHOL

Cuando se añade a la leche una cierta cantidad de alcohol etílico se produce una
deshidratación, parcial o total, de ciertos coloides hidrófilos, que puede desembocar en su
desnaturalización, y con ello a la pérdida de su equilibrio y floculación.

Este resultado sólo se alcanza con un cierto grado alcohólico de la mezcla final, por
debajo del cual las leches térmicamente estables no floculan, mientras que la leche
anormal, esto es la térmicamente inestable, flocula. Todo sucede como si existiera un
paralelismo entre la resistencia al calentamiento y la estabilidad en presencia del alcohol.
Es posible, por consiguiente, traducir en grado alcohólico la resistencia necesaria a un
procedimiento dado de calentamiento. Por lo que todas las leches estables en presencia
de esta cantidad de alcohol resistirán el calentamiento correspondiente.
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Basándose en este principio se ha ideado un método simple de control o de selección,

que consiste en mezclar de golpe volúmenes iguales de leche cruda y de una solución
acuosa de alcohol etílico de concentración conocida. La elección de esta última varía
según la modalidad de calentamiento (pasterización, esterilización, etc.) a que ha de
someterse la leche. La mezcla se agita en frío y se observa, preferentemente después de
haberla extendido sobre una superficie de color oscuro o negra. Si no se produce
floculación alguna, la leche resistirá perfectamente el calentamiento correspondiente al
grado de la solución alcohólica.

Si se observa floculación, la leche no se mantendrá estable durante el calentamiento. La

concentración de la solución alcohólica, generalmente fijada a 68% cuando se ensayan
leches para la pasterización, y debe elevarse hasta 72° o más (a veces hasta 74°) cuando
se trata de seleccionar leches para la esterilización. La mayor frecuencia de reacciones
positivas con leche normal, excluye el empleo de etanol más concentrado para realizar
esta prueba.

PRUEBA DEL SEDIMENTO:

El sedimento obtenido por el método de lactofiltración mide la calidad sanitaria. La

presencia de abundante partículas de sucio y su tipo (heces, insectos, tierra, restos de
alimentos), puede indicar el cuidado que se ha tenido durante el ordeño y
almacenamiento de la leche cruda.

TEMPERATURA:

La determinación de la temperatura en la recepción muestra el cuidado que se haya

podido tener durante el transporte y almacenamiento de la leche. Sin embargo una leche
que se encuentre la temperatura óptima de refrigeración (4-5 ºC) no confirma que sea de
buena calidad, ya que es posible que durante las fases que están desde el sitio de
producción hasta la industria la misma haya sufrido fluctuaciones de temperaturas que
hayan permitido la multiplicación microbiana.

LACTOFERMENTACIÓN

Esta prueba permite observar las características del coagulo obtenido de la fermentación
de una muestra de leche incubada a temperatura ambiente (35-37 ºC) por 24 horas.
Según las características observadas se puede presumir acerca del tipo de bacterias
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predominantes, ya que un coagulo homogéneo sin o con pequeñas burbujas de gas,

indicara predominio de bacterias lácticas homofermentativas, por el contrario un coagulo
grumoso con abundante gas puede indicar la presencia de bacterias coliformes.

ACIDEZ TITULABLE Y pH

Ya se ha estudiado estas dos propiedades de la leche en el tema de físico químico. Está

claro que la fermentación microbiana modifica estos valores, aumentando la acidez y
reduciendo el pH. Sin embargo hay que tener en cuenta que ciertos microorganismos
proteolíticos pueden causar la coagulación dulce de la leche, es decir, sin acidez o con
alcalinización de la leche.

9. BIBLIOGRAFÍA

HARRIGAN, W. (1992). Métodos de Laboratorio en Microbiología de los alimentos y productos.

Lácteos. 3ra Edición. Editorial Acribia. Zaragoza

Ministerio de Salud. (2004). Norma técnica peruana para la leche y productos lácteos. Yogurt o
requisitos – NTP 202.9092-2004 (CODEX). Peru.

Ministerio de Salud del Perú. (2010). Reglamento de la Leche y productos lácteos. Peru.

10. ANEXO

FUNDAMENTO BIOQUÍMICO DE LA PRUEBA DE LA DECOLORACIÓN DEL AZUL DE

METILENO

El verdadero principio para que el azul de metileno se descolore es lo siguiente: el

potencial de óxido-reducción (Eh) de la fresca aireada es de +0,35 a + 0,40 voltios (350 a
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450 milivoltios), el cual se debe se debe principalmente al contenido de oxígeno disuelto

en el producto. Si por cualquier causa ese oxígeno es separado, el Eh disminuye

Esto ocurre cuando los microorganismos crecen en la leche y disminuyen el oxígeno. Si el

número de microorganismos es muy elevado, el consumo de oxígeno será muy elevado y
por consiguiente el Eh caerá rápidamente; si por lo contrario los microorganismos son
pocos, el Eh disminuirá lentamente.

Permite teñir el interior celular. Tiñe microorganismos procarióticos (vivos o muertos). Los
eucarióticos sólo se tiñen si están muertos. Algunas estructuras, como los corpúsculos
metacromáticos, se tiñen más intensamente con este colorante que el resto de la célula.