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LABORATORIO AGRICOLA CERRO PRIETO

17-03-2017

Capacitación en producción de Galleria Mellonella y de nematodos


entomopatogenos: Heteroradhitis bacteriospora y Steirnema sp en INIA-Chiclayo

OBJETIVOS GENERALES:
 Conocer la producción de Galleria Mellonella y de nematodos entompotogenos
en el Instituto De Investigación Agrícola (INIA) –Chiclayo.

OBJETIVOS ESPECIFICOS:
 Observar y aprender las condiciones en que se producen la producción de G.
mellonella y nematodos entomopatogenos.
 Conocer el efecto de Heterorhabditis bacteriophora sobre prepupas y pupas de
Spodoptera frugiperda.
 Determinar la dosis de NEP’s/ml de Heterorhabditis bacteriophora más eficiente
en el control de las larvas de Spodoptera frugiperda.
 Determinar el estadio de Spodoptera frugiperda más susceptible a
Heterorhabditis bacteriophora.
 Determinar el porcentaje de mortalidad de prepupas y pupas de Spodoptera
frugiperda, en condiciones de laboratorio.

1. CRIANZA DE Galleria mellonella


1.1. ETAPA DE EXTRACION DE HUEVOS

El proceso se inicia en un recipiente de 3.5 L de capacidad cubierta con una


tela poliseda agujereada más papel bond sobre este, en el interior del
recipiente se colocan aproximadamente unos 300 pupas de G. mellonella en
la que se espera la emergencia de los adultos por un periodo de diez días,
pasado este tiempo se revisa diariamente cada 24 horas la presencia de
posturas sobre la hoja bond por un periodo de 25 días hasta que ya no se
observe posturas.
1.2. RECOLECTA DE POSTURAS

De las hojas bond con presencia de posturas se recorta con una tijera y se le
coloca en un recipiente de 500 cc de capacidad, se les etiqueta y se espera
por un periodo de incubación de 7 días.
1.3. ALIMENTACION DE LAS LARVAS DE G. mellonella

1.3.1. DIETA GENERAL

En un balde de 20 L de capacidad se vertió:


- 3 Kg Ricocan
- 1 Litro de miel de abeja

Se le remueve hasta que este tenga una consistencia granulosa y cuidando de que
no esté muy pegajosa por la miel.

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1.4. DIETA PARA EL PRIMER ESTADIO

Pasado los 7 días de incubación se coloca en un recipiente de 3.5L de


capacidad y se divide en tres capas, la capa inferior y superior se coloca
70 g de polen y en la capa intermedia 300 gr de dieta general, sobre la
capa superior se coloca las posturas de G. mellonella y se espera 10
días para realizar un recambio en las siguiente dieta.

1.5. DIETA PARA EL SEGUNDO HASTA EL ÚLTIMO ESTADIO:

Pasado los 10 días de la primera dieta se procede al recambio y


renovación de recipiente y se coloca las larvas en recipiente de 3.5 L en
la que solo contiene 250 g de dieta general y se les mantiene durante
20 días renovando cada 10 días dicha dieta.

1.6. SELECCION DE LARVAS

Terminado los 20 días, se selecciona aproximado el 50 % de larvas por


recipiente donde la mitad es para parasitación de nematodos y la otra
mitad se le mantiene para la recría esperando por 10 días hasta la
obtención de pupas y nuevamente iniciar la etapa de recolección de
huevos.

2. PRODUCCION DE NEMATODOS ENTOMOPATOGENOS (NEP’s)

2.1. ETAPA DE PARASITACION

En un recipiente plástico de 250 cc se colocan 25 larvas vivas de 5to


estadio de G. mellonella, y con ayuda de una jeringa de 20 ml se inyecta
5 ml de solución liquida de nematodos a una dosis de 35 NEP’s/ larva,
luego se incuba en un ambiente totalmente oscuro por un periodo de 8
días.

2.2. ETAPA DE VERIFICACION DE PARASITACION

Luego de parasitar se evalúa a las 48 horas, si las larvas de G.


mellonella fueron muertas o no. Determinándose por el color rojo oscuro
indicando que estas están muertas por acción de los NEP’s.

2.3. ETAPA DE PRE-COSECHA

Pasadas las 48 horas las larvas de G. mellonella se evalúa la


parasitación , estas serán colocadas dentro de un recipiente de cinco
litros con un soporte de malla plástica donde se colocara 50 ml de agua
destilada sobre la base para mantener la humedad , se renovara
constantemente el líquido para evitar la desecación todo este proceso
dura ocho días . Pasado este periodo se iniciara la cosecha.

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2.4. ETAPA DE COSECHA.

Pasado el octavo día se observa una mancha color amarillo oscuro, esto
indica la presencia de nematodos, observado esto, se iniciara la primera
cosecha, con una jeringa de 20 ml se inyecta agua destilada (A.D) a la
malla sobre la mancha amarilla desprendiéndose los nematodos al fondo
del recipiente, la solución obtenida se ubica en un recipiente estéril y se
guardara a 25 °C±1 con una humedad relativa 70%±1.
Este mismo procedimiento se realizara por cuatro días luego se descarta
para evitar el paso de nematodos adultos, la solución madre se conserva
por siete días aproximadamente.

2.5. DETERMINACION DEL N° DE NEMATODOS DE LA SOLUCION


MADRE OBTENIDA.

Se toma una alícuota de 0.1 ml de la solución madre previamente


obteniendo el volumen total del líquido cosechado y se coloca en una
placa de conteo de cinco centímetros de diámetro, y se afora a 2.0ml
luego se observa al estéreo a un aumento de 5X, se cuenta solo
nematodos juveniles y activos, del número determinado de la alícuota se
le multiplica por el volumen total y luego se le divide en 0.1 ml,
obteniéndose el número de NEP's que contiene la solución madre.

3. DETERMINACION DE PATOGENICIDAD EN Spodoptera frugiperda

Para la instalación del ensayo se consistió en 5 tratamientos de 0, 6000 ,


8000 , 10000 ,12000 NEP’S/ ml, la unidad experimental estuvo
conformado por un tarpers hermético de 200 cm2, para el primer grupo
colocándose en la base papel toalla y se agregó 6 pre-pupas de
Spodoptera frugiperda y para el segundo grupo se agregó 4 pupas de S.
frugiperda en 100 g de tierra esterilizada en estufa a 120 ° C por 2 horas,
las concentraciones deseadas fueron diluidas en 4 ml y 20 ml de A.D.
para el primer y segundo grupo respectivamente e inyectadas con ayuda
de una jeringa de 20 ml de capacidad. Luego fueron colocados dentro de
un espacio oscuro y mantenidos a una temperatura ambiente de 24°C.
Se registraron el número de individuos muertos a las 48 horas.

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4. RESULTADOS

Para confirmar la muerte de las larvas por acción de los nematodos, las cuales
Se consideró las larvas parasitadas aquellas que presenten apariencia flácida y
cambien a color café o rojo ladrillo, purpura o naranja, luego se procedió a
diseccionarlas y examinarlas bajo el estereoscopio. Obteniéndose los
siguientes datos.

Tabla 1 Control de pre-pupas


TRATAMIENTO DOSIS NO PARASITADASPARASITADAS TOTAL CONTROL
T1 6000 NEPs/4 ml 0 6 6 100%
T2 8000 NEPs/4 ml 2 4 6 67%
T3 10000 NEPs/4.6 ml 2 4 6 67%
T4 12000 NEPs/6 ml 3 3 6 50%
G
rafica 1 Control de pupas

Se evidencia un excelente control a la menor dosis de 6000 NEP´s, sin


embargo al aumentar el volumen de dilución en el recipiente de 200 cc,
provoca la muerte de estas larvas por exceso de humedad.

Tabla 2 Control de pupas


TRATAMIENTO DOSIS NO PARASITADAS
PARASITADAS
TOTAL CONTROL
T1 6000 NEPs/20 ml 3 1 4 25%
T2 8000 NEPs/20 ml 2 2 4 50%
T3 10000 NEPs/20 ml 3 1 4 25%
T4 12000 NEPs/20 ml 3 0 3 0%

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Grafica 2 Control de pupas

Se observa una baja efectividad a nivel pupal, esto debió haber ocurrido porque el
sustrato (tierra) no contuvo cierto grado de humedad necesaria para la movilidad de
los NEP’s. Se consideraría repetir el ensayo con arena húmeda para descartar esta
hipótesis.

CONCLUSIONES
 Las dosis administradas son correctas, sin embargo se debería manejar la
cantidad de agua en las diluciones.

 De acuerdo a este ensayo la mayor efectividad se presenta a nivel prepupal ,


posiblemente debido a que en este estadio, presenta la cutícula mas blanda
que en el estadio pupal en la que la cutícula esta mas esclerotizada o dura.

 También se debería realizar otra prueba de patogenicidad a menor dosis que la


este ensayo, para determinar la dosis letal media para Spodoptera frugriperda.

 En cuanto al sustrato utilizado, se consideraría utilizar arena húmeda ya está


retiene mas la humedad.

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ANEXOS

CRIANZA DE Galleria mellonella

1- ETAPA DE EXTRACION DE HUEVOS

Fig. 1 Recipiente conteniendo los adultos

2- RECOLECTA DE POSTURAS
3-

Fig. 2 Papel recortado conteniendo posturas. Fig. 3 Posturas adheridas al papel

4- ALIMENTACION DE LAS LARVAS DE G. mellonella


DIETA GENERAL

Fig. 4 Mezcla de miel con ricocan Fig.6 Homogenización de la dieta

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Fig. 6 Repartición de la dieta en recipientes

5- DIETA PARA EL PRIMER ESTADIO

Fig. 7 Colocación de las posturas

6- DIETA PARA EL SEGUNDO HASTA EL ÚLTIMO ESTADIO:

Fig. 8 Etiquetado de recipiente Fig. 9 Observación de las larvas de 2 estadio

E.BAUTISTA/M.NORIEGA 7
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7- SELECCION DE LARVAS

Fig. 9 Cosecha general de larvas y pupas Fig. 10 Selección de larvas de 5 estadio

Fig. 11 Selección de pupas Fig. 12 Ambientación de adultos

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PRODUCCION DE NEMATODOS ENTOMOPATOGENOS (NEP’s)

1. ETAPA DE PARASITACION

Fig. 13 Inoculación de NEP´S

2. ETAPA DE VERIFICACION

Fig. 14 Coloración característica de infestación

3. ETAPA DE PRE-COSECHA

Fig. 15 Colocación en trampas White

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4. ETAPA DE COSECHA.

Fig. 16 Extracción de NEP´s Fig. 17 Colocación en trampas White

Fig. 18 Ambientación de la solución madre

DETERMINACION DEL N° DE NEMATODOS DE LA SOLUCION MADRE


OBTENIDA.

Fig. 18 inyección de alícuota de la sol .madre Fig. 19 Conteo de nematodos

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DETERMINACION DE PATOGENICIDAD EN Spodoptera frugiperda

Fig. 20 Selección de pupas Fig. 21 Inoculación de NEP’s en pupas

Fig. 22 Selección de pre-pupas Fig. 23 Inoculación de NEP’s en pre-pupa

5. RESULTADOS

Fig. 24 Acondicionamiento del ensayo Fig. 25 Evaluación

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Fig. 26 Observación de NEP’s v. macroscópica Fig. 27 vista Observación de NEP’s .Estéreo 8X

Fig. 27 Observación de NEP’s v. macroscópica Fig. 28 vista Observación de NEP’s .Estéreo 8X

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